超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定檳榔籽中四種生物堿含量

郭曉杰，王 盼，龐朝海，韓丙軍，陽辛鳳,*

（1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南海口 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南?？?571101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?70000；4.海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，海南?？?571101）

檳榔（Areca catechuL）是棕櫚科植物檳榔的種子，位列中國四大南藥之首。檳榔可作為鮮檳榔、干檳榔供人們食用[1]，同時檳榔的藥理價值也應(yīng)用很廣泛，具有降血壓、促消化、抗過敏、抗氧化、抑菌、抗腫瘤等作用，對人體的消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)均有一定影響。此外，檳榔也具有一定的毒性，如誘發(fā)口腔癌[2]。檳榔中含有許多化學(xué)成分，主要包括有生物堿類、酚酸類、氨基酸類、鞣質(zhì)、黃酮類，還有花青素、皂苷等[3?5]。其中生物堿是檳榔中的主要活性成分，包括檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿、檳榔副堿和高檳榔堿等[6]。有研究表明檳榔籽中生物堿含量是檳榔殼中的兩倍左右。不同產(chǎn)地檳榔咀嚼產(chǎn)品的生物堿含量存在顯著差異[7]。

目前提取檳榔生物堿主要方法有加熱回流提取法[8]、超聲波提取法[9]、亞臨界水提法[10?11]、超臨界CO2流體萃取等[12]；其生物堿含量的測定包括滴定法、分光光度法、薄層色譜掃描法（TCL）[13]、毛細管電泳法（CE）[14]、高效液相色譜法（HPLC）[15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[16]、超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜儀（UPLC-Q-Tof-MS）等方法[17]。梁振綱利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用檳榔中4 種黃曲霉毒素的含量[18]，結(jié)果表明4 種黃曲霉素的質(zhì)量濃度均在0.1～10.0 ug/L?1內(nèi)和峰面積呈較好線性關(guān)系；Pan 等[19]利用LC-MS/MS 方法對大鼠血漿中堿及其它活性代謝產(chǎn)物測定含量；普義鑫[20]采用超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對檳榔中多酚化合物進行了結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明檳榔多酚中含有蘆丁，綠原酸，沒食子酸，表兒茶素等；李冰等[21]測定了血漿中氫溴酸檳榔堿的含量。Yu 等[22]、Srimany 等[23]采用ESI-MS 及DESI-MS 技術(shù)分別對檳榔不同成熟期檳榔種皮及種子部位生物堿含量變化進行了追蹤，認為隨著檳榔趨近成熟，種皮中4 種生物堿的含量逐漸減小，至完全成熟時，種皮中僅含有檳榔次堿。這些研究均表明LC/MS 技術(shù)在測定檳榔中化學(xué)成分具有較好的專屬性和靈敏度。總體而言，利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時測定生物堿含量的相關(guān)報道很少，主要為滴定法或液相色譜分析，相較于這些傳統(tǒng)的方法，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有定性準確，抗干擾能力強，分離效果好，檢測靈敏度高等優(yōu)點。

本研究采用45%乙醇水提取，用UPLC-MS/MS進行分析，操作簡捷，提取效率高，在5 min 內(nèi)即可完成檳榔籽中生物堿定性與定量檢測。利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，建立了檳榔籽中4 種生物堿含量的快速檢測方法，為今后檳榔食用及藥品中的安全性研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮檳榔 市售；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸乙酯色譜純；無水乙醇（分析純）；超純水；檳榔堿對照品（HPLC≥98%）、檳榔次堿對照品（HPLC≥98%）、去甲檳榔堿對照品（HPLC≥98%）、去甲檳榔次堿對照品（HPLC≥95%） 上海源葉。

Triple Quad 6500+超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS-MS） SCIEX 美國Waters；離心機 湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗機 蘇州邁弘電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 取新鮮檳榔去皮，檳榔籽打漿，然后置冷凍干燥機凍干10 h，放置冰箱備用。稱取檳榔籽凍干樣品2.00 g 至200 mL 燒杯中，用45%乙醇水溶液提取，過濾，10000 r/min 離心，5 min，將其上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL，用7:3 甲醇水定容至50 mL，搖勻，過0.22 μm 濾膜待上機。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis T3（2.1 mm×150 mm，5 μm）流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，5% B；1～5 min，70% B；5～7 min，5% B。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子化方式：電噴霧離子源（ESI）；檢測模式：多反應(yīng)檢測模式（MRM）；掃描方式：正離子掃描（ESI+）；氣簾氣（Curtain Gas）：40 psi；碰撞氣（Collision Gas）8 psi；離子噴霧電壓（Ion Spray Voltage）：5500 V；離子源溫度（Temperature）：550 ℃。優(yōu)化后的化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 化合物質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 1 Monitoring parameters of multireaction spectra of compound mass

1.2.4 標準溶液配制

1.2.4.1 單個對照品溶液的配制 使用萬分之一精密天平稱取檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿對照品各5.00 mg，分別放置10 mL 棕色容量瓶中，用純甲醇溶解并稀釋至刻度線，渦旋震蕩搖勻。作為對照品儲備液，置于0～4 ℃冷凍避光保存，備用。

1.2.4.2 混合對照品溶液的配制 精密吸取上述檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿對照品溶液各1.0 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度線，即得4 種生物堿混合對照品儲備液，置于0～4 ℃冷凍避光保存，備用。

1.2.5 生物堿含量的計算

式中：W 表示生物堿含量，%；c 表示混合標準品溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；D 表示溶液稀釋倍數(shù)；V 表示供試品溶液體積，mL；m 表示樣品取樣量，mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst Software 軟件進行采集數(shù)據(jù)；用SCIEX OS 軟件進行數(shù)據(jù)處理；采用Excel 辦公軟件繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

分別用三種不同溶劑（100%甲醇、水和乙醇）來提取檳榔籽中生物堿，每個水平平行3 次，圖1表明乙醇作為溶劑時提取含量最高，其次是水，提取含量最低的是甲醇，其中檳榔堿甲醇、水、乙醇提取含量的RSD 分別為0.39%、0.52%、0.21%（n=3）；檳榔次堿檳榔堿甲醇、水、乙醇提取含量的RSD 分別為4.27%、2.87%、1.30%；去甲檳榔堿甲醇、水、乙醇提取含量的RSD 分別為3.85%、2.15%、0.79%；去甲檳榔次堿甲醇、水、乙醇提取含量的RSD 分別為3.28%、1.87%、1.08%。四種生物堿提取含量RSD 結(jié)果均表明用乙醇作為提取溶劑的精密度和重復(fù)性較好，所以從該結(jié)果分析確定乙醇為檳榔籽中生物堿提取溶劑。

圖1 三種不同溶劑對檳榔生物堿含量的影響Fig.1 Effects of three different solvents on the content of betel nut alkaoids

2.2 乙醇濃度的優(yōu)化

稱取凍干檳榔籽樣品2.00 g，在固定的超聲時間、功率條件下，用不同乙醇濃度來提取。圖2可以看出，乙醇濃度在35%～95%之間四種生物堿的含量隨著乙醇濃度的增加反而減小，當(dāng)乙醇濃度為45%時提取生物堿的效果為最佳，其檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿含量的RSD（n=3）分別為1.54%、1.77%、3.36%、1.06%；乙醇濃度在55%以上時生物堿含量逐漸下降，但下降幅度不大，原因可能是高濃度的乙醇把其它脂溶性雜質(zhì)成分提取出來，從而影響檳榔籽中生物堿的含量。

圖2 不同乙醇濃度對檳榔生物堿含量影響Fig.2 Effects of different ethanol concentrations on the content of betel nut alkaloids

2.3 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇 分別選用不同類型的色譜柱Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm,1.8 μm）,Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC（ 2.1 mm×150 mm,1.7 μm）,Waters Atlantis T3（2.1 mm×150 mm,5 μm），結(jié)果如圖3所示。Waters Atlantis T3 色譜柱對四種生物堿的分離效果較好，峰形對稱尖銳。

圖3 色譜柱的優(yōu)化Fig.3 Column optimization

2.3.2 流動相的選擇 分別對甲醇?0.1%甲酸水、乙腈?0.1%氨水、乙腈?0.1%甲酸水作為流動相來考察對生物堿類化合物的響應(yīng)分離效果，分析其結(jié)果如圖4采用乙腈?0.1%甲酸水溶液作為流動相對生物堿分離效果優(yōu)于其余三種。

圖4 色譜條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of chromatographic conditions

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將4 種生物堿標準品混合溶液以5.00 μL/min采用針泵流速連續(xù)注射，用正離子模式進行一級質(zhì)譜掃描，確定該化合物母離子，然后再對母離子設(shè)置碰撞能量，在一定的條件下產(chǎn)生特定的子離子，在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個以上的子離子，通過打碎該分子離子峰進行二級質(zhì)譜掃描（子離子掃描），采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，碰撞能量、去簇電壓等參數(shù)進行優(yōu)化，最后對其化合物分別選擇相對豐度較高的一個離子作為定量離子，一個為定性離子。按照二級質(zhì)譜圖提供的碎片離子信息，選擇每種化合物的定性和定量離子對，得到對照品和樣品總離子譜圖（TIC）見圖5，提取離子譜圖（XIC）如圖6所示。

圖5 對照品和樣品總離子譜圖（TIC）Fig.5 Total ion spectrum (TIC) of reference substance and sample

檳榔次堿和去甲檳榔堿的分子式完全相同，均是C7H11NO2，兩者結(jié)構(gòu)上存在差異在優(yōu)化檳榔次堿、去甲檳榔堿質(zhì)譜參數(shù)時，兩種化合物的母離子質(zhì)荷比均為142.1。檳榔次堿的二級碎片離子有53.0，71.1，81.1，99.3；去甲檳榔堿二級碎片離子有53.0，59.2，81.1，113.1；兩種化合物有共同的碎片（m/z 53.0,81.1），為了避免互相干擾，再選擇合適的色譜柱（Waters Atlantis T3）使二者在不同時間洗脫的基礎(chǔ)上，進一步選擇不同的子離子（表1），結(jié)果兩種化合物得到了很好的分離且目標峰附近無干擾峰。去甲檳榔堿子離子選擇113.1，59.2；檳榔次堿子離子選擇99.3，53.0，前者作為定量離子，后者為定性離子，從圖6中可以看出檳榔次堿和去甲檳榔堿兩種化合物的峰形尖銳，保留時間分開，同時也能滿足檢測要求。

圖6 4 種生物堿提取離子色譜圖（XIC）Fig.6 Ion chromatograms of 4 kinds of alkaloids (XIC)

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液置10 mL 容量瓶中，加入7:3 甲醇水稀釋定容至刻度線，混勻，制成4 種生物堿含量為50～500 ng/mL 的混合對照品溶液，進樣分析。以濃度為橫坐標，響應(yīng)峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，求得線性回歸方程，見表2。結(jié)果表明4 種生物堿在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系較好（R2>0.99）。再將4 種生物堿混合對照品溶液稀釋，進行上機測定，以3 倍的信噪比（S/N=3）為檢出限，10 倍的信噪比（S/N=10）為定量限，結(jié)果表明4 種生物堿的檢出限均為0.40 μg/kg，定量限均為1.50 μg/kg。

2.6 方法學(xué)考察結(jié)果

2.6.1 精密度測定結(jié)果 精密吸取混合對照品溶液1.00 mL，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積，檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿4 種生物堿峰面積的相對標準偏差（RSD，n=6）分別為2.18%、3.52%、1.49%和3.72%，表明該方法的儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性測定結(jié)果 精密稱取2.00 g 檳榔樣品6 份，按照1.2.1 項下方法進行提取，作為供試品溶液備用，按1.2 項條件下色譜、質(zhì)譜參數(shù)進行上機測定，計算各個化合物的RSD。結(jié)果檳榔樣品中檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿4 種生物堿峰面積的RSD 分別為1.76%、2.95%、1.40%和3.08%（n=6），表明該方法的重復(fù)性較好。

2.6.3 穩(wěn)定性測定結(jié)果 取同一瓶供試品溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h 按1.2 項條件下色譜、質(zhì)譜條件進行上機測定。結(jié)果檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿4 種生物堿峰面積的RSD（n=6）分別為3.02%、2.62%、2.11%和1.99%。表明該方法的樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 加標回收率測定結(jié)果 稱取檳榔樣品9 份，加標水平分別為0.05、0.10、0.20 g/kg，每個加標水平做3 個平行，按照1.2.1 項下方法進行提取，制備，按1.2 項條件下色譜、質(zhì)譜參數(shù)進行上機測定，計算各個化合物的平均加標回收率（n=3）及RSD，結(jié)果見表3，4 種生物堿在0.05、0.10 和0.20 g/kg，3 個水平下的平均加標回收率為75.27%～96.70%，RSD<7%。

表3 4 種生物堿的加標回收率及其相對標準偏差（n＝3）Table 3 Recoveries of four alkaloids and their relative standard deviations (n=3)

2.7 樣品含量測定結(jié)果

將3 批檳榔樣品按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，并按“1.2.2、1.2.3”項下色譜、質(zhì)譜條件進行測定，得到檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿的峰面積值，計算4 種生物堿含量，結(jié)果顯示（見表2）3 批檳榔樣品的檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿平均含量為16.00、9.40、5.40、5.20 g/kg，2015年新版中國藥典對檳榔中檳榔堿含量的要求為不少于0.20%，該實驗結(jié)果檳榔堿的含量高于0.20%，符合藥典要求。藥典法其提取溶劑用的乙醚，毒性較大，過程也較為復(fù)雜[24]；與藥典相比，本實驗操作簡單，而且可以同時提取出檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿。

表2 4 種生物堿的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、樣品含量、檢出限和定量限（n=6）Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 4 alkaloids (n=6)

3 討論與結(jié)論

本實驗在前期樣品處理過程中采用的提取方法是超聲波提取，考察超聲時間對四種生物堿含量提取率的影響，但從實驗結(jié)果得出在不超聲的情況下檳榔生物堿含量的提取率相對較高，隨著超聲時間的增加，提取生物堿的含量相對降低。原因可能是超聲會導(dǎo)致溫度升高，而檳榔堿類成分對高溫敏感，當(dāng)溫度高于60 ℃提取檳榔生物堿可能會揮發(fā)損失[25]。所以綜合考慮，高效、快速提取4 種生物堿較高含量可以選擇不超聲。

近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在天然藥物中活性成分快速分離和鑒定應(yīng)用廣泛[26?27]。目前檳榔中生物堿主要成分的含量測定大多部分是使用的高效液相色譜儀（HPLC），但也存在靈敏度低、分析時間長等問題[28?30]。而UPLC-MS/MS 在分析技術(shù)上近年來使用的較多，其具有靈敏度高，分離效果較好，節(jié)省時間等優(yōu)點。本實驗首次建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定檳榔籽中4 種生物堿含量的分析測定方法，通過對色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化以及色譜柱、流動相的選擇，最終確定了合適的提取檳榔中生物堿的分離方法，樣品經(jīng)45%乙醇水溶液提取，利用UPLCMS/MS 法進行檢測，采用Waters Atlantis T3（2.1×150 mm，5 μm）色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式掃描，外標法定量。在50～500 ng/mL，檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿的質(zhì)量濃度與峰面積都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2>0.99）；加樣回收率均在規(guī)定范圍內(nèi)，平均回收率在75.27%～96.70%，RSD<7%。該方法操作簡單、可行性較好，靈敏度高，能有效的測定檳榔籽中4 種生物堿的含量，為檳榔中生物堿類化合物的檢測提供依據(jù)，同時也對研究檳榔的食用和藥品中的安全性研究等提供參考。