磺胺類抗生素對根際微域土壤酶活性的影響

李亞寧，盛紅坤,王斌，吳鵬，高相艷，劉培翔

(1.南開大學濱海學院 環(huán)境科學與工程系，天津 300270；2.南開大學 化學學院，天津 300071；3.天津市北大港濕地自然保護區(qū)管理中心，天津 300270)

禽畜養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的抗生素濫用，導致抗生素隨動物糞肥進入農(nóng)田土壤環(huán)境，并在土壤中積累[1-3]。其中磺胺類抗生素(SAs)在農(nóng)田土壤中檢出率較高，同時也是含量較高的[4-5]。植物根際是植物根系、土壤、微生物緊密結(jié)合的獨特微環(huán)境區(qū)域[6-9]。由于植物根系的作用，其性質(zhì)與遠離根際區(qū)域的土壤差異顯著，尤其是當污染物脅迫的情況下，根系分泌物中的碳源和能源顯著增加，微生物量和活性亦顯著增強，進而影響根際微域土壤酶的活性[10-14]。

土壤酶是土壤的活躍有機組分，在土壤環(huán)境中起到重要的催化作用，其活性高低可表征污染物降解能力及土壤環(huán)境質(zhì)量等[15-17]。因此，本文選用土壤脫氫酶(DHA)和過氧化氫酶(CAT)作為評價指標，通過多隔層根際箱實驗研究磺胺甲惡唑(SMZ)和磺胺甲基嘧啶(SM1)在植物根際微環(huán)境中對土壤酶活性的作用。以期為土壤環(huán)境污染風險評價及對人類可能產(chǎn)生的暴露風險提供科學指導依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶均為優(yōu)級純，純度均為98%;供試土壤,采自天津植物園未污染地塊(取0～20 cm表層土壤);供試植物為油菜(Brassicacampestris)，種子由天津黃瓜研究所提供。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計;Hettich 32R低溫高速冷凍離心機。

1.2 實驗方法

實驗采用多隔層根際箱法[18]，每個根際箱長20 cm，寬20 cm，高10 cm。根際箱共有11個分區(qū)，分別為中心區(qū)(R)，左、右近根1區(qū)(NR1)，左、右近根2區(qū)(NR2)，左、右近主體土壤1區(qū)(NB1)，左、右近主體土壤2區(qū)(NB2)，左、右主體土壤區(qū)(B)，每個分區(qū)間以尼龍網(wǎng)相隔。尼龍網(wǎng)可避免中心區(qū)根組織生長時透過進入相鄰區(qū)域，但可確保根系分泌物、微生物、水分、營養(yǎng)等的遷移。供試土壤風干后，過篩(2 mm)。將SMZ或SM1與土壤充分混勻，使最終染毒濃度為15.0,45.0 mg/kg。每個根際箱加入土壤2.5 kg。

油菜種子于25 ℃下催芽培養(yǎng)后，挑選大小均一的幼苗移入不同染毒組的根際箱中進行培養(yǎng)，共設置4個處理組，每個處理組重復2次。第1、2個處理組為低濃度抗生素染毒組，分別為15.0 mg/kg SMZ與SM1；第3、4個處理組為高濃度抗生素染毒組，分別為45.0 mg/kg SMZ與SM1。同時設置空白對照。培養(yǎng)2個月后，開箱，取出各層隔板，并將左、右對應的同一分區(qū)土壤樣品混勻，測定各區(qū)的土壤DHA與CAT活性。

1.3 土壤酶活性測定

土壤DHA活性的測定采用2,3,5-三苯基四唑氯化物顯色法(TTC法)[19]；土壤CAT活性的測定采用硫酸鈦比色法[19]。

1.4 統(tǒng)計分析

本實驗采用Origin 8.5進行繪圖，并用SPSS統(tǒng)計軟件對組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，顯著差異水平P取0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 SAs對油菜根際微域土壤DHA活性的影響

2.1.1 SMZ對油菜根際微域土壤DHA活性的影響 SMZ脅迫下，油菜根際微域土壤DHA活性變化見圖1。

圖1 SMZ對油菜根際微域土壤DHA活性的影響Fig.1 Effects of SMZ on the activity of DHA in rape planted rhizosphere soil**P<0.01或*P<0.05為處理組與對照組進行比較

由圖1可知，低濃度與高濃度SMZ處理組中，油菜根際DHA活性的變化趨勢基本一致，首先近根2區(qū)NR2的DHA活性最高，其次為近根1區(qū)NR1，再次為中心區(qū)R，然后是近主體土壤1區(qū)NB1和2區(qū)NB2，最后是主體土壤區(qū)B。同時，對R和NR1區(qū)而言，低濃度處理組促進了DHA的活性，高濃度處理組抑制了DHA的活性。對NB1、NB2和B區(qū)而言，無論低濃度還是高濃度處理組，均對DHA的活性起到了抑制作用。而無論低濃度還是高濃度SMZ脅迫，均顯著(P<0.05)誘導了NR2區(qū)的DHA活性。除NR2區(qū)外，45 mg/kg SMZ脅迫下，各分區(qū)土壤的DHA活性均顯著(P<0.05)低于15 mg/kg SMZ處理組，表明隨著染毒濃度增加，DHA活性降低。

2.1.2 SMI對油菜根際微域土壤DHA活性的影響 圖2顯示了SM1脅迫對油菜根際微域土壤DHA活性的影響。

由圖2可知，首先無論低濃度還是高濃度SM1處理組，均為NR2的DHA活性最高，NR1區(qū)次之，再者是R區(qū)，然后分別是NB1、NB2和B區(qū)。同時對NR1和NR2區(qū)而言，無論低濃度還是高濃度SM1脅迫，均誘導了DHA的活性，而對R區(qū)而言，低濃度處理組極顯著(P<0.001)抑制了DHA的活性，而高濃度處理組DHA活性與對照相較，無顯著(P>0.05)差異。對NB1、NB2和B區(qū)而言，低濃度處理組對DHA的活性起到極顯著(P<0.01)抑制作用，高濃度處理組則對DHA的活性起到顯著(P<0.05)抑制作用。除NR1與NR2區(qū)外，45 mg/kg SM1脅迫下，各分區(qū)土壤的DHA活性均顯著(P<0.05)高于15 mg/kg SM1處理組，表明隨著染毒濃度增加，DHA活性升高。

圖2 SM1對油菜根際微域土壤DHA活性的影響Fig.2 Effects of SM1 on the activity of DHA in rape planted rhizosphere soil**P<0.01或*P<0.05為處理組與對照組進行比較

2.2 SAs對油菜根際微域土壤CAT活性的影響

2.2.1 SMZ對油菜根際微域土壤CAT活性的影響 SMZ脅迫下，油菜根際微域土壤CAT活性變化見圖3。

圖3 SMZ對油菜根際微域土壤CAT活性的影響Fig.3 Effects of SMZ on the activity of CAT in rape planted rhizosphere soil**P<0.01或*P<0.05為處理組與對照組進行比較

由圖3可知，無論低濃度還是高濃度SMZ處理組，均為NR2的CAT活性最高，NR1區(qū)次之，再者是R區(qū)，接下來分別是NB1、NB2和B區(qū)。同時，對R、 NR1和NR2區(qū)而言，無論低濃度還是高濃度處理組，均促進了CAT的活性，而對NB1而言，為低濃度處理組促進了CAT的活性，高濃度處理組抑制了CAT的活性。對NB2和B區(qū)而言，無論低濃度還是高濃度處理組，均對CAT的活性起到了抑制作用。同時，隨染毒濃度增加，各區(qū)CAT活性均顯著(P<0.05)降低。

2.2.2 SM1對油菜根際微域土壤CAT活性的影響 圖4為SM1脅迫下，油菜根際微域土壤CAT活性的變化。

圖4 SM1對油菜根際微域土壤CAT活性的影響Fig.4 Effects of SM1 on the activity of CAT in rape planted rhizosphere soil**P<0.01或*P<0.05為處理組與對照組進行比較

由圖4可知，無論低濃度還是高濃度SM1處理組，油菜根際CAT的活性均為NR2區(qū)最高，接下來依次是NR1區(qū)、R區(qū)、NB1、NB2和B區(qū)。同時，無論低濃度還是高濃度SM1處理組，幾乎都對各區(qū)的CAT活性起到了誘導作用，在NR2、NR1和R區(qū)，更是起到了極顯著(P<0.01)誘導作用。并且，隨染毒濃度增加，各區(qū)CAT活性均顯著(P<0.05)降低。

2.3 SAs污染對油菜根際微域土壤DHA及CAT活性影響的總體分析

不同種類酶對不同種類磺胺類抗生素的響應不同，但整體上土壤酶活性均為在左、右近根2區(qū)，即NR2區(qū)的響應值最高，其次為左、右近根1區(qū)即NR1，再次為中心區(qū)即R區(qū)，然后再隨著與植物根際距離的加大，土壤酶活性逐漸降低，依次為左、右近主體土壤1區(qū)(NB1)，左、右近主體土壤2區(qū)(NB2)和左、右主體土壤區(qū)(B)。在以前的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果，在重金屬污染物Cd的污染作用下，大豆近根際區(qū)域的土壤酶活性要高于中央?yún)^(qū)域和遠根際區(qū)域[14]。在研究土霉素在小麥根際的微生態(tài)效應時，也發(fā)現(xiàn)小麥煙農(nóng)21和核優(yōu)1號根際區(qū)域的過氧化氫酶等土壤酶活性高于遠離根際的區(qū)域[20]。在植物根際環(huán)境中，植物根系及各種微生物會不斷向土壤中釋放各種酶，即所謂的土壤酶，從而通過其作用將根際中的污染物進行分解代謝，近根際區(qū)域的土壤酶活性較高，說明在某種層面上此區(qū)域較適合于污染物的降解[21-22]。同時，土壤酶活性的變化可以在一定程度上反應土壤受污染的程度。李明珠等在進行銅脅迫下磺胺嘧啶對土壤呼吸及酶活性影響的分析時，發(fā)現(xiàn)土壤脫氫酶對SDZ單一及其與Cu復合污染都較為敏感，在整個實驗培養(yǎng)期內(nèi)，各污染處理中其活性均受到了顯著的抑制[23]。這與本研究結(jié)果相似，在磺胺甲惡唑與磺胺甲基嘧啶脅迫下，除近根際區(qū)域外，其余區(qū)域的土壤脫氫酶活性均被抑制，且距離根區(qū)越遠，抑制程度越顯著。在進行的一項關于土壤CO2濃度對土壤酶活性影響的研究中發(fā)現(xiàn)隨CO2濃度升高，玉米、豌豆和黑麥草根際土壤脫氫酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢[24]。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，隨著抗生素染毒劑量的增加，脫氫酶活性降低，尤其是遠根際區(qū)域，脫氫酶活性逐漸轉(zhuǎn)為抑制。脫氫酶活性降低說明細菌生物量等微生物活性下降，高濃度的抗生素對微生物活性產(chǎn)生了抑制作用。同時，在本研究中磺胺類抗生素對土壤過氧化氫酶活性呈現(xiàn)較為明顯的誘導作用，這可能是由于抗生素染毒濃度尚在植物可調(diào)節(jié)的閾值范圍內(nèi)，酶活性的誘導會使生物呼吸過程中的過氧化氫分解及物質(zhì)代謝等過程受到促進，進而使得土壤的代謝能力和對有機物的分解能力大大增強，是植物體保護自身的一種機制。

3 結(jié)論

(1)SMZ脅迫下，低濃度處理組促進了根際及近根際區(qū)的DHA活性，而高濃度處理組則抑制了R和NR1的DHA活性。同時，各濃度處理組均抑制了主體土壤區(qū)及近主體土壤區(qū)中DHA的活性。同時，隨著染毒濃度增加，DHA活性降低。

(2)SM1脅迫下，各濃度處理組均誘導了近根際區(qū)的DHA活性，卻抑制了R區(qū)的DHA活性。在主體土壤區(qū)及近主體土壤區(qū)中，各濃度處理組均對DHA的活性起到抑制作用。同時，隨著染毒濃度增加，DHA活性升高。

(3)SMZ脅迫下，各濃度處理組均誘導了根際及近根際區(qū)的CAT活性。低濃度處理組誘導了NB1的CAT的活性，而高濃度抑制了該區(qū)的CAT活性。在NB2和B區(qū)中，各濃度處理組均對CAT的活性起到了抑制作用。同時，隨染毒濃度增加，各區(qū)CAT活性均顯著(P<0.05)降低。

(4)SM1脅迫下，各濃度處理組幾乎均對各微域分區(qū)的CAT活性起到了誘導作用，在根際及近根際區(qū)更是起到了極顯著誘導作用。并且，隨染毒濃度增加，各區(qū)CAT活性均顯著降低。

(5)兩種土壤酶對兩種磺胺類抗生素的響應雖不同，但整體上土壤酶活性均為NR2區(qū) > NR1區(qū) > R區(qū) > NB1區(qū) > NB2區(qū) > B區(qū)，并不是簡單的隨距離增加呈遞減趨勢。