納米SiO2富集水樣重金屬鎘-hicELISA檢測方法的建立

周 葉，楊樹宇，高祎琳，陳俊杰，劉長忠，王自良，姜金慶

（河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

重金屬鎘通常以分散的Cd2+狀態(tài)存在于水體等自然環(huán)境，在含水氧化物、有機(jī)物存在時(shí)較活潑，較其他重金屬遷移性強(qiáng)。鎘可通過人們直接飲水、生物食物鏈富集、職業(yè)鎘暴露等途徑進(jìn)入機(jī)體蓄積，最終都會誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，引起人體氧化損傷，誘發(fā)腦神經(jīng)、肺臟、腎臟、骨骼病變，痕量吸入也被認(rèn)為是有害的[1?4]。因此，監(jiān)測水體、食品鎘殘留具有重要意義。世界衛(wèi)生組織（WHO）、國際食品法典委員會（CAC）等國際組織以及多數(shù)國家均發(fā)布了鎘在食品以及水中的限量標(biāo)準(zhǔn)，檢測要求達(dá)到μg/kg 甚至ng/kg 級。這就對重金屬離子的快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測技術(shù)提出了更高的要求。

重金屬離子的檢測通常采用原子吸收與電感耦合等離子體發(fā)射光譜法，樣品需經(jīng)干法灰化、濕法硝化、微波消解等方法去除有機(jī)物等雜質(zhì)，這些方法準(zhǔn)確、靈敏、適合樣品的痕量定量檢測，但樣品前處理要求嚴(yán)格，成本較高[5?8]。電化學(xué)檢測技術(shù)更經(jīng)濟(jì)方便操作性強(qiáng)，但電極材料的穩(wěn)定性差且有毒性，新界面材料的研究不成熟，該方法的靈敏度和檢測限都需要進(jìn)一步提高[9?10]。重金屬鎘離子免疫學(xué)檢測法靈敏度高、檢測限低，但依賴于穩(wěn)定可靠的特異性單克隆抗體[11]，且采用icELISA 檢測時(shí)，樣品鎘含量高于IC80或低于IC20均會出現(xiàn)數(shù)據(jù)不穩(wěn)定現(xiàn)象，而目前痕量重金屬離子免疫學(xué)檢測的樣品富集研究較少；Cd2+-EDTA 與Hg2+-EDTA 三維結(jié)構(gòu)具有高度相似性[12]，離子檢測特異性差的問題亟待解決。本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)上，成功制備抗Cd2+單克隆抗體。通過篩選異源性包被原優(yōu)化檢測體系，建立了實(shí)際水樣中鎘離子殘留hicELISA 檢測方法，提高了檢測的特異性；同時(shí)利用巰基改性納米SiO2做吸附材料，實(shí)現(xiàn)水樣中Cd2+的定量富集，然后以EDTA 競爭洗脫Cd2+，建立了痕量鎘離子富集-hicELISA 檢測體系，有效提高了ELISA 檢測的靈敏度。目前關(guān)于納米SiO2富集重金屬離子并用于免疫學(xué)檢測的研究尚未見報(bào)道，本研究旨在優(yōu)化納米SiO2富集與解吸Cd2+的條件，同時(shí)制備穩(wěn)定的抗Cd2+單抗，進(jìn)一步建立水樣重金屬鎘hicELISA 檢測方法，為實(shí)際生產(chǎn)中鎘離子的快速檢測，提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 μg/mL 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；CdCl2、HgNO3Alfa Aesar 產(chǎn)品；異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA） Dojindo 公司；乙二胺四乙酸（EDTA） Biosail 產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑（freund’s complete adjuvant,FCA）、弗氏不完全佐劑（freund’s incomplete adjuvant,FIA）、聚乙二醇1500（polyethylene glycol,PEG-1500）、細(xì)胞培養(yǎng)基HT、HAT Sigma 公司；雞卵清蛋白（OVA） Solarbio公司；胎牛血清 BI 公司；細(xì)胞培養(yǎng)基RTMI-1640

Gibco 公司；兔抗鼠酶標(biāo)二抗（RaMIgG-HRP） 博爾西公司；SPF 級8 周齡雌性Balb/C 小鼠5 只 河南農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)動物中心供；骨髓瘤細(xì)胞NS0 本實(shí)驗(yàn)室?197 ℃液氮中凍存；巰基改性納米SiO2河南大學(xué)納米材料工程研究中心惠贈。

蛋白質(zhì)核酸分析儀（BD1109） 英國Biodrop 公司；紫外分光光度計(jì)（DU800） 美國Beckman 公司；Optima 2100DV 型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP） 美國 PerkinElmer 公司；多功能全自動酶標(biāo)儀 Thermo 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米SiO2、Cd2+的吸附與解吸試驗(yàn) 參考劉斌等[13]，在聚丙乙烯離心管中加入20 mL 一定濃度的Cd 標(biāo)準(zhǔn)溶液，以30 mg 納米SiO2固體吸附，調(diào)節(jié)pH 至9.0 反應(yīng)，達(dá)到吸附平衡后，離心分離上清液（A 液），沉淀采用去離子水充分洗滌后以0.1 mol/L的EDTA-2Na 重懸反應(yīng)，離心分離上清液（B 液），ICP 法測定上清液中Cd 含量，設(shè)置3 組平行對照求平均值，參考梁達(dá)豪等[14]計(jì)算平衡吸附容量Qe=（C0?Ce）V/m。

1.2.2 人工免疫原的合成與鑒定 參考張海棠等[15]制備Cd-ITCBE-BSA 等人工抗原，稱取4 mg CdCl2，溶于HEPES 制成Cd2+溶液，稱取BSA 溶于HEPES制成蛋白溶液，稱取5 mg ITCBE 溶于DMSO 然后分別于與重金屬離子和蛋白偶聯(lián)，調(diào)節(jié)pH 至9.0，常溫反應(yīng)24 h 后于PBS 中透析3～5 d，去除雜分子和有機(jī)溶劑，收集免疫原，同理合成包被原。采用Bradford 測定合成抗原中的BSA、OVA 含量[16]，ICP 法測定其中Cd2+、Hg2+含量。將樣品稀釋至1 mg/mL，UV 檢測樣品吸收光譜，鑒定抗原的偶聯(lián)情況。

1.2.3 抗Cd2+單抗的制備

1.2.3.1 細(xì)胞融合小鼠的選擇 將Cd-ITCBE-BSA配合佐劑充分乳化，注射到Balb/C 小鼠背部皮下3～4 點(diǎn)，（30 μg/0.2 mL 每只），免疫間隔時(shí)間為4 周。第五次免疫后10 d 斷尾采血，以Cd-ITCBE-OVA 包板，5% 豬陰性血清封閉，ELISA 法檢測抗血清，P/N≥2.1 的最大稀釋倍數(shù)記為效價(jià)；通過比較半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）分析抗血清對半抗原的敏感性，挑選效價(jià)高且敏感性強(qiáng)的小鼠，尾靜脈注射100 μg/0.3 mL（PBS 稀釋）Cd-ITCBEBSA 進(jìn)行加強(qiáng)免疫，用于細(xì)胞融合。

1.2.3.2 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的篩選 參考王亞楠等[17]取上述小鼠脾細(xì)胞與NS0 細(xì)胞在PEG-1500作用下誘導(dǎo)融合，以HAT 培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。待細(xì)胞生長達(dá)到10%～20%，采用ELISA 法檢測細(xì)胞上清效價(jià)與敏感性，確定陽性孔；通過亞克隆培養(yǎng)技術(shù)，篩選出陽性抗Cd-EDTA 單克隆細(xì)胞株。

1.2.3.3 單克隆抗體的生產(chǎn)與鑒定 采用體內(nèi)誘生腹水法制備腹水，以2×105個(gè)細(xì)胞量，注射到FCA 致敏的小鼠腹腔，1 周后收集腹水。將單抗腹水置于4 ℃分層，去上層油脂和下層細(xì)胞雜質(zhì)，以抗體稀釋液作10 倍稀釋，ELISA 法測定單抗的效價(jià)、敏感性，Beaty 非競爭性EIA 法[18]測定抗體的親和力，計(jì)算公式Ka=（n?1）/2（n*Ab1?Ab2），n=Ag1/Ag2。

1.2.4 hicELISA 檢測方法的建立

1.2.4.1 檢測條件的優(yōu)化 包被液選用碳酸鹽緩沖液（CBS），以3% BSA、3% OVA 以及5%的豬陰性血清封閉液包被，鼠陰性血清作一抗，對比不同封閉液的封閉效果?？贵w稀釋液參考王亞楠等[19]選用pH7.4 的PBS。采用棋盤滴定法，確定Hg-ITCBEOVA、Cd-DTPA-OVA、Cd-EDTA-OVA 的最佳包被濃度和抗Cd2+mAb 的最佳稀釋度。

1.2.4.2 hicELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與靈敏度分析參照上述半抗原合成方法，制備Cd-EDTA 標(biāo)準(zhǔn)阻斷液。將阻斷液與工作抗體等體積混合后加入不同酶標(biāo)板中進(jìn)行ELISA 測定，繪制吸光值百分比（B/B0）與阻斷液濃度的常用對數(shù)值（lgс（Cd-EDTA））的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算檢測限IC20～I(xiàn)C80，分析不同包被條件下檢測方法的靈敏度。

1.2.4.3 特異性分析檢測 該抗體與Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+等離子EDTA 螯合液的識別特性，參考周靜清[20]計(jì)算交叉反應(yīng)率，分析hicELISA 檢測方法的特異性。

1.2.4.4 準(zhǔn)確度與精密度分析 選用超純水、自來水和湖水作為樣品液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。向水樣中添加一定濃度的Cd 標(biāo)液，以納米SiO2富集后通過0.45 μm 通用濾膜過濾除雜，EDTA-2Na 洗脫，獲得的Cd-EDTA 用于hicELISA 檢測，計(jì)算該方法的回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用Excel 2019 軟件處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Origin 2019b 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米SiO2 對Cd2+的吸附容量

上清液Cd2+含量均值見表1。納米SiO2對Cd2+的吸附容量Qe可達(dá)到13.28 mg/g，采用0.1 mol/L的EDTA-2Na 洗脫率較高，試樣體積小于20 mL 時(shí)可實(shí)現(xiàn)高濃度Cd2+的定量回收，低濃度Cd2+的完全富集。

表1 納米SiO2 對Cd2+的富集Table 1 Enrichment of Cd2+ and by nano-SiO2

2.2 免疫原鑒定

UV 掃描結(jié)果如圖1。BSA 在230、280 nm 處出現(xiàn)吸收峰，當(dāng)Cd2+與ITCBE-BSA 偶聯(lián)后，吸收峰位置相對BSA 發(fā)生了偏移（在230、270 nm 處），說明人工抗原合成成功。經(jīng)檢測，Cd-ITCBE-BSA 中BSA 的質(zhì)量濃度為6.67 g/L，Cd2+的質(zhì)量濃度為176.7 mg/L。

圖1 人工抗原紫外掃描圖Fig.1 UV spectra of artificial antigen

2.3 抗Cd2+單抗制備與鑒定

2.3.1 小鼠多抗血清檢測 抗血清效價(jià)檢測如圖2，五免小鼠多抗效價(jià)均達(dá)到了1:1.28×104，其中4 號鼠效價(jià)穩(wěn)定達(dá)到1:5.12×104。小鼠多抗icELISA 曲線如圖3，4 號小鼠回歸方程為y=?24.073x+85.119（R2=0.9932），經(jīng)計(jì)算IC50=28.8 μg/L，選擇4 號作為細(xì)胞融合小鼠供體。

圖2 小鼠多抗血清效價(jià)測定Fig.2 Titer determination of mouse polyclonal antibody

圖3 小鼠多抗血清對Cd-EDTA 的抑制曲線Fig.3 Inhibition curve of Cd-EDTA by mouse polyclonal antibody serum

2.3.2 單克隆抗體的生產(chǎn)與鑒定 經(jīng)檢測分析，原96 孔板細(xì)胞融合率>90%，挑選其中三株效價(jià)與敏感性較好的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行三次亞克隆，獲得的單克隆細(xì)胞株命名為3G2E9、3G2E10、2E12D9。傳代細(xì)胞上清效價(jià)檢測如圖4，其中3G2E10 表現(xiàn)出良好的分泌抗體的穩(wěn)定性。

圖4 細(xì)胞傳代培養(yǎng)上清中抗體效價(jià)變化Fig.4 Detection of antibody titer in the supernatant of cell subculture

收集3G2E10 細(xì)胞注射經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔，獲得的了IgG 含量22.12 mg/mL、亞型IgG2a的單抗腹水。經(jīng)檢測，單抗效價(jià)為1:2.0×105，敏感性曲線y=?26.897x+90.045（R2=0.993）經(jīng)計(jì)算IC50=13.8 μg/L。與Cd-ITCBE-OVA 的親和力測定曲線如圖5，根據(jù)親和力測定公式計(jì)算Ka=8.1×108L/moL。該抗體效價(jià)、敏感性、親和力均可滿足Cd-EDTA 的檢測要求。

圖5 Cd-EDTA mAb 的Ka 測定曲線Fig.5 Association constant curve of Cd-EDTA mAb

2.4 hicELISA 檢測方法的建立

2.4.1 最佳檢測條件 試驗(yàn)結(jié)果表明：中性CBS 作包被液，PBS 作抗體、半抗原稀釋液，可有效降低吸光度檢測的基質(zhì)干擾。3% OVA 封閉時(shí)，陰性孔吸光值<0.5，空白孔吸光值<0.1，封閉效果最佳。棋盤滴定試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 包被原與抗體的最佳濃度測定Table 2 Determination of optimum concentration of coating antigen and antibody

2.4.2 hicELISA 檢測方法的靈敏度 icELISA 與hicELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6，采用Cd-ITCBE-OVA 包被的icELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=?25.579x+99.554（R2=0.9942），半數(shù)抑制濃度IC50=86.5 μg/L，檢測限為5.8 μg/L。hicELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=?25.479x+92.079（R2=0.9934），IC50=44.8 μg/L，檢測范圍在2.9～672.6 μg/L，相對icELISA 檢測限明顯降低，靈敏度高。

圖6 hicELISA 抑制曲線圖Fig.6 Inhibition curve of hicELISA

2.4.3 hicELISA 檢測方法的特異性 將Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Mo6+、Fe3+、Co2+離子與EDTA 偶聯(lián)，作為標(biāo)準(zhǔn)液，檢測其對Cd2+mAb 的阻斷效果，計(jì)算交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表3。由表3可知，抗Cd2+mAb 與其他檢測的重金屬離子交叉反應(yīng)率低，特異性強(qiáng)。

表3 hicELISA 檢測方法的特異性Table 3 Specificity of hicELISA

2.4.4 hicELISA 檢測方法的準(zhǔn)確度與精密度 對湖水、自來水、純水樣進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為10、30 和50 μg/L，采用納米SiO2富集-hicELISA法檢測鎘濃度。如表4可知，不同樣品加標(biāo)回收率為92.47%～102.86%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%～3.41%。本試驗(yàn)建立的方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，適合處理后水樣中Cd2+的定量分析。

表4 不同樣品中Cd2+的添加回收試驗(yàn)Table 4 Recovery test of Cd2+ in different samples

3 討論與結(jié)論

納米材料以其高比表面積、強(qiáng)活性、穩(wěn)定性等獨(dú)特的性質(zhì)深得材料化學(xué)領(lǐng)域研究者的青睞，不同種類的納米材料常作為吸附劑用于污染物處理，如黏土納米復(fù)合材料、金屬氧化物基納米材料、碳納米管等應(yīng)用于重金屬污染水體的修復(fù)[21]。但痕量重金屬離子的定量吸附與解吸研究、以及納米材料在重金屬離子免疫學(xué)檢測中樣品處理階段的應(yīng)用研究較少。本試驗(yàn)以納米SiO2作為痕量Cd2+的吸附材料用于水樣前處理，吸附條件簡便，可定量富集洗脫，有效降低hicELISA 的檢測限，將樣品濃度調(diào)至最佳檢測范圍，提高檢測的靈敏度。

異源抗原即通過不同方法改造同一分析物所制備的半抗原-蛋白載體復(fù)合物，將其包被到酶標(biāo)板，可有效去除橋抗、載體抗體與包被抗原的干擾性抗原抗體反應(yīng)，允許分析物在低濃度下與包被抗原競爭，從而提高了ELISA 分析的靈敏度[22]。異源性ELISA檢測主要應(yīng)用于帶有羧基、羥基、氨基等活性基團(tuán)的小分子化合物，如農(nóng)藥、抗生素、激素、毒素等[23?27]，而重金屬離子本身不具有可改造的活性基團(tuán)，其異源檢測要通過選用不同離子、不同螯合劑制備異源抗原，建立間接競爭或直接競爭ELISA 檢測方法。

秦寶亮[28]采用開環(huán)類雙功能螯合劑ITCBE，成功制備完全抗原Hg-ITCBE-BSA/OVA；張?jiān)骑@、劉丹等[29?30]制備了Cd/Zn-DTPA-OVA 與Cd/Zn-EDTAKLH 人工抗原；郭建軍等[31]采用閉環(huán)類雙功能螯合劑NOTA 成功制備了Pb-NOTA-BSA，為重金屬離子異源性檢測提供了抗原技術(shù)支持。Zhao 等[32]通過Co（Ⅱ）-EDTA-BSA 與Co（Ⅱ）-EDTA-BSA-HRP，建立了Cu（Ⅱ）的hicELISA 與hdcELISA 檢測方法，證明了Co2+異源性檢測的可靠性。本研究通過對比4 種異源性包被原檢測體系，發(fā)現(xiàn)Hg-ITCBEOVA 作包被原建立的hicELISA 檢測方法檢測效果最佳，相對于Cd-ITCBE-OVA 包被的icELISA 靈敏度可提高一倍，且經(jīng)檢測hicELISA 與Hg2+、Cu2+螯合物的交叉反應(yīng)率低，表明抗體被游離Cd-EDTA 的競爭結(jié)合力更強(qiáng)，降低了icELISA 檢測體系包被原造成的強(qiáng)親和力干擾，使檢測特異性更強(qiáng)。

本研究采用納米SiO2預(yù)富集濃縮痕量鎘，制備了Cd2+單克隆抗體，建立了水樣中痕量Cd2+異源性間接競爭ELISA（hicELISA）快速檢測方法，通過實(shí)際樣品驗(yàn)證，該方法靈敏、特異、準(zhǔn)確，為水樣中Cd2+的快速檢測提供了新的技術(shù)支撐。