基于GC-MS的九香蟲脂肪油入血成分分析

路曉娟，郎 霞，李會芳

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中030619）

九香蟲為蝽科昆蟲九香蟲（Aspongopuschinensis Dallas）的干燥體，具有理氣止痛、溫中助陽的功效，用于胃寒脹痛、肝胃氣痛、腎虛陽痿、腰膝酸痛等，具有較高的藥用和營養(yǎng)價(jià)值?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明九香蟲具有抗腫瘤和改善生殖損傷的作用，另外還有抗菌、抗氧化、抗凝血、抗?jié)儭⒖蛊诘榷喾N藥理活性［1-7］。前期課題組研究證實(shí)九香蟲脂肪油對兩種動(dòng)物胃潰瘍模型（應(yīng)激型、無水乙醇誘發(fā)型）都具有良好的胃黏膜保護(hù)作用［7］，九香蟲脂肪油為其抗消化性潰瘍的有效部位，但其體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，限制了其進(jìn)一步開發(fā)利用及臨床合理用藥。本次實(shí)驗(yàn)采用GC-MS檢測九香蟲脂肪油給藥后的主要入血成分，為揭示九香蟲脂肪油發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)［8］。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 HGC-12A氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）、PA224型電子精密天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、TGL-18型臺式高速冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）、PL-S40型康士潔牌數(shù)碼超聲儀、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Finnigan公司生產(chǎn)）。

1.1.2 試劑與材料 九香蟲脂肪油由本實(shí)驗(yàn)室采取超臨界流體萃取工藝自制［9］，市售歐麗薇蘭橄欖油，甲醇、正己烷為色譜純（購自天津益仁達(dá)化工有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級健康SD大鼠12只，雌雄各半，體重為180～220 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號為SCXK（晉）2015-0001。

1.3 方法

1.3.1 給藥與取血 取SD大鼠12只，雌雄各半，隨機(jī)分成空白組和九香蟲脂肪油組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。禁食12 h（自由飲水）后，每天按照2.1 g/kg劑量灌胃給予九香蟲脂肪油（用橄欖油溶解至所需濃度），連續(xù)灌胃4 d，空白組給與等體積的橄欖油。末次灌胃1 h后，用水合氯醛麻醉大鼠，開腹后用一次性取血針腹主動(dòng)脈取血于肝素抗凝采血管中，取血量為5 mL左右。取血后輕輕搖動(dòng)采血管防止凝血，室溫放置30 min后，離心15 min（3000 r/min），取上清液血漿。將處理好的血漿做好標(biāo)記，冷凍保存。將同組血漿混合，消除個(gè)體差異。

1.3.2 血漿處理與分析 空白血漿：取空白組血漿200μL于離心管中，處理方法如下，加入10%H2SO4-CH3OH溶液2 mL，混懸1 min，62℃水浴2 h。冷卻后加入一定量的無水硫酸鈉及2 mL的正己烷，混懸1 min。常溫離心5 min（3500 r/min），取上清液于1.5 mL的EP管中，氮?dú)獯蹈伞：幯獫{：取九香蟲脂肪油組血漿200μL于離心管中，處理方法同空白血漿。九香蟲脂肪油：取200μL九香蟲脂肪油于離心管中，處理方法同空白血漿。

1.3.3 氣相色譜條件與質(zhì)譜條件

1.3.3.1 GC條件 色譜柱JWDB-WAX23（30 m×0.25 mm×0.25μm），載氣為氦氣（99.999%），分流比10∶1，氣化溫度230℃。升溫程序：初始溫度50℃保留2min，以10℃/min升溫至200℃，保留10min；以10℃/min升溫至220℃，保留15 min。進(jìn)樣口溫度200℃，2.2項(xiàng)下樣品加入100μL正己烷復(fù)溶，離心，取上清液1μL進(jìn)樣GC-MS分析。

1.3.3.2 MS條件 離子源溫度：230℃，電離方式：標(biāo)準(zhǔn)EI源，電子能量：70 eV，質(zhì)量范圍（m/z）：30～450 m/z，延遲時(shí)間：5 min，掃描間隔：0.58 s，數(shù)據(jù)分析采用NIST質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)。

2 結(jié)果

2.1 各樣品離子流圖及分析結(jié)果

按上述氣相色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)NIST質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索和人工譜圖分析確認(rèn)各化合物［10-13］，總離子流圖如圖1、圖2、圖3。通過對比含藥血漿離子流圖和脂肪油離子流圖指認(rèn)5個(gè)入血原型成分［3，5-二（1，1-二甲基乙基）苯酚、軟脂酸甲酯、油酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、乙酸（6Z，13Z）-十八碳烯酯］和3個(gè)可能為九香蟲脂肪油的體內(nèi)代謝物，即烯丙基草酸壬酯、（11，14）-二十碳二烯酸甲酯、四環(huán)素［7.1.0（1，6）·0（4，9）·0（8，10）］癸烷，這些入血成分可能為九香蟲發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過空白血漿和含藥血漿共有成分比對，發(fā)現(xiàn)軟脂酸和14-甲基十五烷酸也是血漿中的固有物質(zhì)即內(nèi)源性成分（見表1）。

圖1 空白血漿離子流圖

圖2 含藥血漿離子流圖

表1 GC-MS鑒定的九香蟲脂肪油入血成分及代謝產(chǎn)物

圖3 九香蟲脂肪油離子流圖

3 討論

本研究通過對比含藥血漿離子流圖和脂肪油離子流圖指認(rèn)了5個(gè)入血原型成分［3，5-二（1，1-二甲基乙基）苯酚、軟脂酸甲酯、油酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、乙酸（6Z，13Z）-十八碳烯酯］和3個(gè)可能為九香蟲脂肪油體內(nèi)代謝物，即烯丙基草酸壬酯、（11，14）-二十碳二烯酸甲酯、四環(huán)素［7.1.0（1，6）·0（4，9）·0（8，10）］癸烷，這些入血成分可能為九香蟲發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

九香蟲中的脂肪酸主要含有油酸、亞油酸、軟脂油酸、軟脂酸、硬脂酸、亞麻酸、豆蔻酸、十四碳一烯酸、花生酸、二十二酸、芥酸、二十二碳二烯酸、二十四酸等［2，10-13］。涂愛國等［11］研究認(rèn)為含量排序依次為油酸（44.17%）、亞油酸（21.48%）、軟脂酸（20.28%）；李俐等［12］認(rèn)為含量以油酸（49.48%）和軟脂酸（41.54%）為主；劉倫沛等［14］測得含量較多的為軟脂油酸（24.14%）、軟脂酸（24.03%）和油酸（20.41%）；課題組前期超臨界萃取的脂肪油中主要含有油酸（33.75%）、軟脂酸（8.38%）、亞油酸（19.91%）［9］。

本研究表明在5個(gè)入血原型成分中，在原藥材中含量較高的軟脂酸甲酯、油酸甲酯也有檢出，與文獻(xiàn)中提到脂肪酸的主要成分一致，其中軟脂酸同時(shí)也為血液中內(nèi)源性成分。目前認(rèn)為游離脂肪酸中的軟脂酸通過下調(diào)Bcl-2，抑制抗凋亡能力，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力下降［15］；并能夠誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡［16］。而游離脂肪酸中的油酸可參與糖脂代謝，改善外周組織對葡萄糖的攝取，誘導(dǎo)胰島素的產(chǎn)生和分泌，并抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）的活性，而TNF-α可引起外周組織胰島素抵抗，抑制胰島素分泌；除調(diào)節(jié)機(jī)體代謝外，油酸在人體還發(fā)揮著保護(hù)心血管、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、改善氧化應(yīng)激等多種重要功能［17］。推測九香蟲脂肪油抗?jié)冏饔门c油酸的上述藥理作用有關(guān)，但油酸與消化性潰瘍的直接關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

本研究確認(rèn)的5個(gè)入血原型成分中，乙酸（6Z，13Z）-十八碳烯酯結(jié)構(gòu)類似物（3Z，13Z）-3，13-octadecadien-1-ol被發(fā)現(xiàn)具有生物性信息素作用［18］，是東北亞地區(qū)常見的一種扁桃害蟲-雙葉李雌性吸引雄性的關(guān)鍵，而14-甲基十五烷酸甲酯、乙酸（6Z，13Z）-十八碳烯酯的生物活性尚不明確，其他代謝產(chǎn)物烯丙基草酸壬酯、（11，14）-二十碳二烯酸甲酯、四環(huán)素［7.1.0（1，6）·0（4，9）·0（8，10）］癸烷的生物活性及代謝途徑也尚不明確。

研究表明多種植物油脂和動(dòng)物油脂具有較好的抗實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍作用［7，19-20］，但由于脂肪酸中物質(zhì)組成復(fù)雜、內(nèi)源性成分干擾等問題，對其體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究尚屬空白，有待進(jìn)一步深入研究。另外如何趨利避害，分離提取油脂中有益健康的成分進(jìn)行中成藥的研究，應(yīng)成為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。