基于響應(yīng)面法對抗腫瘤乳酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

◎靳瑾健，丁 琳，郭 皓

（1.黑龍江省農(nóng)墾齊齊哈爾管理局中心醫(yī)院藥劑科，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研處，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

乳酸菌是能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的一類細(xì)菌[1]，研究表明一些乳酸菌可以調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)免疫力，降低膽固醇，抗氧化抗腫瘤等[2]，因此常被用作功能性食品成分。隨著人們健康意識(shí)及安全意識(shí)的提高，將高效、低毒的乳酸菌作為天然制劑開發(fā)已成為研究熱點(diǎn)。目前，乳酸菌的抗腫瘤作用機(jī)制研究主要集中于阻斷自由基鏈的傳遞過程，阻斷自由基的產(chǎn)生，從而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[3]。FUKUI[4]等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可明顯降低腫瘤細(xì)胞的發(fā)生率。AZAM[5]等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌培養(yǎng)的上清液可抑制乳腺癌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，由此可見，有些乳酸菌不但本身有抗腫瘤的作用，其代謝產(chǎn)物也具有抗腫瘤的功能[6]。因此本研究選取乳酸菌代謝產(chǎn)物為研究對象，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面分析方法優(yōu)化培養(yǎng)條件，以觀察其抗腫瘤活性，為乳酸菌的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，為生產(chǎn)功能性乳制品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌G5（本實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株活性乳酸菌）；MTT（美國Amersco 公司）、DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）、酶標(biāo)儀（F-4500，瑞士Tecan 公司）、大容量高速冷凍離心機(jī)（Z36HK，德國Hermle 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)

取甘油保藏的乳酸菌菌株接種于MRS 培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)48 h，活化3 代后，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

乳酸菌抗腫瘤實(shí)驗(yàn)采用MTT 實(shí)驗(yàn)的腫瘤抑制率為指標(biāo)進(jìn)行篩選。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 接種于96 孔板，乳酸菌代謝產(chǎn)物作用48 h，培養(yǎng)結(jié)束每孔加20 μL MTT溶液，孵育3 h 后離心去上清，加150 μL 二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10 min 后，利用酶標(biāo)儀570 nm 檢測波長檢測各組吸光度并計(jì)算細(xì)胞的抑制率。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度）×100%。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)初步探究抗腫瘤乳酸菌的培養(yǎng)條件，研究蛋白胨添加量（5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1和25 g·L-1）、葡萄糖添加量（10·L-1、20·L-1、30·L-1、40·L-1和50 g·L-1）、接種量（1%、3%、5%、7%和10%）、培養(yǎng)溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和42 ℃）、培養(yǎng)時(shí)間（24 h、32 h、48 h、60 h 和72 h）及培養(yǎng)基pH（5.5、6.0、6.5、7.0 和7.5）對腫瘤細(xì)胞抑制率的影響。

1.2.4 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選擇影響乳酸菌培養(yǎng)的6 個(gè)因素（蛋白胨添加量、葡萄糖添加量、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基pH）作為評(píng)價(jià)因素，以腫瘤細(xì)胞抑制率Y作為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)。

1.2.5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB 試驗(yàn)結(jié)果，選擇顯著影響乳酸菌培養(yǎng)的3 個(gè)因素（蛋白胨添加量、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)時(shí)間）作為自變量，以腫瘤細(xì)胞抑制率Y作為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行Box-Behnken（BBD）試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用Design Expert 8.0；統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

各因素對腫瘤細(xì)胞抑制率的影響見表1。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇蛋白添加量為15 g·L-1，葡萄糖添加量為30 g·L-1，接種量為5%，選擇培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，最適培養(yǎng)基pH 為6.5。

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果表

2.2 PB 試驗(yàn)分析

單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，回歸分析結(jié)果見表3。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)回歸分析結(jié)果表

由表3 可知，模型的F值為9.77，P 值為0.012 1（P＜0.05），模型項(xiàng)顯著，表明該模型具有重要意義。該模型的決定系數(shù)R2=0.921 4，信噪比=10.525 2（＞4），表示此模型具有良好的預(yù)測能力。各個(gè)變量對腫瘤細(xì)胞抑制率影響的顯著程度依次為F ＞D ＞A ＞C ＞E ＞B，利用軟件對表3 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到模型擬合方程：Y=37.37+3.51A-0.875 0B+1.71C+5.45D+1.45E+6.15F，由回歸方程可知，培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)時(shí)間和蛋白胨添加量3 個(gè)因素顯著地影響腫瘤細(xì)胞的抑制率，因此選擇這3 個(gè)因素進(jìn)行BBD 試驗(yàn)。

2.3 BBD 試驗(yàn)分析

在PB 試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平結(jié)果見表4，回歸分析見表5。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

表5 Box-Behnken 試驗(yàn)回歸分析結(jié)果表

由表5 可知，回歸模型F值為27.12，P=0.000 1（P＜0.05），模型差異極顯著，該模型的決定系數(shù)R2=0.972 1，信噪比=14.622（＞4），表明此模型具有很強(qiáng)的預(yù)測能力。模型失擬項(xiàng)無顯著性差異（P=0.283 1 ＞0.05），說明該模型的擬合度較好，由此可以判斷，BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)是可靠的。利用軟件對表4 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到模型擬合方程：Y=48.38+2.22A+3.56D+3.25F+1.59AD-0.50AF-1.97DF-6.77A2-6.83D2-4.35F2。各因素之間的交互作用對腫瘤細(xì)胞抑制率的影響如圖1所示。

圖1 各因素變化對腫瘤細(xì)胞抑制率的交互作用圖

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由BBD 試驗(yàn)可得出，抗腫瘤乳酸菌最佳培養(yǎng)條件是蛋白胨添加量為20.90 g·L-1，培養(yǎng)時(shí)間為38.34 h，培養(yǎng)基pH 為6.65，在此條件下，預(yù)測的腫瘤細(xì)胞抑制率實(shí)際值為49.50%，根據(jù)實(shí)際情況對其進(jìn)行調(diào)整，培養(yǎng)條件是蛋白胨添加量為20 g·L-1，培養(yǎng)時(shí)間為38 h，培養(yǎng)基pH 為6.7，測出的實(shí)際腫瘤細(xì)胞抑制率為46.54%，與預(yù)測值無顯著差異（P＞0.05）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以乳酸菌代謝產(chǎn)物抑制腫瘤細(xì)胞生長為指標(biāo)，從中優(yōu)化乳酸菌的培養(yǎng)條件。通過單因素試驗(yàn)分析和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得到最佳的培養(yǎng)條件：蛋白胨添加量為20 g·L-1，培養(yǎng)時(shí)間為38 h，培養(yǎng)基pH 為6.7，對腫瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)到了46.54%，此研究為乳酸菌代謝產(chǎn)物抗腫瘤的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，使乳酸菌的應(yīng)用前景愈加廣闊。