胎盤糖皮質(zhì)激素受體低表達對孕期抑郁模型雌性子代的影響

潘淑敏 曹雄 王志堅

1南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州 510445）；2教育部精神健康研究重點實驗室，粵港澳大灣區(qū)腦科學與類腦研究中心，廣東省重大精神疾病研究重點實驗室，南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學神經(jīng)生物教研室（廣州 510515）

圍產(chǎn)期抑郁癥（perinatal depression，PND）是一種孕產(chǎn)婦非精神病性抑郁發(fā)作，主要臨床表現(xiàn)為：情緒低落、焦慮、育嬰行為減少［1］，在中國大陸地區(qū)人群發(fā)病率高達16.3%［2］。抑郁代際傳遞學說認為母體的抑郁狀態(tài)可傳遞給子代［3-8］，但目前醫(yī)學界對于PND 代際傳遞機制尚未完全闡明。大量研究表明，糖皮質(zhì)激素受體（GR）在抑郁發(fā)作中扮演重要角色［9-13］，但胎盤GR 在PND 代際傳遞鏈胎盤節(jié)點中的作用研究報道相對較少。因此，本研究利用圍產(chǎn)期抑郁模型［14-15］和CYP19A1-Cre+/--EGFP、Nr3c1loxP/loxP轉(zhuǎn)基因小鼠（簡稱：胎盤GR 敲低小鼠），條件性敲低胎盤GR，并制作孕期抑郁小鼠模型，利用模型探索胎盤Nr3c1（編碼GR）基因?qū)σ钟粼惺笞哟钟魞A向的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物胎盤特異性表達CYP19A1-Cre+/--EGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠由本課題組前期研究中制備。Nr3c1loxP/loxP轉(zhuǎn)基因小鼠購于Jackson 實驗室（Cat No.021021）。成年C57BL/6J 小鼠購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，南方醫(yī)科大學實驗動物倫理審查決議編號：L2020101。小鼠均在標準的SPF 級潔凈實驗飼養(yǎng)環(huán)境［環(huán)境溫度為23～27 ℃，濕度（50 ± 10）%，小鼠自由攝取食物和水，自然光照時間為12 h 的光/暗循環(huán)。按照每周一次的頻率給小鼠換籠、添水添糧］。

1.1.2 主要試劑兔抗糖皮質(zhì)激素受體抗體（CST）、山羊抗兔抗體（廣州恒研生物科技有限公司）、鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（美國賽默飛公司）、10%福爾馬林、酒精、二甲苯、GR 及GFP PCR 引物、2 x Premix Tag（Takara）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組（1）對10 只C57BL/6J 小鼠進行抑郁造模，排除因造模因素未孕的2 只小鼠，最后獲得8 只抑郁C57BL/6J 孕鼠（PS 組）和8 只正常妊娠C57BL/6J 孕鼠（CON 組）。在E19.5 天時，分別從8 只抑郁C57BL/6J 孕鼠及8 只正常妊娠孕鼠中取其胎盤組織并保存在-80 ℃冰箱，備用。獲得抑郁C57BL/6J 孕鼠胎盤53 個，正常妊娠C57BL/6J 孕鼠胎盤57 個。經(jīng)過胎鼠性別鑒定后，隨機從PS 組中取6 個雄性胎鼠胎盤（記為PS-male 組），6 個雌性胎鼠胎盤（記為PS-female 組）。從CON 組隨機取6 只雄性胎鼠胎盤（記為CON-male 組），6 只雌性胎鼠胎盤組織（記為CON-female 組）。（2）利用基因敲低工具鼠CYP19A1-Cre-EGFP 小鼠與NR3C1loxp/loxp（GR 編碼基因）小鼠雜交2 代，獲得胎盤GR 敲低小鼠，共20 只。隨機抽取8 只GR 基因敲低鼠（記為KD 組）和8 只正常孕鼠（記為N-KD 組），比較胎盤中GR 的表達量；用剩余12 只胎盤GR 敲低小鼠進行抑郁造模，排除因造模因素未孕的4 只胎盤GR 敲低小鼠，共獲得8 只胎盤GR 敲低的抑郁孕鼠。這些抑郁孕鼠分娩的仔鼠成年后分為GR 敲低組（KD 組）和GR 非敲低組（N-KD 組），其中KD組又分為KD-M（雄性子代組）和KD-F（雌性子代組）；N-KD 組又分為N-KD-M 組（雄性子代組）和NKD-F 組（雌性子代組）。其中KD-M 組7 只，KD-F組11 只，N-KD-M 組12 只以及N-KD-F 組7 只。利用OFT 及FST 檢測各子代小鼠運動能力及抑郁傾向。

1.2.2 利用Western blot 檢測胎盤GR 表達量取孕19.5 天小鼠新鮮胎盤組織，用1×RIPA 裂解液裂解（加入1×PMSF，Sigma）迷宮層組織。測定蛋白濃度，每孔上樣70 μg。通過10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品，并通過轉(zhuǎn)移緩沖液將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在室溫下用含有5%BSA 的1×TBST 封閉膜1 h，然后再用5% BSA（1×TBST）稀釋的一抗（1∶1 000）中4 ℃搖床孵育過夜。用1×TBST 在搖床上清洗3 次5 min。之后，將膜與過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1×TBST 溶液中1∶5 000 稀釋）孵育1 h。1×TBST 洗膜，3 次5 min。使用ECL 化學發(fā)光法（Merck millipore，德國）檢測，Image-lab 計算條帶灰度。

1.2.3 孕期抑郁模型利用圍產(chǎn)期抑郁造模方法雌雄小鼠以2∶1 合籠后，出現(xiàn)陰道栓記為E0.5 d，并把該鼠單籠飼養(yǎng)。自E7.5 d 開始以7 d 為一個循環(huán)，分別給予不同的刺激。即從13 p.m.至14 p.m.，將E7.5 d 孕鼠暴露在充滿狐貍氣味（1∶5 000 2，4，5-trimethylthiazole；Acros Organics）鼠籠內(nèi)；次日將該孕鼠束縛在50 mL 帶孔離心管中，持續(xù)15 min；從E9.5 至E13.5 d，孕鼠依次給予以下刺激：36 h 持續(xù)光照、暴露在白噪音黑箱中12 h（從8 p.m.至次日8 a.m.）、換3次新籠環(huán)境（9 a.m.、12 p.m.及15 p.m.）、在23 ℃濕籠中過夜、往鼠籠內(nèi)置入一顆直徑2.5 cm透明玻璃珠，次日8 a.m.取出。從E14.5 至E19.5 再次依次給予上述刺激。

1.2.4 利用PCR 對實驗小鼠行性別及基因鑒定取E19.5 胎鼠鼠尾，利用TRUETT［16］的HotShot 法提取其DNA。根據(jù)標準PCR方法行基因鑒別。鑒別胎鼠性別［17］所用到的引物如下所述：5′-TGAAGCTTTTGGCTTTGAG-3′及5′-CCGCTGCCAAATTCTTTGG-3′。CYP19A1-Cre-EGFP，5′-ACCCTCGTGACCACCCTGACCTAC-3′及5′-GACCATGTGATCGCGCTTCTCGTT-3′。鑒別Nr3c1loxP/loxP所用到的引物如下：5′-ATGCCTGCTAGGCAAATGAT-3′及5′-TTCCAGGGCTATAGGAGGCA-3′。行小鼠性別鑒別時，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中，單個泳道僅出現(xiàn)331 bp的條帶提示雌性，同時有331 bp 條帶和302 bp 條帶提示雄性；行CYP19A1-Cre-EGFP 基因鑒定時，泳道出現(xiàn)484 bp 條帶提示攜帶CYP19A1-Cre-EGFP 基因；行Nr3c1loxP/loxP基因鑒定時，單個泳道中同時出現(xiàn)兩條300 bp 條帶，提示純合子。單個泳道中出現(xiàn)一條300 bp及247 bp條帶，則為雜合子。本研究僅采用純合子小鼠。

1.2.5 利用H&E 染色分析胎盤結(jié)構(gòu)分別取E13.5 天Nr3c1loxP/loxP轉(zhuǎn)基因小鼠胎盤及胎盤GR 敲低小鼠胎盤，經(jīng)過石蠟包埋、石蠟切片及HE 染色，獲得Nr3c1loxP/loxP及胎盤GR 敲低小鼠胎盤玻片。委托廣州百奧賽生物科技有限公司行玻片全圖掃描。

1.2.6 小鼠體重收集用胎盤GR 敲低小鼠與Nr3c1loxP/loxP雄性小鼠以2∶1 合籠，雌鼠出現(xiàn)陰道栓后單籠飼養(yǎng)，E7.5 天開始行孕期抑郁造模直至E19.5 天。待仔鼠出生后，在其出生當天、整周鼠齡時用電子天平測量體質(zhì)量，直至8 周鼠齡。對每只仔鼠做標記，并用PCR 鑒定仔鼠基因型。

1.2.7 利用曠場實驗（open field test，OFT）檢測小鼠運動能力OFT 是用于評價動物自發(fā)活動的經(jīng)典行為實驗?？赏ㄟ^檢測小鼠在相同條件下的運動距離來檢測小鼠的運動能力。實驗前將孕期抑郁的胎盤GR 敲低小鼠的成年仔鼠放在安靜的實驗環(huán)境中適應30 min。將成年仔鼠放于長50 cm，寬50 cm 曠場中央。利用Versa Max 軟件對成年仔鼠的運動進行捕捉及記錄。前只成年仔鼠實驗完畢均需對曠場進行清潔及消毒，確保去除前只實驗小鼠遺留的糞便、尿液及異味。

1.2.8 利用強迫游泳實驗（forced swimming test，F(xiàn)ST）檢測小鼠精神狀態(tài)FST 開始前需將孕期抑郁的胎盤GR 敲低小鼠的成年仔鼠放置安靜的實驗環(huán)境中適應30 min。將成年仔鼠放于直徑18 cm，高45 cm，水深20 cm，水溫23.5 ℃的透明玻璃容器內(nèi)，利用攝像機及EthoVision XT 軟件對成年仔鼠在水中的運動進行捕捉及記錄。測定6 min 之內(nèi)成年仔鼠漂浮不動的時間（即成年仔鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態(tài)，僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面）。

1.3 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計。計量資料以均數(shù)±標準差表示，比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GR在孕期抑郁小鼠子代胎盤絨毛中的表達與孕期非抑郁小鼠相比，孕期抑郁雌性胎鼠胎盤迷宮層GR 表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001 2，圖1）。

圖1 GR 在小鼠胎盤中的表達情況Fig.1 Expression of GR in mice placenta

2.2 敲低GR 對孕期抑郁小鼠子代胎盤結(jié)構(gòu)的影響胎盤GR 敲低小鼠的獲得過程見圖2A；胎盤GR敲低小鼠胎盤絨毛中GR被顯著敲低（P=0.312），見圖2B。與Nr3c1loxP/loxP小鼠胎盤相比，胎盤GR 敲低的孕鼠胎盤絨毛層未見明顯減小，絨毛組織形態(tài)未見明顯異常，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.576 5），見圖2C-E。以上結(jié)果表明，敲低胎盤GR 不引起胎盤絨毛組織結(jié)構(gòu)缺陷（圖2）。

圖2 敲低GR 對子代胎盤結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of GR knockdown on mice placenta

2.3 敲低GR 對孕期抑郁子代生長發(fā)育的影響雌性的胎盤GR敲低小鼠與雄性Nr3c1loxP/loxP交配。妊娠的胎盤GR敲低小鼠經(jīng)過孕期抑郁造模，分娩的仔鼠經(jīng)過基因鑒定，一部分基因型為CYP19A1-Cre+/--EGFP；Nr3c1loxP/loxP，另一部分基因型為Nr3c1loxP/loxP。前者胎盤GR 被敲低，后者胎盤GR 未被敲低。胎盤GR 敲低后對仔鼠的生長發(fā)育無影響，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05，圖3）。表明敲低胎盤GR 對孕期抑郁小鼠的子代生長發(fā)育無影響。

圖3 敲低GR 對孕期抑郁子代生長發(fā)育的影響Fig.3 Effects of GR knockdown on mice growth and development

2.4 敲低GR 對圍產(chǎn)期抑郁雌性子代抑郁傾向的影響通過OFT 實驗檢測孕期抑郁小鼠子代成年后的運動能力，與胎盤正常表達GR 的孕期抑郁小鼠子代相比，GR 低表達對孕期抑郁小鼠子代成年后的運動能力無影響（圖4A-B）；通過FST 實驗（圖4C-F）檢測胎盤GR 低表達對孕期抑郁小鼠仔鼠成年后精神健康的影響。胎盤GR正常表達的孕期抑郁小鼠仔鼠成年后，雄性較雌性子代抑郁傾向增加，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006 6，圖4E）；同時，本研究也發(fā)現(xiàn)GR 被敲低的孕期抑郁小鼠雌性仔鼠成年后較胎盤GR 未敲低的孕期抑郁小鼠雌性仔鼠成年后抑郁傾向增加，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.021 1，圖4D），而對雄性子代無影響（圖4C）。

圖4 敲低GR 對孕期抑郁小鼠子代精神健康的影響Fig.4 Effects of GR knockdownon the mental health of offspring of perinatal depression mice

3 討論

研究表明，圍產(chǎn)期抑郁患者后代的認知、行為、神經(jīng)內(nèi)分泌及大腦功能均會受到不同程度影響，是抑郁癥、精神分裂癥等精神疾病高危人群［18-22］，但抑郁癥代際傳遞的機制目前仍不清楚。目前PND 代際傳遞的機制可能與傳遞過程涉及的多種分子改變有關［23-24］。

本研究在探索GR 與PND 的代際傳遞關系中發(fā)現(xiàn)，孕期抑郁小鼠子代胎盤GR 表達量存在差異。但同時發(fā)現(xiàn)孕期抑郁小鼠子代胎盤GR 表達量具有性別差異，即PND 小鼠雌性子代胎盤GR 較正常小鼠雌性子代胎盤GR 表達顯著升高，但在雄性子代胎盤中GR 表達未見差異。說明PND 的代際傳遞可能存在性別差異，且胎盤GR 表達的差異是調(diào)節(jié)不同性別間抑郁敏感性的重要因子。為驗證胎盤GR 在PND 代際傳遞中的作用，本研究利用CYP19A1-Cre-EGFP 及Nr3c1 轉(zhuǎn)基因小鼠對胎盤GR 進行條件性敲低，發(fā)現(xiàn)敲低胎盤GR 表達量后，雌性子代抑郁傾向明顯增高，雄性子代與正常小鼠雄性子代相比抑郁敏感性未見差異。進一步驗證了PND 在小鼠代際傳遞中存在性別差異，但具體原因有待進一步研究。

本研究在國內(nèi)外首次利用CYP19A1-Cre+/--EGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠與Nr3c1loxP/loxP交配，多代繁殖后獲得胎盤GR 敲低小鼠，并成功建立PND 小鼠模型，對其子代進行生長發(fā)育及抑郁狀況研究，結(jié)果表明PND 孕鼠子代生長發(fā)育和成年后的運動能力與正常孕鼠子代相比無明顯差異，說明胎盤GR 相關基因敲除不會影響子代體格發(fā)育。但通過FST 實驗證實PND 小鼠模型雌性子代確實存在抑郁表現(xiàn)，表明本研究的PND 孕鼠模型可為之后相關臨床科學研究提供良好工具。本研究利用動物實驗探索GR 在圍產(chǎn)期抑郁癥代際傳的作用，但尚缺乏臨床數(shù)據(jù)研究支持。因此，在后續(xù)研究可通過收集臨床樣本進行研究，進一步驗證實驗結(jié)果。

綜上所述，圍產(chǎn)期抑郁癥的代際傳遞中，胎盤GR 表達水平的性別差異可能是不同性別間罹患抑郁癥風險性不同的重要危險因子，機制尚需進一步研究。本研究提供了PND 孕鼠模型建立方法可以為后續(xù)相關研究提供良好參考依據(jù)。