響應(yīng)面法優(yōu)化酶解制備魚(yú)皮膠原寡肽

◎王 霞，畢桂燦，賴園園

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新能源與新材料研究所，廣東 廣州 510000；3.安徽國(guó)肽生物科技有限公司，安徽 宣城 242000）

膠原蛋白是人體內(nèi)一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛分布于皮膚、骨、韌帶等組織中[1]。膠原蛋白分子具有獨(dú)特的三股螺旋結(jié)構(gòu)[2]，分子量大難以被人體吸收。膠原寡肽是將膠原蛋白進(jìn)行水解后得到的小分子產(chǎn)物，易被人體吸收，具有抗氧化、美容、降血壓等功效，在化妝品、食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)材料等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛[3]。膠原蛋白水解主要有化學(xué)法和酶解法，化學(xué)法對(duì)寡肽結(jié)構(gòu)和氨基酸破壞嚴(yán)重，導(dǎo)致產(chǎn)物活性低，污染嚴(yán)重；酶解法反應(yīng)過(guò)程溫和，對(duì)膠原肽結(jié)構(gòu)沒(méi)有被破壞，極大地保留了產(chǎn)物的活性[4]。本研究以鯪魚(yú)魚(yú)皮為原料，采用SCAU 膠原蛋白復(fù)合酶水解制備膠原寡肽，并通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其酶解反應(yīng)條件，為魚(yú)皮酶解制備膠原肽提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SCAU 膠原蛋白復(fù)合酶和鯪魚(yú)魚(yú)皮，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)工程研究所提供。NaOH、HCl、甲醛均為分析純，活性炭為食品級(jí)。魚(yú)皮洗凈，刮去魚(yú)皮表面魚(yú)鱗和脂肪，剪成小塊，于50 ℃烘箱烘干，保存于-20 ℃下備用。

1.2 儀器與設(shè)備

D1型自動(dòng)蒸汽滅菌鍋，BT1248 分析天平，1810D型自動(dòng)雙重純水蒸餾器，XMT-DA 水浴鍋。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶解制備膠原寡肽

稱(chēng)取2 g 干魚(yú)皮，121 ℃高壓滅菌15 min，按料液比1∶9（g∶mL）加入無(wú)菌水，調(diào)節(jié)pH 值，加入SCAU 膠原蛋白復(fù)合酶液于水浴鍋中水解數(shù)小時(shí)后，加入0.2 g 活性炭粉于沸水浴中保溫5 min 終止酶解，冷卻至室溫，抽濾，濾液冷凍干燥后得膠原寡肽粉。反應(yīng)條件根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整。

1.3.2 提取率的計(jì)算

稱(chēng)量冷凍干燥后的膠原寡肽粉質(zhì)量，膠原寡肽提取率計(jì)算公式為：

1.3.3 酶解制備魚(yú)皮膠原寡肽單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇加酶量（0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL）、時(shí)間（2 h、3 h、4 h、5 h 和6 h）、溫度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃）、pH 值（6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0）作為因素，分別測(cè)定4 個(gè)因素對(duì)魚(yú)皮膠原肽提取率的影響。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將魚(yú)皮膠原寡肽提取率設(shè)為響應(yīng)值，得到4 因素3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型如表1所示。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素及水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解制備膠原寡肽單因素試驗(yàn)

2.1.1 加酶量對(duì)膠原寡肽提取率的影響

加酶量對(duì)魚(yú)皮膠原寡肽提取率的影響如圖1所示。隨著加酶量的增加，膠原寡肽提取率逐漸升高，當(dāng)加酶量為0.6 mL 時(shí)膠原寡肽提取率最高，之后略有下降。原因可能是隨著反應(yīng)體系中酶濃度的升高，反而會(huì)抑制水解的進(jìn)行，從而使肽提取率下降[5]。因此，選擇加酶量0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 作為研究水平。

圖1 加酶量對(duì)膠原寡肽提取率的影響圖

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)膠原寡肽提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)皮膠原寡肽提取率的影響如圖2所示。隨著時(shí)間的增加，膠原寡肽提取率逐漸升高，至酶解時(shí)間為4 h 時(shí)提取率最高，繼續(xù)增加酶解時(shí)間提取率基本上維持不變。原因可能是隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白酶的穩(wěn)定性受到影響，活性逐漸喪失，無(wú)法再催化蛋白的水解[6]。因此，選擇酶解時(shí)間3 h、4 h、5 h 作為研究水平。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)皮膠原肽提取率的影響圖

2.1.3 酶解溫度對(duì)魚(yú)皮膠原寡肽提取率的影響

酶解溫度對(duì)魚(yú)皮膠原寡肽提取率的影響如圖3所示。當(dāng)酶解溫度為55 ℃時(shí)，寡肽提取率最高，酶解溫度為65 ℃時(shí)寡肽提取率最低，原因可能是該膠原蛋白酶的最適溫度約為55 ℃，溫度偏低，不利于酶與底物的結(jié)合與反應(yīng)；該膠原復(fù)合酶對(duì)高溫較為敏感，溫度過(guò)高，易導(dǎo)致酶變性失活，提取率下降。因此，選擇50 ℃、55 ℃、60 ℃作為研究水平。

圖3 酶解溫度對(duì)魚(yú)皮膠原肽提取率的影響圖

2.1.4 pH 值對(duì)魚(yú)皮膠原寡肽提取率的影響

pH 值對(duì)魚(yú)皮膠原寡肽提取率的影響如圖4所示。結(jié)果表明，當(dāng)pH 值為8.0 時(shí)，寡肽提取率最高，pH值低于或者高于8，提取率都會(huì)下降。原因可能是該酶最適pH 約為8，當(dāng)反應(yīng)體系pH 值偏離最適pH 時(shí)，該膠原蛋白復(fù)合酶的活性都會(huì)顯著降低，反應(yīng)速度減慢。因此，選擇pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0 作為研究水平。

圖4 pH 值對(duì)魚(yú)皮膠原肽提取率的影響圖

2.2 酶解制備魚(yú)皮膠原寡肽結(jié)果與分析

2.2.1 酶解制備魚(yú)皮膠原肽數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 12.0.1.0響應(yīng)面軟件進(jìn)行組合設(shè)計(jì)，考查加酶量（A）、時(shí)間（B）、溫度（C）、pH 值（D）對(duì)魚(yú)皮膠原寡肽提取率（Y）的影響，試驗(yàn)組合及各組合下得到的膠原寡肽提取率結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

通過(guò)軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，以魚(yú)皮膠原寡肽提取率為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程為：Y=21.95+0.342 5A+0.799 2B-0.393 3C+2.70D+0.190 0AB-0.020 0AC-0.552 5AD-0.087 5BC-0.075 0BD+0.052 5CD-1.86A2-2.26B2-2.65C2-5.20D2。對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 顯著性檢驗(yàn)分析表

由表3 可知，此模型P值遠(yuǎn)小于0.01，說(shuō)明此模型極顯著，誤差很小，故此模型可代替真實(shí)值對(duì)魚(yú)皮膠原寡肽提取率進(jìn)行分析。在回歸模型中，對(duì)酶解制備魚(yú)皮膠原寡肽影響為極顯著的為一次項(xiàng)D，二次項(xiàng)B2、C2、D2，而一次項(xiàng)B 和二次項(xiàng)A2對(duì)酶解制備魚(yú)皮膠原寡肽影響為顯著。影響魚(yú)皮膠原寡肽提取率大小因素依次為pH 值＞時(shí)間＞溫度＞加酶量。

對(duì)該回歸模型進(jìn)行可信度分析，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=95.20%，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=90.41%，Y變異系數(shù)為6.14%，試驗(yàn)值與理論值相關(guān)性高，說(shuō)明此模型可靠性高。

2.2.2 因素間相互作用響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖能夠反映出4 個(gè)因素之間的相互關(guān)系以及作用程度[7]，結(jié)果如圖5所示。各響應(yīng)曲面的最高點(diǎn)位于等高線最小橢圓的中心點(diǎn)或附近[8]，說(shuō)明加酶量、時(shí)間、溫度和pH 值各因素之間存在的相互作用不顯著。

圖5 魚(yú)皮膠原寡肽提取響應(yīng)面圖

2.2.3 酶解制備魚(yú)皮膠原肽參數(shù)優(yōu)化

根據(jù)Design Expert12.0.1.0 軟件的計(jì)算，最優(yōu)酶解反應(yīng)條件為：加酶量0.61 mL（即每克魚(yú)皮（干）加酶0.305 mL）、酶解時(shí)間4.18 h、酶解溫度54.62 ℃、pH 值8.25，魚(yú)皮膠原寡肽提取率預(yù)測(cè)為22.39%?？紤]到實(shí)際方便及易操作性，將酶解反應(yīng)條件設(shè)定為：每克魚(yú)皮（干）加酶0.305 mL、時(shí)間4.2 h、溫度54.6 ℃、pH 值8.2。在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，酶解制備魚(yú)皮膠原肽平均提取率為22.58%。

3 結(jié)論

本方法利用SCAU 膠原蛋白復(fù)合酶水解鯪魚(yú)魚(yú)皮提取膠原寡肽，并采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解反應(yīng)條件參數(shù)。結(jié)果表明此魚(yú)皮膠原蛋白酶解的最佳條件為每克魚(yú)皮（干）加酶0.305 mL、酶解時(shí)間4.2 h、酶解溫度54.6 ℃、pH 值8.2。在此酶解反應(yīng)條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，魚(yú)皮膠原肽提取率平均為22.58%。方差分析結(jié)果表明，影響魚(yú)皮膠原寡肽提取率大小因素依次為pH 值、水解時(shí)間、水解溫度和加酶量，交互項(xiàng)對(duì)魚(yú)皮膠原肽提取率影響不顯著。