產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素重組突變體大腸桿菌表達(dá)條件的優(yōu)化

朱 真，杜吉革，薛 麒，李啟紅，印春生，張瑩輝，李倩琳，姚文生，陳小云

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)舊稱魏氏梭菌(C.welchii)或產(chǎn)氣莢膜桿菌(Bacillus perfringens)[1]，1891年，由醫(yī)學(xué)博士Wlliam H. Welch和同事進(jìn)行尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)。它是一種重要的人畜共患細(xì)菌性病原，廣泛存在于土壤、污水、食物等自然環(huán)境以及動(dòng)物及人類的腸道中[2]。作為條件致病菌，能引起多種動(dòng)物，包括綿羊、山羊、牛、豬、禽類、犬、家兔、馴鹿、羊駝等壞死性腸炎、腸毒血癥，并能導(dǎo)致人的氣性壞疽和食物中毒。菌體自身不致病，依靠其分泌的外毒素造成機(jī)體損害[3]，主要分泌α、β、ε、ι四種外毒素，而根據(jù)毒素產(chǎn)生種類的不同，該菌可分為A、B、C、D、E五型[2]。由B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的ε毒素[4]，對(duì)小鼠的LD50為100 ng/kg，在該菌所有外毒素中毒力最強(qiáng)，也是繼肉毒桿菌毒素和破傷風(fēng)毒素之后的世界第三大毒力細(xì)菌外毒素，是潛在的生物恐怖主義戰(zhàn)劑，被美國(guó)疾控中心(CDC)列為B類生物制劑[5]。

疫苗免疫是防制產(chǎn)氣莢膜梭菌病的重要手段，而目前廣泛應(yīng)用的類毒素疫苗存在諸多弊端，如生產(chǎn)過(guò)程需添加動(dòng)物組織、批間差異大、抗原成分復(fù)雜、有效抗原含量低。為此，本研究在前期產(chǎn)氣莢膜梭菌突變體研究[12]的基礎(chǔ)上，對(duì)突變體重組蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，使可溶性表達(dá)比例進(jìn)一步提高，這將為產(chǎn)氣莢膜梭菌突變體的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 pETXm3質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存； 12%SDS PAGE預(yù)制蛋白膠、NuPAGETMMES SDS Running Buffer (20X)、NuPAGETMTransfer Buffer (20X)；BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、IPTG購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；硫酸卡那霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PBS、LB培養(yǎng)基購(gòu)自北京中海生物科技有限公司；蛋白Marker購(gòu)自康潤(rùn)生物。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 將pETXm3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將成功轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的菌液分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，再以1%比例分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基(Kana 30 μg/mL)5000 mL，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.4～0.6時(shí)，加入IPTG(0.5 m mol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別取1000 mL菌液，在17 ℃、22 ℃、27 ℃、32 ℃和37 ℃下各振蕩培養(yǎng)4 h。各取10 mL菌液，4 ℃ 12000 rpm離心1 min，棄上清，分別以10 mL PBS重懸沉淀，后使用高壓破碎儀進(jìn)行菌體細(xì)胞裂解。分別取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm離心5 min，收集上清，沉淀分別用1 mL PBS復(fù)溶。以未誘導(dǎo)菌液裂解液作為陰性對(duì)照，取不同溫度下誘導(dǎo)的裂解菌液的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，比較不同誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響。

1.2.2 表達(dá)菌不同生長(zhǎng)期對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響 將成功轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的菌液分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，再以1%比例接種于含5000 mL LB肉湯培養(yǎng)基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取菌液進(jìn)行OD600測(cè)定，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600為縱坐標(biāo)繪制表達(dá)菌生長(zhǎng)曲線。同時(shí)，分別在培養(yǎng)2、4、6、8 h和10 h各取菌液1000 mL，加入IPTG(0.5 m mol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37 ℃振蕩4 h收獲。分別取不同時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)菌液，4 ℃ 12000 rpm離心1 min，棄上清，分別以10 mL PBS重懸沉淀，后使用高壓破碎儀進(jìn)行菌體細(xì)胞裂解。分別取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm離心5 min，收集上清，沉淀分別用1 mL PBS復(fù)溶。以未誘導(dǎo)菌液裂解液作為陰性對(duì)照，取不同溫度下誘導(dǎo)的裂解菌液的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，比較不同生長(zhǎng)期對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響。

1.2.3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 將成功轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的菌液分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，再以1%比例接種于LB肉湯培養(yǎng)基(Kana 30 μg/mL)5000 mL，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.895～1.295時(shí)，加入IPTG(0.5 m mol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別取1000 mL，在37 ℃下振蕩培養(yǎng)2、4、6、8 h。各取10 mL菌液，4 ℃ 12000 rpm離心1 min，棄上清，分別以10 mL PBS重懸沉淀，后使用高壓破碎儀進(jìn)行菌體細(xì)胞裂解。各取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm離心5 min，收集上清，沉淀分別用1 mL PBS復(fù)溶。以未誘導(dǎo)菌液裂解液作為陰性對(duì)照，取不同溫度下誘導(dǎo)的裂解菌液的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，比較不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響。

1.2.4 IPTG濃度的優(yōu)化 將成功轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的菌液分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基(Kana 30 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，再以1%比例接種于LB肉湯培養(yǎng)基(Kana 30 μg/mL)2瓶，5000 mL/瓶，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.895～1.295時(shí)，將2瓶菌液混勻，分別取1000 mL，分別加入濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mM 的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在37 ℃下分別振蕩培養(yǎng)4 h后，各取10 mL菌液，4 ℃ 12000 rpm離心1 min，棄上清，分別以10 mL PBS重懸沉淀，后使用高壓破碎儀進(jìn)行菌體細(xì)胞裂解。各取裂解液1 mL，4 ℃ 12000 rpm離心5 min，收集上清，沉淀分別用1 mL PBS復(fù)溶。以未誘導(dǎo)菌液裂解液作為陰性對(duì)照，取不同溫度下誘導(dǎo)的裂解菌液的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，比較不同IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化E.coliBL21(pETXm3)經(jīng)IPTG在17 ℃、22 ℃、27 ℃、32 ℃和37 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)，從SDS-PAGE電泳圖中可得知，目的蛋白主要以可溶表達(dá)為主，且37 ℃條件下目的蛋白可溶性表達(dá)量最高，故選擇37 ℃作為最佳誘導(dǎo)溫度。

a.誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白(上清)表達(dá)的影響；b. 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白(沉淀)表達(dá)的影響a. Effect of induction temperature on recombinant protein(supernatant)expression；b. Effect of induction temperature on recombinant protein(precipitation)expression；M.蛋白marker；NC1.未誘導(dǎo)菌細(xì)胞裂解上清；NC2.未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解沉淀；1/2/3/4. 17/22/27/32/37 ℃誘導(dǎo)細(xì)胞裂解上清；6/7/8/9. 17/22/27/32/37 ℃誘導(dǎo)細(xì)胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC1. The supernatant of cell lysates without induction；Lane NC2. The precipitation of cell lysateswithout induction；Lane 1/2/3/4. The supernatant of cell lysates induced under 17/22/27/32/37 ℃；Lane 6/7/8/9. The precipitation of cell lysates induced under 17/22/27/32/37 ℃.圖1 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of induction temperature on recombinant protein expression

2.1.2 表達(dá)菌不同生長(zhǎng)期對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌液OD600為縱坐標(biāo)，繪制E.coliBL21(pETXm3)生長(zhǎng)曲線，如表1和圖2所示，細(xì)菌生長(zhǎng)0～1 h為遲緩期，細(xì)菌緩慢生長(zhǎng)；2～13 h為對(duì)數(shù)期，細(xì)菌快速生長(zhǎng)，菌液OD600從0.090升至1.423，且1～4 h生長(zhǎng)速率最大，5～13 h生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)；14～16 h細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600維持在1.402～1.404，生長(zhǎng)速率接近為零。

圖2 E.coli BL21(pETXm3)生長(zhǎng)曲線Fig 2 The growth curve of E.coli BL21(pETXm3)

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間E.coli BL21(pETXm3)菌液OD600Table 1 Bacterial broth OD600 of E.coli BL21(pETXm3)at different culture times

不同生長(zhǎng)期重組蛋白表達(dá)情況如圖3所示，E.coliBL21(pETXm3)培養(yǎng)2 h(OD600值0.259)時(shí)，目的蛋白表達(dá)量較少，從4 h(OD600值0.715)起表達(dá)量開始積累，且存在可溶表達(dá)，6～10 h(OD600值0.895～1.295)表達(dá)量差異較小，為目的蛋白表達(dá)量高峰期，直至培養(yǎng)12 h(OD600值1.339)時(shí)表達(dá)量開始下降。從以上分析可知，表達(dá)菌OD600為0.895～1.295時(shí)開始誘導(dǎo)，目的蛋白表達(dá)量較高。

M.蛋白marker；NC1.未誘導(dǎo)菌細(xì)胞裂解物上清；NC2.未誘導(dǎo)菌細(xì)胞裂解物沉淀；1/2/3/4/5/6. 培養(yǎng)2 h/4h/6 h/8 h/10 h/12 h后誘導(dǎo)菌液細(xì)胞裂解上清；7/8/9/10/11/12. 培養(yǎng)2 h/4 h/6 h/8 h/10 h/12 h后誘導(dǎo)菌液細(xì)胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC1. The supernatant of cell lysates without induction；Lane NC2. The precipitation of cell lysates without induction；Lane 1/2/3/4/5/6. The induced supernatant of cell lysates induced after 2 h/4 h/6 h/8 h/10 h/12 h incubation；Lane 7/8/9/10/11/12. The induced precipitation of cell lysates induced after 2 h/4 h/6 h/8 h/10 h/12 h incubation.圖3 不同生長(zhǎng)期E.coli BL21(pETXm3)重組蛋白的表達(dá)Fig 3 Expression of recombinant protein of E.coli BL21 (pETXm3) in different growth periods

2.1.3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化E.coliBL21(pETXm3)經(jīng)IPTG在37 ℃條件下分別進(jìn)行2、4、6和8 h誘導(dǎo)表達(dá)，從SDS-PAGE電泳圖中可得知，目的蛋白在最佳溫度37 ℃誘導(dǎo)4 h后表達(dá)量開始增多并趨穩(wěn)，誘導(dǎo)4、6和8 h的表達(dá)量彼此差異不大，但從圖中可看出，誘導(dǎo)6 h無(wú)論是可溶蛋白還是包涵體的表達(dá)量，相對(duì)較多，故選擇誘導(dǎo)6 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

M.蛋白marker；NC1.未誘導(dǎo)菌細(xì)胞裂解物；1/2/3/4. 誘導(dǎo)2 h/4 h/6 h/8 h后細(xì)胞裂解上清；5/6/7/8. 誘導(dǎo)2 h/4 h/6 h/8 h后細(xì)胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC1. The supernatant of cell lysates without induction；Lane 1/2/3/4. The supernatant of cell lysates induced with IPTG for2 h/4 h/6 h/8 h；Lane 5/6/7/8. The precipitation of cell lysates induced with IPTG for2 h/4 h/6 h/8 h.圖4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of induction time on recombinant protein expression

2.1.4 IPTG濃度的優(yōu)化E.coliBL21(pETXm3)分別經(jīng)0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 mM IPTG誘導(dǎo)，在37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)4 h后，蛋白表達(dá)情況如圖5所示，0.4～2.4 mM IPTG 誘導(dǎo)下，目的蛋白在上清中均有一定量表達(dá)，1.6 mM時(shí)可溶性蛋白表達(dá)量最高，比例可達(dá)40%，故選擇1.6 mM 作為最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

M.蛋白marker；NC.未誘導(dǎo)菌細(xì)胞裂解物；1/2/3/4/5/6. IPTG濃度0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM 誘導(dǎo)后細(xì)胞裂解上清；7/8/9/10/11/12. IPTG濃度0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM 誘導(dǎo)后細(xì)胞裂解沉淀。Lane M. protein marker；Lane NC. The cell lysates without induction；Lane1/2/3/4/5/6.The supernatant of cell lysates induced with0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM IPTG；Lane7/8/9/10/11/12. The precipitation of cell lysates induced with0.4 mM/0.8 mM/1.2 mM/1.6 mM/2.0 mM/2.4 mM IPTG.圖5 IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effect of IPTG concentration on protein expression

3 討論與結(jié)論

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展，許多外源蛋白通過(guò)基因技術(shù)工程在不同表達(dá)系統(tǒng)中得到了高效、正確的表達(dá)，并在生物制品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。外源基因表達(dá)系統(tǒng)又有原核和真核之分，其中原核表達(dá)應(yīng)用較多的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌和枯草芽孢桿菌；真核表達(dá)系統(tǒng)則主要為酵母、昆蟲桿狀病毒以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞[6]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、易于操作、培養(yǎng)周期短、成本低廉、使用安全等諸多優(yōu)點(diǎn)，故本研究使用全球廣泛使用的大腸桿菌PET系列表達(dá)載體，T7啟動(dòng)子支配下，一經(jīng)加入IPTG誘導(dǎo)劑，外源蛋白即可開始高效表達(dá)。影響蛋白表達(dá)的因素有很多，同類研究大多選擇誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間這些項(xiàng)目進(jìn)行優(yōu)化[7-9]，除此之外，還有培養(yǎng)基pH值[10]、溶氧量、補(bǔ)料碳源等[11]，但后3種因素更適用于實(shí)際生產(chǎn)中大規(guī)模發(fā)酵，本研究不再進(jìn)行詳細(xì)比較。故本研究選取了常見的誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間這三項(xiàng)優(yōu)化條件，除此之外，還對(duì)誘導(dǎo)菌液濃度對(duì)可溶蛋白表達(dá)量的影響進(jìn)行了分析，因?yàn)榧?xì)菌不同生長(zhǎng)時(shí)期，菌密度、酶活性、代謝速度均有不同，這將對(duì)外源蛋白表達(dá)具有直接影響。

前期研究中構(gòu)建的ε毒素的重組突變體為可溶性表達(dá)[12]，所以本研究重點(diǎn)關(guān)注如何提高上清中目的蛋白表達(dá)量。在比較誘導(dǎo)菌液濃度對(duì)可溶蛋白表達(dá)量的影響時(shí)，經(jīng)過(guò)測(cè)得菌液OD600值為0.090～ 1.423時(shí)處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，1.423以后進(jìn)入穩(wěn)定期，而本研究獲得最佳誘導(dǎo)狀態(tài)OD600值0.895～1.295正是處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的中后階段，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)相對(duì)較多，酶活性較強(qiáng)，菌密度適中，所以最適于外源蛋白表達(dá)。此外將37 ℃作為最佳誘導(dǎo)溫度，在實(shí)踐生產(chǎn)中具有十分重要的意義，因?yàn)檎T導(dǎo)溫度越高，導(dǎo)致蛋白合成速度越快，有些時(shí)候過(guò)多的蛋白來(lái)不及正確折疊而導(dǎo)致包涵體產(chǎn)生，而包涵體在后期復(fù)性時(shí)需要費(fèi)時(shí)費(fèi)力且不一定和原蛋白天然構(gòu)象一致，為了達(dá)到可溶表達(dá)效果，誘導(dǎo)溫度甚至是低溫。本研究將37 ℃作為最佳誘導(dǎo)溫度，省去了實(shí)際生產(chǎn)中低溫冷卻的工序，能極大降低生產(chǎn)成本，具有較好應(yīng)用前景。綜上所述，37 ℃、菌液OD600值為0.895～1.295時(shí)，以1.6 mM IPTG誘導(dǎo)6 h條件下可溶性表達(dá)量最高，這將為產(chǎn)氣莢膜梭菌突變體的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。