基于超支化聚硫醚構建非水相生物黏合劑

張一帆，柏廣行，李小杰，劉曉亞

（江南大學化學與材料工程學院，合成與生物膠體教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

生物黏合劑是一種可用于止血、閉合傷口、黏結組織以及固定體內植入物的醫(yī)用材料。不同于傳統(tǒng)縫合的方法，生物黏合劑通過表面黏結的方式將組織連接起來。生物黏合劑易于使用，不損傷傷口周圍組織，密封效果更好，適用范圍更廣[1,2]。生物黏合劑在醫(yī)學領域具有非常廣闊的應用前景，但市場上的生物黏合劑存在黏合性能差或生物毒性的缺點[3,4]。因此，開發(fā)具有優(yōu)異的黏合性能以及良好生物相容性的生物黏合劑一直是研究人員所追尋的目標。目前，將聚合物分散在水中形成水溶液是制備生物黏合劑的主要方法。這種水相黏合劑具有良好的生物相容性，能夠潤濕傷口部位，有助于傷口愈合[5-7]。然而，聚合物水溶液在注射時容易分散到水環(huán)境中，無法凝膠化；且親水性聚合物鏈上的水合層會阻礙大分子鏈與組織表面產生相互作用[8]。此外，水相黏合劑在體液中會吸水膨脹，不僅可能壓迫周圍組織，還會造成黏合性能下降[9]。因此，構建具有良好水下黏合性能的生物黏合劑是目前研究人員所面臨的挑戰(zhàn)之一。

近年來，越來越多的研究論證了黏合劑的疏水性對實現(xiàn)水下黏結的重要性[10,11]，如：在自然界中，沙堡蠕蟲通過聚電解質絮凝形成水不溶的絮凝體，進而在水環(huán)境中潤濕、黏結物體[8]。受此啟發(fā)，有研究人員合成了一種液態(tài)疏水聚酯材料，并以此作為非水相生物黏合劑[11,12]。這種黏合劑可以直接在水和血液中黏結皮膚、血管等組織，具有廣闊的應用前景。迄今為止，這種非水相生物黏合劑體系屈指可數(shù)，這是因為在不使用有機溶劑情況下很難獲得液態(tài)疏水黏合劑。針對這一問題，具有弱鏈纏結、不結晶特點的超支化聚合物使構建高分子量、低黏度的液態(tài)黏合劑成為可能[13]。如Lang等[12]通過丙三醇和葵二酸的縮聚反應制備了超支化聚酯，并進一步使用丙烯酰氯改性得到可光固化的水下聚酯黏合劑。Cui等[14]則通過多巴胺與聚乙二醇二丙烯酸酯之間的邁克爾加成反應合成了具有疏水主鏈、鄰苯二酚側基的液態(tài)超支化聚合物，并以此作為水絮凝固化的生物黏合劑。合理設計超支化聚合物的結構，從而構建具有水下黏合性能的非水相生物黏合劑是目前該領域的一個研究熱點。

本文以疏水的超支化聚合物為基體材料構建了一種能在水中黏合組織的非水相生物黏合劑。通過硫醇-（甲基）丙烯酸酯邁克爾加成反應合成了一種富含硫醇基團的液態(tài)超支化聚硫醚（HBP），然后將HBP和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）混合制備了非水相生物黏合劑（圖1），并探究了PEGDA的添加量對黏合劑的固化時間、彈性模量、水下黏合強度、溶脹行為、降解行為以及細胞毒性等的影響。

圖1 基于超支化聚硫醚的非水相黏合劑的制備示意圖Fig.1 Schematic illustration of the design of the hyperbranched polymer based non-aqueous adhesive

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

2-（丙烯酰氧基）乙基甲基丙烯酸酯（AA'）根據(jù)參考文獻[15]合成；三羥甲基丙烷三（3-巰基丙酸酯）（B3）、PEGDA（Mn=700）：化學純，西格瑪-奧德里奇（上海）貿易有限公司；纖維蛋白膠（Fibrin glue）：生物基，中國華蘭生物科技有限公司；氰基丙烯酸酯（CA）：生物級，中國福樂愛生物科技有限公司；小鼠層纖維細胞（L929）：北京北納生物科技有限公司；磷酸緩沖液（PBS，pH=7.4）：生物級，美國賽默飛世爾科技公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二乙酸熒光素（FDA）：化學純，無錫特達生物技術有限公司；其他有機溶劑、無機鹽類：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 測試與表征

多角度激光光散射-凝膠滲透色譜-示差黏度儀三聯(lián)用系統(tǒng)（美國懷雅特技術公司DAWN HELEOS II System）：流動相為含有1%（質量分數(shù)）溴化鋰的N'，N-二甲基甲酰胺，聚合物質量濃度為10 mg/mL；核磁共振儀（瑞士布魯克公司Bruker AV400M）：溶劑為氘代氯仿；差示掃描量熱儀（DSC，德國耐馳儀器制造有限公司NETZSCH 204 F1）：升、降溫速率10℃/min;旋轉流變儀（美國TA儀器公司Discovery DHR-2）：溫度為25℃，應變?yōu)?%，剪切頻率范圍為0.1～100 Hz，剪切速率0.1～100 s?1；萬能拉伸儀（上海辰華儀器有限公司1 185）：拉升速率為5 mm/min；正置熒光顯微鏡（日本尼康株式會社Nikon 80i）：激發(fā)波長480 nm。

1.3 實驗步驟

1.3.1 HBP的合成及表征HBP的合成方法參考文獻[15]。B3（19.93 g，50 mmol）溶解在160 mLN'，N-二甲基甲酰胺中，氮氣流鼓泡30 min排除溶液中的氧氣。隨后向溶液中加入AA'（8.29 g，45 mmol）和6 mL三乙胺，氮氣保護下40°C反應24 h。反應結束后，通過旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)反應液中的有機溶劑，然后加入30 mL二氯甲烷重新溶解殘留物，隨后將其逐滴沉淀至500 mL無水乙醚中，得到粗產物。重復上述溶解-沉淀操作2次，真空干燥得到無色透明的HBP，產率為74.3%。利用多角度激光光散射-凝膠滲透色譜-示差黏度儀三聯(lián)用系統(tǒng)測定聚合物的數(shù)均分子質量（Mn）、重均分子量（Mw）、分子量分散指數(shù)（Mw/Mn）和馬克-霍溫克參數(shù)（α）；通過核磁共振譜儀測定聚合物的硫醇含量；利用差示掃描量熱儀測定聚合物的玻璃化轉變溫度（Tg）；利用旋轉流變儀測試聚合物在0.1～100 Hz頻率范圍的彈性模量、損耗模量及黏度。

1.3.2 非水相生物黏合劑的制備將HBP與PEGDA按照不同的丙烯酸酯基團與硫醇基團的物質的量之比混合制備非水相生物黏合劑，記為HBP-x，其中x=n（C=C）/n（SH）。PEGDA在HBP-x中的添加量較低，在HBP-1.0中的質量分數(shù)不超過35%。

1.3.3 非水相生物黏合劑的性能測試吸取大約3 mL黏合劑加入到小玻璃瓶中，通過小瓶傾斜法測試黏合劑的固化時間；將黏合劑加入到四氟乙烯模具中，37°C下固化24 h形成直徑為1 cm、厚度約1 mm的圓片，然后使用旋轉流變儀測試黏合劑的彈性模量；將豬皮浸沒于PBS緩沖液中，根據(jù)國際標準ASTMF2255—2015通過拉伸搭接剪切法測試黏合劑的水下黏合強度；根據(jù)ASTM-F1635-04標準，對比黏合劑在水中浸泡前后的質量變化，評估其水溶脹性以及降解性；參考ISO10 993-12標準，將固化的黏合劑浸沒于細胞培養(yǎng)基中（黏合劑的質量濃度為0.2 g/mL），在37℃下浸泡2 d得到黏合劑浸提液，利用MTT法測試黏合劑浸提液對L929細胞的細胞毒性；將黏合劑涂覆到培養(yǎng)皿底部，待其固化后加入L929細胞懸浮液并培養(yǎng)24 h，然后使用二乙酸熒光素和碘化丙啶對細胞進行染色，并通過正置熒光顯微鏡觀察黏合劑表面L929細胞的生長形態(tài)。

2 結果與討論

2.1 HBP的合成

本文以2-（丙烯酰氧基）乙基甲基丙烯酸酯與三羥甲基丙烷三（3-巰基丙酸酯）為反應單體，以三乙胺為催化劑，通過兩單體之間的邁克爾加成反應制備HBP，合成機理如圖2（a）所示。由于丙烯酸酯基團與巰基的反應活性遠高于甲基丙烯酸酯基團[16]，因此兩單體會優(yōu)先生成AB2型反應中間體，然后進一步聚合形成超支化聚合物[15,17]。這種聚合方法可以有效地規(guī)避傳統(tǒng)的A2+B3聚合體系的凝膠化風險[18,19]。在聚合物的合成過程中，控制硫醇基團的投料量大于雙鍵的投料量(n(C=C)/n(SH)=3/5)。因此，當體系反應完全時，多余的硫醇基團會剩余下來，并充當聚合物的端基基團。如圖2（b）所示，聚合物的核磁共振氫譜在化學位移5～7處沒有出現(xiàn)雙鍵基團的信號峰，而在1.6處顯示出硫醇的信號峰，說明聚合物的末端基團均為硫醇基團。HBP詳細的結構參數(shù)見表1。DSC測試表明HBP的Tg為?48°C。HBP的流變曲線表明其損耗模量大于彈性模量（圖2（c）），證明了超支化聚硫醚在室溫下的液態(tài)特征。HBP具有較低的黏度，且沒有表現(xiàn)出明顯的剪切變稀行為（圖2（c））。另外，蘸有HBP的玻璃棒能夠在水中黏附豬皮組織表面（圖3）。研究結果表明：該聚合物疏水且為液態(tài)的物理性狀，可用于構建非水相生物黏合劑。

圖3 蘸有HBP的玻璃棒在水中黏結豬皮的數(shù)碼照片F(xiàn)ig.3 Digital photographs of a glass rod dipped in HBP bonded to porcine skin under water

表1 HBP的結構參數(shù)Table 1 Structure parameter of HBP

圖2 HBP的（a）合成示意圖、（b）核磁共振氫譜和（c）頻率相關的流變曲線和剪切黏度曲線（25°C）Fig.2（a）Synthetic route and （b）1H-NMR spectrum of HBP;（c）Frequency dependent-modulus and shear viscosity of HBP at 25°C

2.2 非水相黏合劑的制備及性能

要構建無溶劑的非水相黏合劑，需要其能通過溫和的方式原位固化。由于黏合劑的黏度和基團反應活性的問題，非水相黏合劑往往采用光固化的方式黏結組織[11-13]。由于組織部位透光性的問題，光固化黏合劑的使用具有一定的局限性。相比之下，雙組分混合固化的黏合劑（雙組分黏合劑）應用范圍更廣。硫醇點擊化學反應具有反應迅速、條件溫和、轉化率高、可以在無溶劑體系中進行中和且不產生副產物的優(yōu)點，可以很好地解決非水相黏合劑的固化問題[20]。為此，本文利用HBP與PEGDA構建雙組分黏合劑，并通過硫醇-丙烯酸酯邁克爾加成反應交聯(lián)固化。選用PEGDA作為交聯(lián)劑是因為其不僅具有優(yōu)異的生物相容性，而且可以與HBP混溶。

2.2.1 黏合劑的固化性質通過小瓶傾斜法測定黏合劑的固化時間，結果如圖4所示。隨著PEGDA含量的增加，黏合劑的固化時間從57 min逐漸降低至14 min。HBP-0.6、HBP-0.8和HBP-1.0的固化時間分別為18、15.5 min和14 min。HBP-x有充足的固化時間進行混合、注射黏合劑，易于醫(yī)護人員的使用。另外，隨著PEGDA含量增加，固化后黏合劑的剪切模量從46 kPa增強到364 kPa。黏合劑的剪切模量與人體軟組織的剪切模量近似，這可以避免黏合劑與基底界面的應力集中，利于維持界面黏結[21-22]。研究結果表明：PEGDA含量高，黏合劑的交聯(lián)位點增加，導致更短的固化時間以及更高的剪切模量。

圖4 n(C=C)/n(SH)對黏合劑的固化時間及其固化后彈性模量的影響Fig.4 Curing time and elastic modulus of HBP-x as a function of n(C=C)/n(SH)

2.2.2 黏合劑的水下黏合強度聚合物一般通過機械鎖合、分子間作用力（范德華力、氫鍵以及化學鍵等）、鏈纏結以及靜電相互作用等黏附到組織表面[23]。通常情況下，水相黏合劑的聚合物鏈表面吸附有一層水合層。該水合層相當于一層“潤滑劑”，可以屏蔽聚合物鏈和基材表面非共價的分子間作用力。因此，水相黏合劑主要通過鏈纏結、靜電相互作用以及共價鍵黏結到組織表面[5-7]。然而，HBP-x可以通過偶極-偶極相互作用、范德華力以及疏水相互作用與黏附在組織上[8.12]。在水環(huán)境中，HBP-x可以直接涂覆到豬皮表面，然后在37℃固化1 h后測定黏合強度。如圖5（a）所示，黏合強度隨著PEGDA含量增加先上升后下降。從微觀角度來看，黏合劑的黏合性能來源于兩方面：一方面是聚合物與基材的界面相互作用（黏結力）；另一方面是黏合材料本身的機械強度（凝聚力）。黏結力和凝聚力如同鎖鏈的兩個鏈節(jié)，兩者共同決定黏合劑的黏合強度[1]。HBP-0.2的交聯(lián)密度很低、凝聚力很差，黏合強度很低（12 kPa）。隨著PEGDA含量的增加，黏合劑的凝聚力得到提升，黏合強度開始變大。HBP-0.4的黏合強度最大，約為43 kPa。然而，較為親水的PEGDA的引入同時會降低黏合劑的疏水性，削弱黏合劑與豬皮的界面黏結力，導致黏合強度下降。HBP-0.6、HBP-0.8和HBP-1.0的黏合強度分別為37、23 kPa和19 kPa。HBP-x的黏合性能遠高于市售纖維蛋白膠（Fibrin）和氰基丙烯酸酯（CA）。CA是一種非常強的生物黏合劑，但其接觸到水后會迅速固化形成硬膜，從而喪失黏合性能[24]。因此，氰基丙烯酸酯黏合劑不適合在水中使用。HBP-x則表現(xiàn)出較好的水下黏合性能。

圖5 黏合劑在水環(huán)境下對豬皮的黏合強度Fig.5 Underwater adhesive strength of the HBP-adhesive to porcine skin

2.2.3 黏合劑的溶脹行為和降解行為本文研究了不同PEGDA含量的黏合劑在生理環(huán)境中的溶脹行為以及降解行為。如圖6（a）所示，黏合劑的平衡溶脹度很低，僅為7.2%～17.3%，這是因為黏合劑主要由疏水超支化聚硫醚構成所致。黏合劑的溶脹度與PEGDA的含量相關。HBP-1.0的溶脹度最高，HBP-0.2的溶脹度最低。添加PEGDA會增強黏合劑的親水性，導致其溶脹度變大。另外，用于體內的生物黏合劑應該是可降解的，這樣傷口愈合后不需要二次手術取出。HBP的主鏈上含有大量可水解的β-硫代丙酸酯結構[15]，因此在水中會逐漸裂解成小分子物質而被清除到體外。如圖6（b），黏合劑的交聯(lián)程度越高，其降解速率越慢。在PBS緩沖液中浸泡56 d后，HBP-0.2降解了約3.3%，而HBP-1.0只降解了約0.6%。研究結果表明：較高的PEGDA含量會增加黏合劑的溶脹度，但會降低黏合劑的降解速率。

圖 6 HBP-x在PBS緩沖液中（37 °C）的（a）溶脹曲線和（b）降解曲線Fig.6（a）Swelling profile and （b）degradation profile of HBP-x in PBS solution at 37°C

2.2.4 黏合劑的體外細胞毒性黏合劑浸提液培養(yǎng)L929細胞的相對活力結果示于圖7。相對于正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞而言，以黏合劑浸提液培養(yǎng)的細胞的相對活力均保持在90%以上，表明該黏合劑不會釋放有毒物質。相比于小分子硫醇化合物而言，使用超支化聚硫醚可避免未反應單體向周圍環(huán)境釋放，降低材料的細胞毒性。本文還直接將細胞接種到黏合劑表面培養(yǎng)以評價黏合劑的細胞相容性。經(jīng)過24 h的培養(yǎng)后，綠色的活細胞均勻地分布在黏合劑表面，幾乎沒有紅色的死細胞（圖8），說明L929細胞能在黏合劑表面正常的生長，增殖。研究結果表明：本文制備的黏合劑具有優(yōu)異的細胞相容性，PEGDA的含量對其沒有影響。HBP-x可以在水環(huán)境中黏結組織，且具有有優(yōu)異的生物相容性，有望應用于心室壁、血管等組織的密封[8,12, 13]。

圖 7黏合劑浸提液培養(yǎng)L929細胞的相對細胞活力Fig.7 Relative cell viability of L929 cell cultured by the extract of HBP-adhesive

圖8 HBP-x表面培養(yǎng)的L929細胞于24 h后的熒光共焦照片F(xiàn)ig.8 Live staining fluoresence confocal images of L929 cells present on the cured HBP-x after 24 h

3 結論

（1）以2-（丙烯酰氧基）乙基甲基丙烯酸酯和三羥甲基丙烷三（3-巰基丙酸酯）為反應原料，以一鍋法合成了富含硫醇基團的液態(tài)超支化聚硫醚，然后添加聚乙二醇二丙烯酸酯制備了非水相生物黏合劑。

（2）HBP-x能在水中黏結豬皮組織，且具有較低的平衡溶脹度和降解速率，其各項性能與PEGDA的含量有關。HBP-0.6表現(xiàn)出最佳的綜合性能，固化時間為18 min,在水中的豬皮黏合強度可達37 kPa。

（3）HBP-x不會泄漏或產生有毒物質，且能夠使L929細胞在其表面生長，具有優(yōu)異的細胞相容性。