厚樸酚對(duì)脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積蓄的作用及機(jī)制研究

鐘艷花，林 重，鐘映芹，唐東暉

（廣州市荔灣區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州510140）

代謝相關(guān)脂肪性肝病（metabolism related fatty liver disease，MAFLD），曾用名非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關(guān)肝硬化。隨著肥胖及其相關(guān)代謝綜合征全球化的流行趨勢(shì)，代謝相關(guān)脂肪性肝病現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)富裕地區(qū)慢性肝病的重要病因，MAFLD患病率10%～30%，嚴(yán)重危害人民健康。但是由于MAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，在一定程度上限制了MAFLD的臨床治療和藥物開(kāi)發(fā)。

藿樸夏苓湯組方源自《醫(yī)原》，方由廣藿香、厚樸（姜制）、半夏（制）、茯苓、杏仁、薏苡仁、白蔻仁、淡豆豉、澤瀉和通草組成，具有理氣化濕、疏表和中之功效，與NAFLD的病機(jī)特點(diǎn)相吻合，臨床用于濕溫初起濕重于熱者，是臨床常用治濕之良劑，廣泛用于肝膽、胃腸道濕熱證［1－5］。課題組近期研究顯示，藿樸夏苓湯具有改善血脂代謝異常、抗炎等藥理作用［6－9］，發(fā)揮顯著降脂、保肝、抗MAFLD作用［10］，但目前關(guān)于其降脂、抗MAFLD的藥理機(jī)制以及物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本研究旨在細(xì)胞水平上觀(guān)察藿樸夏苓湯主要成分對(duì)PPARα信號(hào)的影響，探討藿樸夏苓湯降脂、抗MAFLD的作用機(jī)制及其物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 油酸（OA，批號(hào)：O108485）、棕櫚酸（PA，批號(hào)：P101061）、非諾貝特（批號(hào)：F129682），阿拉丁化學(xué)生物試劑公司；廣藿香醇（批號(hào)：P0279）、厚樸酚（批號(hào)：P0223）、琥珀酸（批號(hào)：P0928）、甘油三油酸酯（批號(hào)：P0915）、茯苓酸（批號(hào)：P0734）、苦杏仁苷（批號(hào)：hzm4145）、乙酰澤瀉醇A（批號(hào)：YRA1687）等對(duì)照品，上海純優(yōu)生物科技有限公司；HepG2和HEK293T細(xì)胞株均購(gòu)于上海紀(jì)寧細(xì)胞庫(kù)中心；FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)：E2691）、pCDNA3.1（批號(hào)：E1751）、pCDNA3.1－h(huán)PPARα（批號(hào)：FXC03156）、pCDNA3.1－CPT1α－luc（批號(hào)：C395A）和pGL3－CMV Renilla（批號(hào)：E2231），美國(guó)Promega公司；PPARαsiRNA（批號(hào)：sc－36308）和Control siRNA質(zhì)粒（批號(hào)：sc－37007），美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；甘油三酯（TG）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：A110－1－1），中國(guó)南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒（批號(hào)：200506），中國(guó)寶成生物工程（大連）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：20200612），大連寶成TAKARA公司。TaqMan Gene Expression Master Mix的real－time PCR反應(yīng)液（批號(hào)：20200411）、實(shí)驗(yàn)使用的TaqMan探針包括PPARα探針（批號(hào)：Hs00947538_m1）、CPT1－α探針（批號(hào)：Hs00912671_m1）、ACO探針（Hs01074241_m1）、FAS探針（Hs00188012_m1）、CD36探針（Hs01074241_m1）、FABP1探針（Hs00155026_m1）、FATP2探針（Hs 01587915_m1）和GAPDH探針（批號(hào)：Hs02786624_g1），美國(guó)ABI公司；PPARα抗體（批號(hào)：ab215270），英國(guó)Abcam公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 StepOne Plus Real－time實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司。BDU－700核酸蛋白分析儀，美國(guó)Beckman公司。KDC－120HR高速冷凍離心機(jī)，中國(guó)安徽中科中佳科技儀器有限公司。BT3000全自動(dòng)生化分析儀，意大利愛(ài)康公司。Enspire plus多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)PerkinElmer公司。BX53奧林巴斯熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于37℃含5.0%CO2的孵箱，細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%FBS、100μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基。HepG2按1×106種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組（DMSO）、模型組、厚樸酚低、中、高劑量組（2.5，10，40μmol/L）和非諾貝特組（10 μmol/L）。模型組采用OA+PA（2∶1，1 mmol/L）誘導(dǎo)24 h模擬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積蓄模型，對(duì)照組給予相應(yīng)的生理鹽水。各組細(xì)胞分別預(yù)先給予相應(yīng)藥物作用24 h后，隨后加入OA+PA誘導(dǎo)24 h。

1.2.2 CPT1α－luc熒光素酶報(bào)告基因活性分析在反式激活實(shí)驗(yàn)中，HEK293T細(xì)胞按1×104種于96孔板中，貼壁后，細(xì)胞采用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCDNA3.1、pCDNA3.1－h(huán)PPARα（100 ng/孔）、pCDNA3.1－CPT1α－luc（200 ng/孔）和pGL3－CMV Renilla熒光素酶質(zhì)粒（10 ng/孔，對(duì)照質(zhì)粒）12 h，然后分別加入DMSO（對(duì)照組）、非諾貝特（終濃度10μmol/L）、廣藿香醇（終濃度10μmol/L）、厚樸酚（終濃度10μmol/L）、琥珀酸（終濃度10μmol/L）、甘油三油酸酯（終濃度10μmol/L）、茯苓酸（終濃度10μmol/L）、苦杏仁苷（終濃度10μmol/L）和乙酰澤瀉醇A（終濃度10μmol/L）作用24 h后，采用Enspire plus多功能酶標(biāo)儀，按照Promega雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)的方法，測(cè)定各組熒光素酶報(bào)告基因活性。1.2.3 免疫熒光分析厚樸酚對(duì)PPARα核易位的影響 HepG2按1×104種于24孔板中，貼壁后，加入厚樸酚作用24 h后，隨后加入OA+PA誘導(dǎo)24 h。采用PBS沖洗3次，細(xì)胞加入10%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，加入0.5%Triton X－100/PBS溶液通透10 min，PBS沖洗3次，加入5%BSA封閉30 min后，加入PPARα1抗（1∶200），4℃搖床孵育過(guò)夜。PBS沖洗3次，加入FITC熒光2抗，37℃避光孵育30 min后，PBS沖洗3次，加入0.5μg/mL的DAPI孵育5 min，PBS沖洗3次后，鏡檢。

1.2.4 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn) 靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的獲取和預(yù)處理：從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載PPARα的三維晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：3ET1；網(wǎng)址：https：//www.rcsb.org/search），并導(dǎo)入分子對(duì)接軟件MOE（2008.10版本），去除不相關(guān)的配體和水分子，在pH7和溫度300K下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行Protonate 3D加氫和加電荷處理以及能量最小化操作。

小分子配體構(gòu)建和預(yù)處理：從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載厚樸酚三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)MOE軟件對(duì)所有分子進(jìn)行加氫和能量最小化處理，保存。

分子對(duì)接：為了預(yù)測(cè)受體和配體的結(jié)合能力，選擇AMBER10：EHT力場(chǎng)以及R－field隱式溶劑模型進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接過(guò)程采用induced fit模式和Triangle Matcher放置函數(shù)，其中結(jié)合口袋的側(cè)鏈可以根據(jù)配體構(gòu)象自動(dòng)調(diào)整，約束側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)的重量設(shè)置為10，最后通過(guò)Londond G和GBVI/WSAdG評(píng)分功能進(jìn)行打分，打分越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，并通過(guò)氨基酸殘基結(jié)合的數(shù)目評(píng)價(jià)化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合活性。

1.2.5 厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)水平的影響 HepG2細(xì)胞采用PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，60%異丙醇分化3 min，加入新鮮配制的油紅O染色液（油紅儲(chǔ)存液－去離子水3∶2）染色20 min，洗去多余染料，蘇木素染核30 s，蒸餾水沖洗數(shù)次后置于顯微鏡下觀(guān)察并拍照。將各組細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞，按照TG檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG含量。

1.2.6 Real－time PCR測(cè)定細(xì)胞中脂質(zhì)合成、吸收、氧化分解相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平 HepG2細(xì)胞采用PBS沖洗2次，采用Trizol試劑提取、純化細(xì)胞總mRNA，并測(cè)定其濃度及純度。采用大連寶成TAKARA公司的cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用StepOne Plus Real－time實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)，測(cè)定細(xì)胞中PPARα、CPT1－α、ACO、FAS、CD36、FABP1和FATP2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。Real－time PCR反應(yīng)體系：cDNA模板5μL，Taq－Man探針1μL，ddH2O 4μL，TaqMan Fast Advanced Master Mix 10μL，總體積20μL。用StepOne Plus熒光定量分析儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃2 min；95℃5 s、60℃30 s讀板，40個(gè)循環(huán)。記錄各組樣品擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2－△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 PPARα敲減實(shí)驗(yàn)研究 HepG2按1×106種于6孔板中，貼壁后，采用FuGENE6試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PPARαsiRNA和Control siRNA質(zhì)粒12 h后，加入厚樸酚作用24 h后，隨后加入OA+PA誘導(dǎo)24 h。按“1.2.3項(xiàng)”和“1.2.6”項(xiàng)進(jìn)行處理，分別測(cè)定細(xì)胞脂質(zhì)蓄積、TG含量以及脂質(zhì)合成、吸收、氧化分解相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 藿樸夏苓湯代表性化學(xué)成分對(duì)PPARα信號(hào)的影響

為了找尋激動(dòng)PPARα的成分，對(duì)藿樸夏苓湯中代表性化學(xué)成分進(jìn)行了CPT1α－luc熒光素酶報(bào)告基因活性分析。如圖1～4所示，與對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照藥非諾貝特和厚樸酚顯著提高CPT1α－luc熒光素酶報(bào)告基因活性，提示厚樸酚可激動(dòng)PPARα信號(hào)。分子對(duì)接結(jié)果顯示厚樸酚通過(guò)Cys276、Lys358、Thr279等氫鍵方式與PPARα的LBD進(jìn)行分子－蛋白質(zhì)相互作用。

圖1 藿樸夏苓湯代表性化學(xué)成分CPT1α－luc熒光素酶報(bào)告基因活性分析

此外，與對(duì)照組比較，厚樸酚中、高劑量組可顯著提高PPARα及其下游靶基因CPT1－α的mRNA表達(dá)水平（P〈0.05，P〈0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫熒光分析顯示厚樸酚呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性提高HepG2細(xì)胞內(nèi)PPARα的蛋白水平，并促進(jìn)PPARα核易位作用。

以上結(jié)果提示厚樸酚可激動(dòng)PPARα信號(hào)，可能是藿樸夏苓湯降脂、抗MAFLD作用的關(guān)鍵成分。

圖2 厚樸酚與PPARα的LBD分子對(duì)接結(jié)果

圖3 厚樸酚對(duì)PPARα和CPT1α的mRNA表達(dá)水平的影響

2.2 厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)水平的影響

油紅染色實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，模型組中HepG2細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集和TG水平明顯增加，表明OA+PA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積增加。與模型組比較，厚樸酚中、高劑量組均可明顯降低細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集和細(xì)胞內(nèi)TG水平（P〈0.05，P〈0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，厚樸酚可顯著降低OA+PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積作用。結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖4 免疫熒光分析厚樸酚對(duì)PPARα核易位的影響

圖5 厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集的影響

圖6 厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響

2.3 厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化代謝相關(guān)基因的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)主要脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因（FAS、CD36、FABP1和FATP2）的mRNA表達(dá)水平著升高，而脂質(zhì)氧化代謝基因（PPARα、CPT1－α和ACO）則顯著降低（P〈0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，厚樸酚中、高劑量組可顯著抑制OA+PA誘導(dǎo)的脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因FAS、CD36、FABP1和FATP2的基因表達(dá)，而提高脂質(zhì)氧化代謝基因PPARα、CPT1－α和ACO的表達(dá)（P〈0.05，P〈0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。結(jié)果表明，厚樸酚可以上調(diào)PPARα核受體表達(dá)水平，導(dǎo)致提高OA+PA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化代謝作用和降低脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)作用。

圖7 厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的mRNA表達(dá)水平的影響

圖8 厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化代謝基因的mRNA表達(dá)水平的影響

2.4 敲減PPARα后，厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平積蓄作用的影響

為了驗(yàn)證PPARα信號(hào)在厚樸酚降脂、抗MAFLD作用中的重要性，我們進(jìn)行了細(xì)胞水平的PPARα敲減作用。在Control siRNA（si－Control）組中，與模型組比較，厚樸酚高劑量組明顯降低細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集和細(xì)胞內(nèi)TG水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05，P〈0.01）。相反，在PPARαsiRNA（si－PPARα）組中，當(dāng)敲減HepG2細(xì)胞內(nèi)PPARα，與模型組比較，高劑量組厚樸酚失去了降低細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集和細(xì)胞內(nèi)TG水平的作用，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。結(jié)果表明，厚樸酚降低OA+PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積作用依賴(lài)于PPARα的表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖9和圖10。

圖9 敲減PPARα后，厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集的影響

圖10 敲減PPARα后，厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響

2.5 敲減PPARα后，厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化代謝相關(guān)基因的影響

在si－Control組中，與模型組比較，厚樸酚高劑量組可明顯抑制OA+PA誘導(dǎo)的脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因FAS、CD36、FABP1和FATP2的基因表達(dá)，而提高脂質(zhì)氧化代謝基因PPARα、CPT1－α和ACO的表達(dá)（P〈0.05，P〈0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反，在si－PPARα組中，當(dāng)敲減HepG2細(xì)胞內(nèi)PPARα的表達(dá)，與模型組比較，高劑量組厚樸酚失去了對(duì)上述脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化代謝相關(guān)基因的調(diào)控作用，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖11和圖12。結(jié)果表明，厚樸酚降低OA+PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化代謝相關(guān)基因的調(diào)控作用依賴(lài)于PPARα的激動(dòng)作用。

圖11 敲減PPARα后，厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的mRNA表達(dá)水平的影響

圖12 敲減PPARα后，厚樸酚對(duì)OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化代謝基因的mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

代謝相關(guān)脂肪性肝病（MAFLD）是一種常見(jiàn)肝臟脂肪代謝異常誘發(fā)的代謝類(lèi)疾病，是一個(gè)亟待解決的全球性公共健康問(wèn)題。其主要表現(xiàn)為甘油三酯（TG）以脂滴的形式在肝細(xì)胞中異常積累［11－12］，通常而言，肝臟脂肪變性可進(jìn)一步發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎、肝硬化，甚至肝癌［11－12］。

MAFLD發(fā)生發(fā)展的核心是肝臟脂質(zhì)異常沉積，主要由于脂肪酸β氧化分解不足或脂質(zhì)合成吸收過(guò)度導(dǎo)致［13－14］。該過(guò)程主要由于受損肝細(xì)胞核受體轉(zhuǎn)錄因子PPARα失去對(duì)下游參與肝細(xì)胞脂質(zhì)的合成、攝取/轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪酸氧化等相關(guān)基因（合成基因ACC、FAS、SCD1等，攝取/轉(zhuǎn)運(yùn)基因CD36、FATP1等，脂肪酸氧化基因CPT1－α、LCAD、MCAD、ACO等）的調(diào)控作用［13－15］。臨床研究顯示，與健康志愿者比較，MAFLD患者肝臟組織的PPARα及其氧化代謝基因顯著降低，而脂質(zhì)合成和吸收基因則升高［16］。相似地，小鼠肝臟缺失PPA－Rα基因?qū)е绿岣吒闻K脂質(zhì)沉積的敏感性［17］。相反，貝特類(lèi)藥物藥理性活化PPARα則顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)堆積作用［18］，提示了PPARα激動(dòng)劑在MAFLD治療中的重要作用。然而，盡管非諾貝特作為臨床一線(xiàn)常用PPARα激動(dòng)劑顯示出較好的改善MAFLD作用，但存在安全性、副作用等問(wèn)題［19］，在一定程度上限制了廣泛應(yīng)用。因此，找尋、開(kāi)發(fā)低毒、有效的PPARα激動(dòng)劑在治療MAFLD中意義重大。

藿樸夏苓湯“理氣化濕、疏表和中”，切中MAFLD病機(jī)，臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示良好的保肝、降脂、抗炎、抗MAFLD作用［1-10］，但抗MAFLD藥理作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)不明。為了闡釋其抗MAFLD作用，我們首先通過(guò)對(duì)方中的代表性成分進(jìn)行篩選，如廣藿香醇（廣藿香的主要成分）、厚樸酚（厚樸的主要成分）、琥珀酸（半夏的主要成分）、甘油三油酸酯（薏苡仁的主要成分）、茯苓酸（茯苓的主要成分）、苦杏仁苷（杏仁的主要成分）、乙酰澤瀉醇A（澤瀉的主要成分），并對(duì)這些成分進(jìn)行反式激活實(shí)驗(yàn)研究，篩選PPARα激動(dòng)劑。研究結(jié)果表明厚樸酚可提高CPT1α-luc熒光素酶報(bào)告基因活性，通過(guò)氫鍵形式加強(qiáng)厚樸酚與PPARα的LBD域進(jìn)行互作，促進(jìn)PPARα核易位，導(dǎo)致提高PPARα及其下游靶基因CPT1-α的表達(dá)，并抑制脂質(zhì)合成和吸收基因的表達(dá)，顯著改善OA+PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。我們的研究結(jié)果與Tian Y等報(bào)道相一致［20］。

為了進(jìn)一步闡述厚樸酚降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積作用依賴(lài)于PPARα的激動(dòng)效應(yīng)，我們隨后進(jìn)行了HepG2細(xì)胞PPARα敲減實(shí)驗(yàn)。研究顯示PPARα敲減后，厚樸酚對(duì)脂質(zhì)氧化分解基因和脂質(zhì)合成、吸收等基因無(wú)明顯的調(diào)控作用，進(jìn)而損害厚樸酚降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的作用，證實(shí)厚樸酚降脂作用是依賴(lài)于與PPARα的參與。

CPT1-α和ACO均是脂質(zhì)氧化分解過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，分別催化線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶體β氧化［21］。研究表明，PPARα的激活能誘導(dǎo)線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶體中與脂質(zhì)氧化相關(guān)的一系列基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低肝臟脂質(zhì)水平［18］，通過(guò)肝細(xì)胞特異性的過(guò)氧化物酶體基因敲除或抑制ACO活性會(huì)導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)蓄積［22］。本研究顯示，OA+PA誘導(dǎo)顯著降低PPARα、CPT1-α和ACO的表達(dá)，這些結(jié)果表明，脂質(zhì)的蓄積可能會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化能力受損，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)積累。經(jīng)厚樸酚處理后，PPARα、CPT1和ACO的表達(dá)均升高，提示厚樸酚可通過(guò)PPARα途徑增加肝細(xì)胞脂質(zhì)氧化能力，在一定程度上減輕肝細(xì)胞脂肪積蓄。

另一方面，肝臟對(duì)循環(huán)脂肪酸的吸收/轉(zhuǎn)運(yùn)主要依賴(lài)于FAS、CD36、FABPs、FATPs，F(xiàn)AS是脂肪酸合成限速酶，其活性或基因表達(dá)的增加可以促進(jìn)脂肪的合成。有研究表明，MAFLD患者肝臟中FAS、CD36、FABP1表達(dá)明顯高于正常肝臟組織［23-24］。抑制FAS、CD36和FABP1的表達(dá)則顯著降低肝臟脂質(zhì)沉積，發(fā)揮改善MAFLD作用［25-27］。本研究顯示，OA+PA誘導(dǎo)顯著提高FAS、CD36，F(xiàn)ABP1和FATP2的表達(dá)，表明通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成和吸收作用進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)積累。然而，經(jīng)厚樸酚處理后，F(xiàn)AS、CD36、FABP1和FATP2的表達(dá)均降低，提示厚樸酚可通過(guò)PPARα途徑抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)合成、吸收作用，進(jìn)而減輕肝細(xì)胞脂肪堆積。

綜上所述，本研究在細(xì)胞水平上顯示藿樸夏苓湯成分厚樸酚通過(guò)激動(dòng)PPARα信號(hào)通路，降低脂質(zhì)合成和吸收，并提高脂質(zhì)氧化分解作用，進(jìn)而改善OA+PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪積蓄。