多酚-蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)研究進展

王珂雯，廖小軍，徐貞貞

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

食品的組成成分復雜，既包括碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)素，還包括多酚、多糖、萜類等活性成分[1]。各組分之間在生產(chǎn)、加工和貯藏等過程中時刻發(fā)生著相互作用，這些作用對食品的顏色、香氣、味道、形態(tài)、營養(yǎng)等屬性有較大影響，因此，食品組分間的相互作用是食品科學研究領(lǐng)域的核心問題之一[2]。目前，國內(nèi)外學術(shù)界對食品組分的相互作用尚未明確的定義，研究人員往往針對不同的食品組分開展研究[3]。本研究以“Food compound”、“Interaction”、“Polyphenol”、“Protein”、“Lipid”、“Carbohydrate”、“Polysaccharide”、“Oligose”、“食品組分”、“相互作用”、“食品成分”、“多酚”、“蛋白質(zhì)”、“脂質(zhì)”、“碳水化合物”、“多糖”、“寡糖”為關(guān)鍵詞，在Google Scholar、Web of Science、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫檢索近五年（2016～2020年）的文獻，其中158 篇文獻研究了食品組分間的相互作用，具體為“多酚-蛋白質(zhì)”、“多酚-多糖”、“風味物質(zhì)-蛋白質(zhì)”、“多糖-蛋白質(zhì)”等的相互作用，其中研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用的文獻數(shù)目占比達三分之一以上，是目前食品組分間相互作用的研究熱點（圖1）[4]。

圖1 近五年食品組分相互作用文獻數(shù)目Fig.1 Number of literatures on food compound interaction in the past five years

就分子相互作用而言，可按照分子量大小（分子量小于1000 Da 的為小分子，大于1000 Da 的為大分子[5]），將研究對象體系分為小分子和小分子、小分子和大分子、大分子和大分子三類；也可按照相互作用力的類型，分為非共價作用力（氫鍵、疏水相互作用、范德華力、靜電相互作用等）和共價作用力（σ 鍵、π 鍵、肽鍵、二硫鍵等）[6]。多酚-蛋白質(zhì)的相互作用屬于小分子和大分子的相互作用，且同時存在非共價作用力和共價作用力，其中，非共價作用力是由氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用、范德華力等形成，對應(yīng)的是可逆過程[7?9]；共價作用力主要是肽鍵和二硫鍵，對應(yīng)的是不可逆過程[10?11]。對于多酚-蛋白質(zhì)相互作用的研究，可以采用直接和間接兩種方式進行（圖2）：直接方式包括使用熒光發(fā)射光譜法、傅里葉變換紅外光譜法、圓二色光譜法、核磁共振光譜法等分析多酚-蛋白質(zhì)形成的復合物，或直接測定蛋白質(zhì)[12]和多酚的含量變化[13]；間接方式包括使用等溫量熱滴定法、差示掃描量熱法計算多酚-蛋白質(zhì)結(jié)合過程中的熱力學參數(shù)，或使用小角度散射、濁度法、動態(tài)光散射法等研究多酚使蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生改變的過程，或使用分子對接、分子動態(tài)模擬的方法，預測多酚-蛋白質(zhì)結(jié)合模式，從而間接證明相互作用的存在[14?15]。單獨使用某一種分析方法只能為研究多酚-蛋白質(zhì)的相互作用提供補充證據(jù)，針對相互作用機制的研究常集合多種方法系統(tǒng)解析多酚-蛋白質(zhì)的相互作用[15?16]。

圖2 多酚-蛋白質(zhì)相互作用分析方法Fig.2 Analysis methods of polyphenol-protein interaction

本文按照直接和間接方式歸納了目前應(yīng)用于多酚-蛋白質(zhì)相互作用的研究方法，并列舉了這些技術(shù)在研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用中的特點和實例，以期為食品科學領(lǐng)域中多酚-蛋白質(zhì)相互作用的相關(guān)研究工作提供技術(shù)支撐，為研究其它食品組分間的相互作用提供參考。

1 多酚-蛋白質(zhì)相互作用的直接分析方式

1.1 熒光光譜法

熒光光譜法廣泛用于研究多酚-蛋白質(zhì)的相互作用。蛋白質(zhì)含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，具有固有的發(fā)射熒光[17]，當多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合后，會造成蛋白質(zhì)固有熒光的淬滅，通過Stern-Volmer 公式計算出淬滅類型，結(jié)合位點數(shù)，進一步通過Van’t Hoff 公式計算出焓變和熵變，判斷作用力類型。Dai 等[18]借助該方法研究了B 型-原花青素二聚體和水稻谷蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)當B 型-原花青素二聚體水平增加時，水稻谷蛋白的熒光強度明顯降低，并且最大峰對應(yīng)的波長只有輕微的變化（約2 nm），這些結(jié)果表明，B 型-原花青素二聚體淬滅了水稻谷蛋白的固有熒光，表明兩者發(fā)生相互作用。在小分子-蛋白質(zhì)相互作用的研究領(lǐng)域，同步熒光光譜經(jīng)常用來研究環(huán)境對熒光基團微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響[18]。當Δλ=15 nm 時，同步熒光光譜顯示酪氨酸殘基的特征熒光；當Δλ=60 nm 時，同步熒光光譜顯示色氨酸殘基特征熒光，而蛋白質(zhì)的氨基酸酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處的微環(huán)境有關(guān)，因此，通過同步熒光光譜可以考察蛋白質(zhì)所處微環(huán)境的情況[19]。

1.2 紫外-可見吸收光譜法

紫外-可見吸收光譜法技術(shù)簡便，用于探索蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化和復合物的形成。蛋白質(zhì)吸收光譜主要有兩個吸收峰：200 nm 處反映蛋白質(zhì)骨架構(gòu)象，280 nm 處反映芳香族氨基酸，通過關(guān)注這兩個波長對應(yīng)的峰形的變化幫助了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，多酚也會對紫外-可見光發(fā)生吸收作用，獲得吸收光譜，從而獲得復合物的信息[17]。

原花青素B3 和溶菌酶相互作用的研究使用了紫外-可見吸收光譜法，其中原花青素B3 在200 nm有較強的光吸收。與溶菌酶相互作用后，在200 nm處的光吸收強度顯著降低，最大吸收波長紅移。結(jié)果表明，由于原花青素B3 與溶菌酶的強結(jié)合，肽主鏈的構(gòu)象展開，微環(huán)境的疏水性發(fā)生變化[20]。進一步的研究表明，280 nm 處的吸光度略有下降，證實了原花青素B3 與溶菌酶的相互作用形成了絡(luò)合物[20]。兩個實驗表明，利用吸光度的變化探究多酚-蛋白質(zhì)的相互作用具有較高的可重復性和準確性。Liu 等[21]發(fā)現(xiàn)在玉米醇溶蛋白-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate,EGCG）體系中，多酚和蛋白質(zhì)化學結(jié)合后產(chǎn)物的吸光度比它們的混合物的吸光度顯著升高，這一現(xiàn)象被認為是共價復合物的形成改變了玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)，使得更多酪氨酸和色氨酸殘基暴露在周圍的溶劑中。

1.3 傅里葉變換紅外光譜法

傅里葉變換紅外光譜法用于研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用引起的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和氫鍵等的變化，可以為多酚-蛋白質(zhì)相互作用提供動態(tài)的結(jié)構(gòu)變化信息。蛋白質(zhì)酰胺帶的紅外光譜可提供其二級結(jié)構(gòu)信息，特征吸收帶主要有酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶，因酰胺Ⅰ帶信號強而被廣泛使用[22]。酰胺Ⅰ帶主要集中在1600～1700 cm?1，展示了蛋白質(zhì)的α-螺旋（1650～1658 cm?1）、β-折 疊（1610～1640 cm?1）、β-轉(zhuǎn) 角（1660～1695 cm?1）和無規(guī)卷曲（1640～1650 cm?1）等結(jié)構(gòu)信息[23]。用紅外光譜法對茶多酚與β-乳球蛋白絡(luò)合物的形成進行了表征，Kanakis 等[24]并未在酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶發(fā)現(xiàn)明顯的峰紅移或藍移，但存在峰高度的變化。Jia 等[25]通過酰胺Ⅰ帶峰值擬合觀察綠原酸、阿魏酸和EGCG 分別與β-乳球蛋白的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)這三種多酚誘導蛋白質(zhì)a-螺旋向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，改變了β-乳球蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.4 圓二色光譜法

圓二色性是由左右圓偏振光的吸附差異引起的，可以顯示蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。遠紫外圓二色光譜（≤250 nm）反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的定量信息，包括α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量等。蛋白質(zhì)的近紫外圓二色光譜（>250 nm）提供其三級結(jié)構(gòu)信息，主要取決于苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸（或S-S 二硫鍵）和色氨酸氨基酸殘基對偏振光的吸收、偶極取向和周圍環(huán)境的性質(zhì)[26]。圓二色光譜法經(jīng)常與其他方法結(jié)合來研究相互作用，獲得結(jié)合常數(shù)、結(jié)合的化學計量數(shù)和其他熱力學參數(shù)，以及洞察這種相互作用引起的復合物結(jié)構(gòu)變化[16]。Paul 等[27]使用圓二色光譜觀察β-乳球蛋白與EGCG 結(jié)合前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。遠紫外圓二色光譜表明，EGCG 與β-乳球蛋白結(jié)合后，使得β-乳球蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變。多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合后會導致蛋白質(zhì)的可消化性的改變。β-折疊的增加不利于胃蛋白酶的消化[28]。這可能是茶、咖啡和可可中的多酚提取物延緩β-乳球蛋白消化的原因[29]。

圓二色光譜法和傅里葉變換紅外光譜法都廣泛用于研究蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，并且方法互補，可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的準確描述[30]。二者的區(qū)別在于，圓二色光譜適合預測液體樣品的α-螺旋結(jié)構(gòu)，而傅里葉變換紅外光譜法適合分析固體和β-折疊[31]。

1.5 拉曼光譜

拉曼光譜作為一種散射光譜，能夠提供快速、簡單、可重復、且無損傷的定性定量分析，用于獲得分子的振動和轉(zhuǎn)動信息，為物質(zhì)鑒定及結(jié)構(gòu)研究提供補充信息[32]。謝鳳英等[33]使用拉曼光譜測定蕎麥多酚對米糠蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)a-螺旋結(jié)構(gòu)含量逐漸降低，β-折疊先增加后降低，β-轉(zhuǎn)角先降低后增加，而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量逐漸增大的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)多酚-蛋白質(zhì)的相互作用破壞了米糠蛋白分子間二硫鍵，降低了米糠蛋白分子間作用，增強了米糠蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。然而，拉曼光譜在多酚-蛋白質(zhì)作用研究主要聚焦在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，當體系只存在多酚時，并沒有特征峰的出現(xiàn)。Liu 等[34]對負載白藜蘆醇和姜黃素的納米顆粒進行拉曼光譜分析，并未觀察到多酚官能團特征峰。

成像面前后位置，光柵像平面模糊，其光強分布Id(x,y;di)可由光柵在像平面的光強分布I0x(x,y)與位置di處的系統(tǒng)點擴散函數(shù)h(x,y,di)的卷積得到，表示為

1.6 核磁共振波譜法

核磁共振波譜法通過檢測分子結(jié)構(gòu)中標記的碳元素的化學位移，直接表明多酚與蛋白質(zhì)是否發(fā)生結(jié)合作用和相關(guān)構(gòu)象的改變[35]。核磁共振光譜法可精確識別結(jié)合位點信息，解釋相互作用機理，分析相互作用構(gòu)效關(guān)系[36]。Faurie 等[37]使用EGCG 滴定，并保持在滴定過程中唾液肽濃度恒定，獲得了蛋白質(zhì)質(zhì)子化學轉(zhuǎn)移的信息，從而得到關(guān)于結(jié)合位點和聚合體類型的信息。Silva 等[38]利用核磁共振光譜法研究單寧和唾液蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用與單寧結(jié)構(gòu)及疏水性有關(guān)；此外，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中某些特定氨基酸，如脯氨酸，起到穩(wěn)定疏水性堆疊的作用，也會影響單寧與唾液蛋白的相互作用。

1.7 顯微鏡觀察法

關(guān)于多酚-蛋白質(zhì)相互作用的顯微觀察方法，主要有原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡，這些顯微鏡觀察法為直接觀察多酚-蛋白質(zhì)相互作用提供支持，對樣品適應(yīng)性較強，利于結(jié)構(gòu)解析。

原子力顯微鏡是在掃描隧道顯微鏡的基礎(chǔ)上研制而成的一種掃描探針顯微鏡，通過探針與被測樣品之間的微相互作用（原子力）獲得物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)及表面信息，進而對樣品表面結(jié)構(gòu)進行觀察，常用于研究分子間的相互作用，如表征多酚與蛋白質(zhì)間的相互作用[39]。該方法能提供三維表面圖，具有樣品制備簡單、無需覆蓋導電薄膜、成像分辨率高的特點，但是也存在一定的缺陷，如成像范圍小、速度慢、受探頭影響較大等[40]。Liu 等[41]使用原子力顯微鏡觀察90 ℃的熱處理前后，綠原酸和EGCG 分別與乳鐵蛋白的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)這兩種多酚均可以抵抗加熱造成的乳鐵蛋白聚集，其中，綠原酸的作用更為明顯，這一結(jié)果為擴大乳鐵蛋白在食品中的應(yīng)用提供可能。上述結(jié)果表明，原子力顯微鏡是一種有效的跟蹤蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象的方法。

掃描電子顯微鏡通過電子束射到樣品表面產(chǎn)生次級電子，次級電子富集后轉(zhuǎn)變成電信號，從而得到樣品表面結(jié)構(gòu)的立體掃描圖像、微觀形貌放大像、表面組成分布、晶體的晶向和晶格常數(shù)、發(fā)光性試樣的結(jié)構(gòu)缺陷等，該方法樣品制備容易，耗時少，可做綜合分析，放大倍數(shù)范圍廣，場深大，但是，掃描電子顯微鏡的分辨率有限，為6～10 nm，不利于較小分子的觀察[42]。Liu 等[21]使用掃描電子顯微鏡，對六羥黃酮、綠原酸、EGCG 三種多酚與玉米醇溶蛋白結(jié)合后的形態(tài)進行表征，發(fā)現(xiàn)三種多酚誘導玉米醇溶蛋白分子的自組裝，并推測多酚改變了多酚和蛋白質(zhì)之間的吸引和排斥作用的大小和范圍，尤其是疏水和靜電相互作用。

激光掃描共聚焦顯微鏡通過共焦光學消除不需要的焦點外散射光，增強樣品的焦點內(nèi)區(qū)域的對比度，可對固定的組織或活體樣本進行亞細胞水平結(jié)構(gòu)的觀測，能夠3D 成像，但是，分辨率比掃描電子顯微鏡低，成本更高[43]。Diaz 等[44]使用激光掃描共聚焦顯微鏡，觀察發(fā)現(xiàn)藍莓汁和紅莓汁中的多酚與蛋白質(zhì)作用形成的顆粒均較小，且形狀規(guī)則，結(jié)合其他實驗結(jié)果，認為藍莓汁多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合的顆?？梢苑€(wěn)定食物功能性成分。Zou 等[45]制備了一種新型玉米醇溶蛋白/單寧酸復合膠體顆粒，依靠激光掃描共聚焦顯微鏡直觀地觀察到油滴被致密的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)包圍。

1.8 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜是一種檢測和鑒定未知分子的方法，這些未知分子的范圍從小分子到納米顆粒。質(zhì)譜在研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用時，不是對單個分子進行檢測，而是對小分子蛋白質(zhì)復合物被電離后的產(chǎn)物進行檢測，用于確定小分子蛋白質(zhì)復合物的結(jié)合位點，是一種靈敏、快速、樣品消耗低、易于自動化，可用于高通量的方法[46]。Gallo 等[47]使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析巧克力多酚與α-乳白蛋白的結(jié)合位點，確定結(jié)合位點為半胱氨酸的游離硫醇基團，這是首次關(guān)于食品多酚與牛奶蛋白共價加和位點的實驗研究。

質(zhì)譜技術(shù)作為一種高通量的測量手段，在研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用方面具有巨大的潛力。全自動nano-ESI-MS 方法主要用于在短時間內(nèi)篩選數(shù)百種潛在候選藥物[48]。此外，親和柱與質(zhì)譜耦合方法有助于找到新的核受體配體[49]。這類技術(shù)在研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用方面也表現(xiàn)出較大的潛力。

2 多酚-蛋白質(zhì)相互作用的間接分析方式

2.1 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法通過計算多酚與蛋白質(zhì)反應(yīng)中的反應(yīng)熱，得到過程中的熱力學參數(shù)[16]。該方法具有如下特點：等溫滴定量熱法的信息在均勻相中產(chǎn)生，沒有標注，保證了方法的準確性；目標物質(zhì)量不影響信號強度，這對于小分子十分有利；缺點在于分析時間長，自動化或高通量篩選能力有限，樣品量大[16]。王寧[50]使用等溫滴定量熱法，計算得到了反應(yīng)的熱力學性質(zhì)，相互作用的化學計量學、親和力常數(shù)、焓變化、熵變化、吉布斯自由能和恒壓摩爾熱容；通過這些數(shù)據(jù)推測綠原酸與三種蛋白的結(jié)合是自發(fā)進行的，結(jié)合過程受到熵驅(qū)動；計算反應(yīng)前后自由能變化的大小，確定人血清蛋白與綠原酸的結(jié)合能力最強，結(jié)合力大小順序為人血清蛋白>胰蛋白酶>胃蛋白酶。此外，等溫滴定量熱法常與其他技術(shù)結(jié)合來研究小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，如茶兒茶素作為過氧化氫酶的抑制劑的可能機制[51]。

2.2 差示掃描量熱法

2.3 散射法

散射法是一類適用于研究多酚與蛋白質(zhì)聚集作用的方法，主要包括小角度散射、濁度法以及動態(tài)光散射法。小角度散射是生物大分子、納米復合材料、合金和合成聚合物結(jié)構(gòu)分析的基本方法[56]。小角度散射包括小角度X 射線散射（Small-angle X-ray scattering,SAXS）和小角度中子散射（Small-angle neutron scattering,SNAS），結(jié)構(gòu)信息的響應(yīng)隨著添加配體或結(jié)合物，以及溶劑的物理和/或化學特性而改變，可以提供分子間折疊和組裝過程的動力學信息[57]。澀味是紅酒等飲品中最重要的感官品質(zhì)之一，是單寧和唾液中富含脯氨酸的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用產(chǎn)生的。在水溶液和膠體水平上，Canon 等[58]使用小角度X 射線散射對黃烷-3-醇和富含脯氨酸蛋白之間的相互作用進行研究，發(fā)現(xiàn)了聚集物具有核狀結(jié)構(gòu)。

濁度法（Nephelometry）通過測量一束光通過含有懸浮顆粒的溶液時，產(chǎn)生的散射光來研究多酚與蛋白質(zhì)的聚集物[59]。多酚含量與濁度值有直接關(guān)系，然而，濁度法的測量受到幾個因素的影響。主要是聚集物的尺寸，該方法要求所有的顆粒應(yīng)該是較小且?guī)缀跸嗤某叽?。因此，為避免形成較大的團聚體，濁度法測定應(yīng)在較短的反應(yīng)時間內(nèi)進行[60]。

動態(tài)光散射法（Dynamic light scattering,DLS）可以幫助解決濁度法中遇到的問題，是一種實時、快速、無損的統(tǒng)計學顆粒粒徑測量方法，并且相對于電鏡法可以對樣品進行原位觀測[61]。Mcrae 等[62]使用動態(tài)光散射觀察，發(fā)現(xiàn)加入B 型-原花青素三聚體后，觀察到蛋白質(zhì)聚集物生成，并且隨著原B 型-原花青素三聚體的進一步增加，聚集物的粒徑緩慢增加，說明B 型-原花青素三聚體與蛋白質(zhì)形成了復合物。

2.4 X 射線衍射法

X 射線衍射是測定分子結(jié)構(gòu)的標準技術(shù)，可用于解析從幾個道爾頓到理論上不受限制的分子量的化學結(jié)構(gòu)，并可用于解析包含不同配合物的分子[63]。X 射線衍射使用X 射線照射源來產(chǎn)生光束（也可以使用電子或中子）被目標樣本衍射，得到的衍射圖樣可以用來重建樣品的三維結(jié)構(gòu)。此方法對樣品要求高，但是要求樣品處于結(jié)晶狀態(tài)[16]。夏雨等[64]使用X 射線衍射法研究不同濃度茶多酚對明膠的改性作用，發(fā)現(xiàn)不同濃度茶多酚與明膠交聯(lián)后蛋白質(zhì)的結(jié)晶面距離均變小，其中，2 g/L 的茶多酚與明膠交聯(lián)后蛋白質(zhì)結(jié)晶面的距離最短，即2 g/L 的茶多酚對明膠的交聯(lián)作用最強。

2.5 生物傳感器

國際純粹與應(yīng)用化學聯(lián)合會（IUPAC）定義生物傳感器是一類將生化信息轉(zhuǎn)換為分析信號的裝置[65]。生物傳感器（Biosensor）根據(jù)轉(zhuǎn)導的信號不同分為電化學傳感器、光學傳感器、聲學傳感器和量熱傳感器（參考2.1 等溫滴定量熱法）。各類傳感器通常需要一個存在相互作用的物質(zhì)，被固定在表面上，用以創(chuàng)造傳感元件，這一物質(zhì)可以是小分子，也可以是蛋白質(zhì)。雖然所有這些基于傳感器的技術(shù)只需要少量的蛋白質(zhì)被固定，但根據(jù)小分子-蛋白質(zhì)相互作用的親和力，需要的小分子數(shù)量可能非常高[66]。

電化學傳感器（Electrochemical transduction sensors）設(shè)備簡單，信號強度不依賴分子大小，包括安培、電位和阻抗傳感器[66]。目前關(guān)于電化學的研究中，大多利用分子間相互作用測定目標物含量。Datta等[67]利用酪氨酸酶和金納米粒子修飾的生物膜，使用電化學傳感器檢測茶葉和葡萄酒中的多酚含量，線性良好。

光傳感器（Optical sensors）中，表面等離子共振生物傳感器具有免標記、高靈敏度、實時定量的特點，可以同時動態(tài)監(jiān)測多個生物分子間的相互作用[68]。當生物分子在表面發(fā)生相互作用后，導致敏感層介電常數(shù)和折射率變化，使得傳感器電磁場變化，最終反映到光電信號的變化上。Guerreiro 等[69]利用超薄的智能分子印跡聚合物捕獲和穩(wěn)定在等離子體傳感器表面的復雜蛋白基質(zhì)，研究了兒茶素、B 型-原花青素二聚體與唾液蛋白的相互作用，該技術(shù)為研究食品中小分子生物利用度提供可能。

在聲傳感器（Acoustic）中會用到電聲裝置，其工作原理是檢測由化學交互材料與壓電材料接觸而制成的薄膜的質(zhì)量密度、彈性、粘彈性、電或介電特性的變化。其中，石英晶體微平衡傳感器通過測量石英晶體諧振器的頻率變化來測量單位面積的質(zhì)量。Naoto 等[70]使用石英晶體微平衡來研究小分子與固定蛋白的結(jié)合，顯示兒茶素與肌鈣蛋白C（心力衰竭的標志）具有較高的親和力。

2.6 界面擴張流變學性質(zhì)的測量方法

界面擴張流變學性質(zhì)能夠反映不同分子在界面層上的吸附和分散行為，對于研究復合體系中各組分間的相互作用具有重要意義，該方法通過比較界面粘彈特性、弛豫過程、界面張力等特征參數(shù)，建立適合于分析不同類型組分的理論模型，具有靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定性良好等特點，能夠直觀地反映出相互作用對加工性能的影響[3]。

Rossetti 等[71]將界面擴張流變學性質(zhì)應(yīng)用于茶多酚與唾液蛋白的相互作用中，發(fā)現(xiàn)兩者間的相互作用隨著多酚的化學結(jié)構(gòu)和酚環(huán)的數(shù)量發(fā)生改變，該研究為揭示食品在口腔中收斂、苦澀等風味的形成機制提供參考。Zou 等[72]利用單寧與玉米蛋白顆粒在空氣-水界面的顆粒相互作用進行研究，發(fā)現(xiàn)玉米蛋白顆粒由于吸附速度快、顆粒間作用力大，導致在界面處覆蓋面積小，形成了較大的團聚體，單寧的氫鍵削弱了顆粒的疏水性，從而削弱了流體界面的顆粒間力，可以降低玉米蛋白顆粒在界面上的吸附和組裝速率，這也為玉米蛋白顆粒重新排列成有序的界面網(wǎng)絡(luò)提供了足夠的時間。

2.7 分子對接

分子對接（Molecular docking,MD）是一種通過硅計算工具計算，模擬分子間相互識別的方法，可確定配體與靶結(jié)合位點的結(jié)合構(gòu)象和結(jié)合的最佳位置、方向，補充了多酚和蛋白質(zhì)結(jié)合的實驗數(shù)據(jù)[73]。分子對接方法允許從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可用的結(jié)構(gòu)中選擇不同的蛋白質(zhì)目標進行大規(guī)模篩選，具體的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫參考魏冬青等[74]的文章。分子對接根據(jù)分子構(gòu)象是否可以改變分為三類，即柔性對接、半柔性對接和剛性對接：柔性對接一般用于精確考慮分子間識別情況，計算耗費最大；半柔性對接常用于處理大分子和小分子間的對接，一般小分子構(gòu)象可變，而大分子構(gòu)象不可變；剛性對接適合大分子和大分子之間的對接[75]。為了使每個多酚都能獨立于每個蛋白質(zhì)已知的配體結(jié)合位點，找到可能的其他結(jié)合位點，可以采用盲對接的方法。在研究蘋果多酚和蛋白質(zhì)相互作用中，Scafuri 等[76]就使用了盲對接的方法，確定了具有最低結(jié)合能的蘋果多酚-蛋白質(zhì)復合物。

2.8 分子動態(tài)模擬

分子動態(tài)模擬（Molecular simulation docking,MSD）是在原子水平上獲取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，具有瞬時清晰度，能夠得到構(gòu)象變化、配體結(jié)合以及蛋白質(zhì)折疊的信息等[77]，用于預測干擾（突變、磷酸化、質(zhì)子化或配體的添加或去除）對生物分子的影響，但是，在模擬過程中共價鍵不會形成和斷裂使得方法具有局限性[78]。Abdulatif 等[8]使用分子對接和分子動態(tài)模擬方法對蘆丁與β-乳球蛋白結(jié)合進行研究。分子對接結(jié)果表明，蘆丁與β-乳球蛋白有兩個結(jié)合位點，并且兩個位點均依靠氫鍵和疏水相互作用。在位點1 處，有6 個氨基酸殘基參與氫鍵作用，13 個氨基酸殘基參與疏水相互作用；在位點2 處，有7 個氨基酸殘基參與氫鍵作用，3 個氨基酸參與疏水相互作用。分子動態(tài)模擬結(jié)果表明，蘆丁與β-乳球蛋白在位點1 處形成了更為穩(wěn)定的復合物，因此，推斷蘆丁與β-乳球蛋白主要在位點1 處結(jié)合。

3 結(jié)語與展望

目前來看，無論是直接分析方式還是間接分析方式，均存在一定的局限性。直接分析方式中，掃描電子顯微鏡[79]和激光掃描共聚焦顯微鏡[43]分辨率不夠高，不利于較小分子的觀察，而原子力顯微鏡分辨率較高，但是成像范圍小、速度慢、受探頭影響較大[40]；質(zhì)譜技術(shù)研究多酚-蛋白質(zhì)形成的復合物，存在電離過程破壞多酚-蛋白質(zhì)之間的相互作用（疏水作用）[16]、分析中峰展寬和離子抑制[80]及小分子質(zhì)量變化被弱化從而影響復合物分析的問題[81]。間接分析方式中，界面擴張流變學性質(zhì)測量方法需要可供食品組分發(fā)生吸附或擴散作用的界面層，但食品基質(zhì)的復雜性決定了并不是每種組分都會在這兩個界面上表現(xiàn)出吸附行為[3]。

而針對食品真實體系中多酚-蛋白相互作用的研究具有重要的食品加工學意義。一方面，多酚-蛋白質(zhì)的相互作用對食品品質(zhì)有積極作用：如多酚可通過與蛋白質(zhì)交聯(lián)提高啤酒泡沫穩(wěn)定性[82]；奶茶中的牛奶蛋白可提高茶多酚的抗氧化能力[83]等。另一方面，多酚-蛋白質(zhì)相互作用對食品品質(zhì)有不利影響：如研究發(fā)現(xiàn)巧克力中的多酚與牛奶蛋白結(jié)合并發(fā)生作用后，降低巧克力多酚的消化吸收以及抗氧化活性[84]；油菜籽多酚常與油菜籽蛋白結(jié)合，導致油菜籽蛋白提取物色澤變暗，產(chǎn)生異味，感官品質(zhì)嚴重下降[85]。大量的前期探索研究主要還在模擬及推演體系中進行，而真實體系中多酚-蛋白質(zhì)的相互作用機制尚未完全明確，并且由于此類相互作用極易受到食品加工條件的影響，探究加工環(huán)境對相互作用的影響具有較大的實際意義。因此，食品復雜體系相互作用的研究對分析方法的準確性和特異性提出了更高的要求，考慮到食品加工環(huán)境的變化，原位檢測分析技術(shù)亟待突破。