海洋細(xì)菌BMF04菌株的抑菌和毒素去除作用

彭 云，李文進(jìn)，湯曼利，周榮翔，李霽虹，董 霆，王雨婷，馬桂珍，暴增海

（江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222005）

小麥赤霉?。‵usariumHead Blight,FHB）是由小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和小麥雪腐鐮刀菌（Fusarium nivale（Fr）Ces.）等多種鐮刀菌引起的真菌病害[1]，感病后導(dǎo)致籽粒皺縮，品質(zhì)下降，產(chǎn)生可破壞人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)、致癌、致畸的等多種毒素，嚴(yán)重威脅到人畜的健康安全[2?4]。ZEN 毒素是世界上污染最為廣泛的鐮刀菌毒素，在全世界谷物以及農(nóng)副產(chǎn)品中檢出率高90%[5]，我國(guó)糧食原料及飼料中霉菌毒素污染十分普遍且嚴(yán)重[6?8]，不同地區(qū)和不同季節(jié)的原料及飼料產(chǎn)品檢出率為70%～100%[9]。開(kāi)發(fā)安全有效的方法控制毒素的產(chǎn)生和去除已產(chǎn)生的毒素迫在眉睫。

傳統(tǒng)的毒素降解方法主要有物理降解法和化學(xué)降解法。工業(yè)上主要采取活性炭、硅鋁酸鹽、寡聚糖等物理吸附劑吸附，其有較強(qiáng)選擇性，能有效降低生產(chǎn)成本，但是物理吸附劑易破壞營(yíng)養(yǎng)成分而影響營(yíng)養(yǎng)素的吸收。Volko 等[10]研究表明，毒素吸附劑不能有效徹底去除ZEN 毒素，對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能產(chǎn)生很大影響。化學(xué)脫毒法通過(guò)氧化處理或堿處理，可達(dá)到比物理脫毒方法更好的效果，但化學(xué)脫毒方法難以在實(shí)際生產(chǎn)中大規(guī)模進(jìn)行，添加化學(xué)試劑可能在糧食和飼料中有殘留，造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞和二次污染等，存在著不可避免的局限性[11]。生物降解法主要由微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物和胞內(nèi)、胞外酶分解毒素，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物無(wú)毒，并對(duì)原料中的其他成分沒(méi)有破壞作用，不會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是解決霉菌毒素污染的發(fā)展方向和趨勢(shì)。目前用于毒素降解的微生物菌株較少，篩選既能夠高效抑制小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌生長(zhǎng)又能去除毒素的微生物生防菌株，可以有效減少小麥赤霉病的發(fā)生和毒素的產(chǎn)生，對(duì)于保障食品安全有重要意義[12?14]。國(guó)內(nèi)外不同學(xué)者已經(jīng)從土壤等不同環(huán)境中分離到一些降解ZEN 毒素的微生物菌株，主要有紅球菌（Rhodococcus）[15?16]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[17?18]、鏈霉菌（Streptomyces）[19]、假單胞菌（Pseudomonas）[20]、酵母菌等[21?22]，應(yīng)用微生物去除毒素已經(jīng)成為發(fā)展趨勢(shì)。

BMF04 菌株是本實(shí)驗(yàn)室從連云港海域分離的對(duì)多種病原菌具有較強(qiáng)抑制作用，并具有促生作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）[23]，有關(guān)該菌株對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀病菌的抑制作用及其對(duì)ZEN 毒素的去除作用尚未進(jìn)行研究，本研究測(cè)定該菌株對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀病菌菌絲的抑菌作用和對(duì)ZEN 毒素的降解作用，探究其降解ZEN 毒素的降解機(jī)理，為該菌株用于降解ZEN 毒素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株：海洋甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BMF04（B.methylotrophicus） 由本實(shí)驗(yàn)室從連云港海域分離并保存；小麥赤霉病菌（F.graminearum）、小麥雪腐鐮刀菌（F.nivale（Fr）Ces.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、解淀粉芽孢桿菌GM-1-2（Bacillus amyloliquefaciens） 由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；PDA 培養(yǎng)基、PD 培養(yǎng)基、DF 培養(yǎng)基（2.44 g/L Na2HPO4，1.52 g/L KH2PO4，0.5 g/L（NH4）2SO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.05 g/L CaCl2） 實(shí)驗(yàn)室自配；玉米赤霉烯酮毒素（ZEN） 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所制備提供；胰蛋白酶（25 萬(wàn) U/g） Biosharp 公司；胃蛋白酶（300 萬(wàn)～350 萬(wàn) U/g） Bio Basic Inc 公司；蛋白酶K（4 萬(wàn) U/g） 德國(guó)MERCK 公司。

安捷倫1260 高效液相色譜儀（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、OpenLAB 3.3.2 SP3 安捷倫液相色譜化學(xué)工作站） 美國(guó)安捷倫公司；Biosafer-20TC 實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器 賽飛（中國(guó)）有限公司；MIKIO 200 R 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich 科學(xué)儀器有限公司；JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)隔音箱 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMF04 菌株及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

1.2.1.1 菌株對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用平板對(duì)峙法測(cè)定BMF04菌株對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲的抑制作用。小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌在PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)3 d，用打孔器取直徑1 cm 的菌苔分別接種于新的PDA 平板中央，在距離培養(yǎng)皿邊緣2 cm 處劃線接種BMF04 菌株，接種3 次為3 重復(fù)，以不接菌為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定抑菌帶寬度。

抑菌帶寬度（mm）=對(duì)照病原菌菌落半徑（mm）?處理病原菌菌落半徑（mm）[24]

1.2.1.2 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 將BMF04 菌株接種到裝有60 mL PD 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，28 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)52 h。發(fā)酵液于4 ℃、8000 r/min離心15 min，將上清液用0.22 μm 的微孔過(guò)濾器過(guò)濾得到無(wú)菌發(fā)酵液。采用打孔法測(cè)定無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲的抑制作用。在PDA 平板中央接種直徑5 mm 的培養(yǎng)了3 d 的小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌苔，在距病原菌15 mm 處等距離用直徑8 mm 的打孔器打孔，每孔分別加入150 μL 不同菌株的無(wú)菌發(fā)酵液，以等量PD 培養(yǎng)基為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，測(cè)量BMF04菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌的抑菌圈直徑，每個(gè)病原菌株3 次重復(fù)[24]。

1.2.2 BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素去除作用的研究

1.2.2.1 定性測(cè)定 挑取BMF04 菌株接種在濃度為4 μg/mL 含ZEN 毒素平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察BMF04 菌株的生長(zhǎng)情況，若BMF04 菌株能生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌株具有去除ZEN 毒素作用。以不具有毒素去除作用的大腸桿菌（E.coli）為陰性對(duì)照，以具有解毒作用的B.amyloliquefaciens的GM-1-2 菌株為陽(yáng)性對(duì)照[25]。

1.2.2.2 定量測(cè)定 ZEN 毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別配制2、4、6、8、10、12、14、16 μg/mL ZEN 毒素溶液，采用HPLC 法測(cè)定不同濃度毒素溶液的色譜峰面積，每個(gè)濃度測(cè)定3 次取平均值。HPLC 檢測(cè)ZEN 毒素的條件：色譜儀為安捷倫高效液相色譜儀；色譜柱為安捷倫反相C18柱，孔徑4 μm，長(zhǎng)250 mm×寬4.6 mm；流動(dòng)相為甲醇:水=80:20（V/V）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min。以ZEN 濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制ZEN 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用測(cè)定：挑取BMF04 菌株接種于PDA 培養(yǎng)基斜面，28 ℃培養(yǎng)18 h，用無(wú)菌DF 培養(yǎng)基洗下菌體，并調(diào)節(jié)其菌懸液濃度為107CFU/mL，菌懸液中加入濃度為1 mg/mL的ZEN 毒素母液，使毒素的終濃度為4 μg/mL，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，4 ℃、12000 r/min 條件下離心15 min，上清液用孔徑為0.45 μm 細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，利用HPLC 檢測(cè)上清液中的峰面積，3 次重復(fù)，以不加菌懸液的含等量毒素的DF 培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），將峰面積代入所建立的ZEN 毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算溶液中毒素濃度和去除率，如去除率達(dá)到100%，再增加菌懸液中毒素含量[26]。

去除率（%）=（CK 毒素濃度?樣品中毒素濃度）/CK 毒素濃度×100

1.2.3 BMF04 菌株去除ZEN 毒素的作用機(jī)理研究

1.2.3.1 BMF04 菌株去除ZEN 毒素方式研究 將活化18 h 的BMF04 菌株斜面用5 mL PD 洗下制成菌懸液，倒入裝有55 mL 種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液于4 ℃、8000 r/min 離心15 min，分別收集發(fā)酵上清液和菌體沉淀。上清液過(guò)濾除菌得到無(wú)菌發(fā)酵液；將菌體沉淀用DF 培養(yǎng)基洗滌3 次，用等體積DF 培養(yǎng)基重懸菌體得到活菌懸浮液，菌體密度為107CFU/mL。無(wú)菌發(fā)酵液和活菌懸浮液121 ℃滅菌30 min，得到滅活無(wú)菌發(fā)酵液和滅活菌懸浮液；活菌懸浮液用超聲細(xì)胞破碎儀處理，至菌體充分破碎，冰浴功率比20%，工作時(shí)間為3 s，間隙時(shí)間5 s，循環(huán)工作至活菌懸浮液呈透明狀，4 ℃，8000 r/min，離心15 min，分別收集上清液和沉淀，上清液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，濾液為胞內(nèi)液；沉淀為細(xì)胞壁組分，用等量DF 培養(yǎng)基重懸，得到細(xì)胞壁懸浮液。取BMF04 菌株活菌懸浮液、滅活菌懸浮液、無(wú)菌發(fā)酵液、滅活無(wú)菌發(fā)酵液、胞內(nèi)液和細(xì)胞壁懸浮液，分別加入ZEN 毒素母液，使ZEN 毒素終濃度為15 μg/mL，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定不同處理的峰面積，計(jì)算不同樣品中ZEN 毒素濃度和去除率[27]。

1.2.3.2 蛋白酶對(duì)BMF04 菌株去除ZEN 毒素作用的影響 BMF04 菌株的無(wú)菌發(fā)酵液中，分別加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K，使酶的終濃度為1 mg/mL，用2 mol/L 的HCl 和NaOH 溶液調(diào)節(jié)胰蛋白酶反應(yīng)體系pH 為7.6、胃蛋白酶為pH2.0、蛋白酶K 為pH8.7，37 ℃水浴2 h，調(diào)回初始pH。取不同蛋白酶酶解后的樣品，加入ZEN 毒素母液，ZEN 毒素終濃度為4 μg/mL，28 ℃靜置12 h，采用HPLC的方法檢測(cè)樣品中ZEN 毒素峰面積，計(jì)算不同蛋白酶處理的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)ZEN 毒素的降解率。以未加蛋白酶的無(wú)菌發(fā)酵液為對(duì)照（CK1），未加無(wú)菌發(fā)酵液為空白對(duì)照（CK2），每種蛋白酶為1 處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)[28?29]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次，使用SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較（P<0.05），利用Microsoft Excel進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMF04 菌株及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

BMF04 菌株和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用（圖1）。BMF04 菌株對(duì)兩種病原菌的抑菌帶寬度分別為（25.73±1.42）mm 和（26.80±1.31）mm，無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)兩種病原菌的抑菌圈直徑分別為（14.67±2.52）mm和（15.00±1.00）mm，表明該菌株與無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌都具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖1 BMF04 菌株及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of strain BMF04 and its aseptic fermentation broth on F.graminearum and F.nivale (Fr) Ces

2.2 BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素去除作用的定性測(cè)定

BMF04 菌株和陽(yáng)性對(duì)照GM-1-2 菌株在含ZEN毒素平板上生長(zhǎng)良好（圖2），陰性對(duì)照大腸桿菌（E.coli）不生長(zhǎng)，說(shuō)明BMF04 菌株能夠在以ZEN 毒素為唯一碳源的DF 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，具有去除ZEN 毒素的作用。

圖2 不同菌株在含ZEN 毒素平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.2 The growth state of different strains on ZEN plate

2.3 BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素降解的定量測(cè)定

2.3.1 ZEN 毒素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè) 由圖3可知，ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間約為2.689 min，峰型清晰無(wú)拖尾，與其他的峰沒(méi)有重合，能夠清晰地測(cè)量出相應(yīng)的峰面積。表明該檢測(cè)方法可用于ZEN 毒素的檢測(cè)。

圖3 ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 檢測(cè)圖譜Fig.3 HPLC analysis map of ZEN standard substance

2.3.2 ZEN 毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制不同梯度濃度的ZEN 毒素溶液，利用HPLC 測(cè)定其毒素的峰面積，以ZEN 毒素濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制ZEN 標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。結(jié)果表明，在0～16 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積隨著ZEN 毒素濃度的增加而逐漸增大，呈正相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=82.727x+1.2333，R2為0.9996，線性相關(guān)性較好。

圖4 ZEN 毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of ZEN

2.3.3 BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素去除率的測(cè)定 HPLC檢測(cè)ZEN 毒素初始濃度為4、10 和15 μg/mL 的對(duì)照峰面積分別為（323.28±5.69）、（818.29±4.74）和（1234.68±24.83），加標(biāo)回收率分別為97.25%±1.75%、98.80%±0.60%和99.40%±2.00%，與加入的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品初始濃度擬合程度較高，說(shuō)明儀器靈敏度好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。將BMF04 菌株接種到ZEN 毒素終濃度為4 和10 μg/mL 的DF 培養(yǎng)液中，28 ℃培養(yǎng)48 h，HPLC 檢測(cè)ZEN 毒素未出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明該濃度下BMF04 菌株能完全降解ZEN 毒素，去除率為100%；當(dāng)增加ZEN 毒素濃度為15 μg/mL，檢測(cè)到ZEN 毒素峰面積為（12.96±0.14），ZEN 毒素濃度為（0.14±0.01）μg/mL，去除率仍為98.95%±1.27%（表1）。說(shuō)明BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素具有較強(qiáng)的去除能力。

表1 BMF04 菌株對(duì)不同濃度ZEN 毒素的去除率Table 1 Removal rate of BMF04 strain to different concentration of ZEN

2.4 BMF04 菌株去除ZEN 毒素的機(jī)理研究

2.4.1 BMF04 菌株活菌懸液和滅活菌懸液對(duì)ZEN 毒素的去除作用 BMF04 菌株活菌懸液在含15 μg/mL ZEN 毒素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，HPLC 檢測(cè)峰面積為（14.29±0.77），濃度為（0.16±0.01）μg/mL，去除率為98.92%±0.07%；滅活菌懸液峰面積和毒素濃度分別（488.92±2.38）和（5.90±0.03）μg/mL（表2），去除率為60.32%±0.21%，比菌株活菌懸液的峰面積和毒素濃度明顯下降，差異顯著（P<0.05），說(shuō)明去除ZEN 毒素作用是活菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生了具有去除ZEN 毒素作用的活性物質(zhì)，高溫處理后活性物質(zhì)失活，導(dǎo)致去除率降低[30]，高溫滅活后細(xì)胞壁依然存在，滅活后活菌的去除作用消失，細(xì)胞壁的吸附作用受溫度影響較小，因而滅活后仍然具有一定的去除率，表明BMF04菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用是菌株產(chǎn)生活性物質(zhì)和細(xì)胞壁吸附的共同作用。

2.4.2 BMF04 菌株無(wú)菌發(fā)酵液和滅活無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)ZEN 毒素的去除作用 無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)121 ℃高溫處理后與無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)ZEN 毒素的去除作用差異顯著（P<0.05），明顯降低（表2）。無(wú)菌發(fā)酵液與濃度為15 μg/mL 的ZEN 毒素溶液混合培養(yǎng)48 h 后，HPLC 檢測(cè)峰面積為（17.3±2.22），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ZEN 毒素濃度僅為（0.19±0.03）μg/mL，去除率達(dá)98.70%±0.19%；發(fā)酵液高溫處理后再與毒素溶液混合培養(yǎng)48 h，HPLC 檢測(cè)峰面積為（1204.75±36.29），ZEN 毒素濃度為（14.55±0.44）μg/mL（表2），去除率僅為2.09%±1.15%，去除率顯著下降（P<0.05）。說(shuō)明BMF04 菌株胞外物質(zhì)對(duì)ZEN 毒素具有去除作用，且高溫處理影響其去除作用。

表2 不同處理BMF04 菌株ZEN 毒素的峰面積和濃度Table 2 Peak area and concentration of ZEN by strain BMF04 with different treatments

2.4.3 BMF04 菌株細(xì)胞壁懸浮液和胞內(nèi)液對(duì)ZEN毒素的去除作用 細(xì)胞壁懸浮液和胞內(nèi)液在含15 μg/mL ZEN 毒素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，測(cè)定上清液中毒素含量，計(jì)算去除率。結(jié)果表明，經(jīng)細(xì)胞壁懸浮液處理的樣品峰面積分別為（27.91±0.98），ZEN 毒素濃度為（0.32±0.01）μg/mL，去除率為97.85%±0.07%（表2），說(shuō)明BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用有細(xì)胞壁吸附的作用。經(jīng)胞內(nèi)液處理的樣品峰面積為（19.12±1.06），ZEN 毒素濃度為（0.22±0.02）μg/mL，去除率為98.54%±0.10%（表2），表明BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用也有菌株產(chǎn)生的胞內(nèi)活性物質(zhì)的作用。

2.4.4 蛋白酶處理對(duì)無(wú)菌發(fā)酵液去除解ZEN 毒素作用的影響 無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 處理后對(duì)ZEN 毒素的去除作用明顯降低，差異顯著（P<0.05），反應(yīng)體系中ZEN 毒素濃度分別為（3.83±0.03）、（3.95±0.02）和（3.96±0.00）μg/mL（表3），對(duì)應(yīng)的去除率分別為3.52%±0.77%、0.50%±0.39%和0.18%±0.12%，未處理無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)照Z(yǔ)EN 毒素峰面積為（45.44±2.37），濃度為（0.53±0.03）μg/mL，去除率為86.54%±0.72%（表3），3 種酶處理后對(duì)毒素的去除作用與對(duì)照CK1 差異顯著（P<0.05），胃蛋白酶和蛋白酶K 之間差異不顯著，其中胃蛋白酶和蛋白酶K 對(duì)BMF04菌株無(wú)菌發(fā)酵液去除ZEN 毒素的影響強(qiáng)于胰蛋白酶。表明胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 能降低BMF04 菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)ZEN 毒素的去除作用，進(jìn)一步說(shuō)明BMF04 菌株去除ZEN毒素的胞外活性物質(zhì)為蛋白類(lèi)物質(zhì)。

表3 不同蛋白酶處理BMF04 菌株無(wú)菌發(fā)酵液后ZEN毒素的峰面積、濃度和去除率Table 3 Peak area and concentration of ZEN culture medium after different protease treatment of aseptic fermentation broth

3 討論與結(jié)論

不同解毒微生物菌株對(duì)ZEN 毒素的降解作用和機(jī)理不同，Cho 等[17]從土壤中分離出一株降解ZEN 毒素的枯草芽孢桿菌（B.subtilis），對(duì)液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中含1 和0.25 mg/kg ZEN 毒素的降解率分別為99%和95%；Yi 等[31]從土壤中分離得到一株能降解ZEN 毒素的地衣芽孢桿菌，在ZEN 毒素濃度為2 mg/kg 的LB 培養(yǎng)基中對(duì)降解率為95.8%；譚輝[32]從牛瘤胃中分離純化到假單胞屬（Pseudomonas）菌株TH-N 1，在培養(yǎng)基中含2 μg/mL ZEN 毒素時(shí)降解率為59%；Saumuel 等[20]分離出一株假單胞菌（Pseudomonassp.），在培養(yǎng)基中含0.2 μg/mL ZEN 毒素時(shí)對(duì)其降解率為90%以上。不同降解毒素菌株中芽孢菌屬降解ZEN 毒素的能力較強(qiáng)[18,33]，張晨曦等[34]篩選獲得一株解淀粉芽孢桿菌NS2 對(duì)5 μg/mL ZEN 的降解率高達(dá)95.99%。BMF04菌株在ZEN 毒素濃度為15 μg/mL 時(shí)，去除率仍可達(dá)為98.95%，對(duì)ZEN 毒素的去除作用明顯高于已有菌株。

不同微生物菌株降解ZEN 毒素的方式、活性物質(zhì)種類(lèi)不同。王國(guó)兵[35]和Xu 等[36]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽抱桿菌ZDS-1 和香茅醇假單胞ASAG16 對(duì)ZEN毒素的去除作用是降解作用，降解過(guò)程中，沒(méi)有產(chǎn)生ZEN 的類(lèi)似物，不是簡(jiǎn)單的結(jié)合或吸收作用；耿海榮等[18]研究表明枯草芽孢桿菌（B.subtilis）Y-33 的菌液對(duì)2 和20 μg/mL ZEN 毒素降解率分別為93.79%和82.40%，發(fā)酵上清液對(duì)ZEN 毒素降解率為62.02%，說(shuō)明該菌株降解ZEN 毒素活性成分存在于發(fā)酵上清液中；譚輝[32]對(duì)菌株TH-N 1 的降解機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)活菌體細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)含物對(duì)ZEN 的降解率分別為59%和38%，無(wú)菌的上清液和滅活后的菌液對(duì)ZEN 毒素?zé)o降解作用，說(shuō)明其降解作用可能是由于細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)酶的作用。唐彧等[37]研究認(rèn)為谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamate）406 降解ZEN和AFB1 活性成分存在于發(fā)酵上清液中，降解率分別為50%和58%，初步確定其降解活性物質(zhì)為一種胞外酶，而不是基于細(xì)胞壁的吸附作用。本研究結(jié)果表明BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用既有細(xì)胞壁吸附作用又有蛋白質(zhì)的參與，但有關(guān)降解毒素的活性物質(zhì)種類(lèi)待于進(jìn)一步研究。

BMF04 菌株及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)均具有良好的抑制作用，通過(guò)細(xì)胞壁的吸附、胞內(nèi)物質(zhì)和胞外蛋白的降解對(duì)ZEN 毒素具有較強(qiáng)的去除作用，去除效果明顯高于已有菌株，該結(jié)果為菌株進(jìn)一步用于去除污染糧食、飼料中的ZEN 毒素提供了新的菌種資源和理論依據(jù)。