一株酸面團(tuán)源乳酸菌的益生特性及其對刺五加葉總皂苷的影響

國立東，李秀萍，張 煥，陳 晨，王麗群

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如酸奶、發(fā)酵香腸、酸面團(tuán)等，蘊含著豐富的乳酸菌資源，乳酸菌經(jīng)口攝入可順利通過胃酸和膽汁脅迫，并以相當(dāng)數(shù)量活菌進(jìn)入腸道[1]從而發(fā)揮其益生功能，包括降膽固醇[2]、抗糖尿病[3]、抗肥胖[4]、抗抑郁[5]等。微生物因生長速度快、酶系豐富，可高效轉(zhuǎn)化中草藥活性成分從而提高藥效[6]，近年來作為一般公認(rèn)為安全（generally recognized as safe,GRAS）的乳酸菌，因安全性高且為益生菌的重要來源而備受關(guān)注，其在人參[7]等單味中藥，小柴胡湯[8]、四君子湯[9]等中藥經(jīng)典名方的生物轉(zhuǎn)化方面展現(xiàn)出了積極作用。值得注意的是，這些都因菌種及菌株而異。因此，獲得具有益生功能且可高效轉(zhuǎn)化藥食同源中藥有效成分的乳酸菌菌株，進(jìn)而開發(fā)兼具活性益生乳酸菌與高水平藥食同源活性物質(zhì)于一體的保健食品具有重要意義。

刺五加是黑龍江省道地藥材，根及根莖均可入藥，具有益氣健脾、補腎安神之功效。關(guān)于刺五加的乳酸菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化鮮有報道，研究人員發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵刺五加可提高其異嗪皮啶含量，降低紫丁香苷水平[10]。然而，刺五加藥用根及根莖的過度使用，使其被列為漸危植物，屬于國家三級保護(hù)野生藥材物種，禁止采挖幼株，但刺五加葉為可再生資源，可大量使用，已作為山野菜或加工成茶開發(fā)利用，成為當(dāng)?shù)匾环N特色農(nóng)產(chǎn)品[11]。值得關(guān)注的是刺五加葉與根部具有類似的化學(xué)成分及生物活性，其中皂苷為其主要活性物質(zhì)之一[12]，故深入挖掘刺五加葉的開發(fā)利用途徑具有重要意義。以刺五加葉為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵尚無相關(guān)報道，乳酸菌能否通過生物轉(zhuǎn)化提高刺五加葉皂苷水平仍有待于證實。

鑒于以上考慮，本研究以前期分離的一株可形成溶鈣圈的酸面團(tuán)源分離菌株HUCM105 為出發(fā)菌株，通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)手段對其進(jìn)行種屬鑒定，并進(jìn)一步評價其益生特性，包括酸和膽汁的耐受性及體外去除膽固醇的能力，同時考察其對刺五加葉水提液為唯一基質(zhì)的發(fā)酵能力，以及發(fā)酵后刺五加葉總皂苷含量的變化，旨在為益生菌生物轉(zhuǎn)化刺五加葉總皂苷及二者聯(lián)合使用開發(fā)活性益生菌發(fā)酵的保健產(chǎn)品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加葉 采自黑龍江省伊春市豐林縣野生刺五加植株嫩葉；菌株HUCM105 分離自黑龍江地區(qū)家庭長期使用的傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸面團(tuán)；膽固醇 美國Amresco 公司；牛膽粉 德國Merck 公司；齊墩果酸對照品 成都曼思特生物科技有限公司；香草醛

天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硝酸鋁 天津市巴斯夫化工有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

SW-CJ-2D 超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DM2500 顯微鏡 上海徠卡顯微鏡有限公司；SPX-200-II 生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；BSD-100 振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；BXM-30R 全自動高壓滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；TGL-16 離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SP-752（PC）紫外-可見分光光度儀 上海光譜儀器有限公司；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器

昆山市超聲儀器有限公司；XL-16B 800 密封搖擺式粉碎機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的鑒定 菌株HUCM105 采用改良MRS（mMRS）固體培養(yǎng)基[13]于37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄形成菌落的特征，同時進(jìn)行過氧化氫酶試驗，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察，并記錄菌體細(xì)胞特征。隨后，參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行16S rDNA 基因的擴(kuò)增及測序，并利用MEGA5.1 軟件與乳桿菌屬內(nèi)模式菌株的16S rDNA 基因序列進(jìn)行比對分析，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定其種屬。

1.2.2 酸耐受性測定 菌株HUCM105 對酸的耐受性是通過其在酸性條件下的存活情況來評價。菌株HUCM105 經(jīng)mMRS 液體培養(yǎng)基連續(xù)傳代3 次以活化，離心收集菌泥，并分別用pH 2.0、pH 2.5 或pH 3.0 的mMRS 液體培養(yǎng)基重懸，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別于0、1、2、3 h 取樣采用平板菌落計數(shù)法測定活菌數(shù)，從而確定其對酸的耐受能力。

1.2.3 膽汁耐受性測定 菌株HUCM105 對膽汁的耐受性是通過其在膽汁環(huán)境中的存活情況來評價。傳代3 次活化的菌株HUCM105 發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌泥，用含0.5%牛膽汁的mMRS 液體培養(yǎng)基重懸，37 ℃培養(yǎng)3 h，采用平板菌落計數(shù)法分別檢測0、1、2、3 h 的活菌數(shù)，從而確定其對膽汁的耐受能力。

1.2.4 膽固醇去除能力的測定 菌株HUCM105 體外對膽固醇的去除能力，主要是通過其與富含膽固醇培養(yǎng)基共培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中膽固醇含量的變化進(jìn)行評價。簡言之，活化的菌株HUCM105 按1%接種至含0.3%牛膽汁和100 μg/mL 膽固醇的mMRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，離心得上清液，并測定膽固醇含量，膽固醇含量測定采用鄰苯二甲醛法[14]，膽固醇去除率參照文獻(xiàn)[15]方法計算。

1.2.5 刺五加葉水提液的制備 刺五加葉陰干并粉碎得刺五加葉干粉。精密稱取10.00 g 刺五加葉干粉，用100 mL 蒸餾水重懸于250 mL 錐形瓶中，室溫下超聲波（500 W，40 kHz）處理1 h，并經(jīng)121 ℃滅菌15 min 得刺五加葉水提液，冷卻至室溫備用。

1.2.6 刺五加葉水提液的發(fā)酵 菌株HUCM105 在mMRS 液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代（37 ℃，24 h）2 次后，發(fā)酵液經(jīng)離心得菌泥，用等體積PBS 緩沖液（pH7.2）洗滌2 次，得PBS 重懸菌液，并按1%接種至刺五加葉水提液中，分別于37 ℃靜置或振蕩（80 r/min）培養(yǎng)3 d。

1.2.7 刺五加葉發(fā)酵液活菌數(shù)的測定 分別于發(fā)酵第0、24、48、72 h 取菌株HUCM105 發(fā)酵刺五加葉水提液的發(fā)酵液，采用平板菌落計數(shù)法測定不同時間點的活菌數(shù)。發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)梯度稀釋后涂布于mMRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.2.8 刺五加葉發(fā)酵液總皂苷含量的測定 菌株HUCM105 發(fā)酵刺五加葉水提液期間，分別于發(fā)酵第0、24、48、72 h 取發(fā)酵液，先后經(jīng)離心及0.45 μm濾膜過濾得濾液，并對濾液中總皂苷含量進(jìn)行檢測。

總皂苷含量的測定參考文獻(xiàn)[16]方法，取1 mL濾液水浴揮干，依次加0.5 mL 8%香草醛無水乙醇溶液和5 mL 72%硫酸，振蕩混勻并于60 ℃水浴10 min，冷卻至室溫測定吸光值A(chǔ)542nm，以齊墩果酸為對照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0063x+0.008，R2=0.9992。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，每個試驗做三個重復(fù)，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HUCM105 的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征 將菌株HUCM105 接種至mMRS 固體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，形成的單菌落如圖1（A）。單菌落為圓形，邊緣完整，低凸，表面光滑，乳白色，不透明，質(zhì)地黏稠。在菌落表面滴加3%過氧化氫無氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶陰性菌株。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察，如圖1（B），菌株HUCM105 為革蘭氏陽性，菌體細(xì)胞為短桿，單在或成對排列。這些均符合乳酸菌的基本特征。

圖1 菌株HUCM105 的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 The morphology characteristics of the strain HUCM105

2.1.2 16 S rDNA 序列比對分析 菌株HUCM105的16S rDNA 基因經(jīng)測序，獲得1488 bp 長度的序列，經(jīng)BLAST 后發(fā)現(xiàn)與乳桿菌屬的同源性最高。從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲取11 株代表性的乳桿菌屬內(nèi)模式菌株的16S rDNA 基因序列，以非同屬的Escherchia coli模式菌株為外標(biāo)，利用MEGA5.1 軟件經(jīng)兩端對齊后進(jìn)行序列比對分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，菌株HUCM105 同Lactobacillus brevisATCC 14869 模式株的親緣關(guān)系最近，序列相似度大于99%，故將HUCM105 菌株鑒定為短乳桿菌（L.brevis）。

圖2 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequences

2.2 菌株HUCM105 的酸耐受能力

三種酸性條件pH2.0、pH2.5 和pH3.0 下，短乳桿菌HUCM105 在37 ℃培養(yǎng)不同時間其活菌數(shù)的變化情況如圖3所示。菌株HUCM105 在pH2.5和pH3.0 酸性條件下維持3 h，其活菌數(shù)均無顯著變化（P>0.05），一直維持在109CFU/mL 水平，而pH2.0酸性條件對菌株HUCM105 的存活影響較大，處理1 h 后存活率降為21.1%，2 h 后活菌數(shù)僅能維持在103CFU/mL 水平，而培養(yǎng)3 h 后則無活菌檢出。短乳桿菌HUCM105 的酸耐受能力明顯優(yōu)于先前報道的植物乳桿菌HUCM115，后者在pH 2.0 條件下處理1 h 后存活率僅為4.4%，2 h 后則無活菌檢出[15]。

圖3 不同酸性條件下短乳桿菌HUCM105 的存活情況Fig.3 The viability of Lactobacillus brevis HUCM105 under different acidic conditions

2.3 菌株HUCM105 的膽汁耐受能力

短乳桿菌HUCM105 在0.5%濃度的膽汁環(huán)境中培養(yǎng)3 h，每隔1 h 培養(yǎng)液中活菌數(shù)變化結(jié)果如圖4所示。整個培養(yǎng)期間，0.5%膽汁處理1 h 時活菌數(shù)（1.4×109CFU/mL）最高，與0 h（9.4×108CFU/mL）差異不顯著（P>0.05），但與2 h 或3 h 相比差異顯著（P<0.05）。0.5%膽汁處理2 h 與3 h 相比，活菌數(shù)無顯著差異（P>0.05）。菌株HUCM105 經(jīng)0.5%膽汁處理后活菌數(shù)先出現(xiàn)微弱增加后降低的趨勢，說明培養(yǎng)初期膽汁可能對其生長具有一定的促進(jìn)作用。0.5%膽汁環(huán)境培養(yǎng)3 h 后，菌株HUCM105 存活率為78.1%，自2 h 以后活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，一直維持在5.0×108CFU/mL 水平以上，與初始菌數(shù)無明顯差異（P>0.05），說明0.5%膽汁脅迫處理3 h 不會對菌株HUCM105 的活力產(chǎn)生影響，短乳桿菌HUCM105對膽汁表現(xiàn)出了良好的耐受能力，與前期報道的植物乳桿菌HUCM115 的膽汁耐受能力相當(dāng)[15]。

圖4 0.5%膽汁對短乳桿菌HUCM105 存活力的影響Fig.4 Effect of 0.5% oxgall on the viability of Lactobacillus brevis HUCM105

2.4 菌株HUCM105 的膽固醇去除能力

短乳桿菌HUCM105 在含膽固醇培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)前后培養(yǎng)上清液中膽固醇含量測定結(jié)果如表1所示。短乳桿菌HUCM105 在富含膽固醇的環(huán)境中37 ℃發(fā)酵24 h，可去除其中26.4%膽固醇，說明該菌株具有一定的體外降膽固醇特性，且膽固醇去除率較實驗室前期報道的植物乳桿菌HUCM115 高28.2%[15]。

表1 短乳桿菌HUCM105 的膽固醇去除能力Table 1 Cholesterol removal ability of Lactobacillus brevis HUCM105

2.5 菌株HUCM105 發(fā)酵刺五加葉的特性

菌株HUCM105 以刺五加葉水提液為唯一基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，考察刺五加葉發(fā)酵期間菌株HUCM105活菌數(shù)的變化及其對刺五加葉總皂苷含量的影響，以此評價其對刺五加葉的發(fā)酵和轉(zhuǎn)化總皂苷的能力，結(jié)果如圖5所示。

圖5 菌株HUCM105 發(fā)酵刺五加葉的特性Fig.5 The properties of Acanthopanax senticosus leaves fermented by the HUCM105 strain

菌株HUCM105 在刺五加葉水提液中靜置或振蕩培養(yǎng)24 h 時，活菌數(shù)均達(dá)到最高，靜置培養(yǎng)24 h活菌數(shù)從初始菌數(shù)3.9×107CFU/mL 上升至5.9×108CFU/mL，隨后菌數(shù)逐漸降低，至72 h 時降為1.9×108CFU/mL；振蕩培養(yǎng)24 h 活菌數(shù)從初始菌數(shù)4.4×107CFU/mL 上升至4.7×108CFU/mL，隨后菌數(shù)逐漸降低，至72 h 時降為1.5×108CFU/mL。菌株HUCM105 在刺五加葉水提液中靜置或振蕩培養(yǎng)條件下，其生物量變化趨勢及關(guān)鍵節(jié)點基本相同，雖然在初始菌數(shù)上靜置培養(yǎng)稍低于振蕩培養(yǎng)，但從不同培養(yǎng)時間點的活菌數(shù)水平看，靜置培養(yǎng)均略高于振蕩培養(yǎng)，這說明菌株HUCM105 的生長更適于低氧環(huán)境。

菌株HUCM105 在刺五加葉水提液中靜置培養(yǎng)72 h，不同時間點發(fā)酵液中總皂苷含量變化不大，差異不顯著（P>0.05）。相比之下，振蕩培養(yǎng)條件下隨著培養(yǎng)時間的延長發(fā)酵液中總皂苷含量變化呈先上升后下降的趨勢，發(fā)酵液中總皂苷含量最高的時間點并不是出現(xiàn)在活菌數(shù)最高的24 h，而是出現(xiàn)在培養(yǎng)48 h，其總皂苷含量達(dá)42.6 μg/mL，較初始總皂苷含量提高了79.0%（P<0.05），總皂苷水平最高的時間點滯后于活菌數(shù)最高的時間點，這說明菌株HUCM105代謝產(chǎn)生的皂苷轉(zhuǎn)化酶可能具有胞內(nèi)酶活性，當(dāng)其處于衰亡期時會釋放出更多的胞內(nèi)皂苷轉(zhuǎn)化酶，從而轉(zhuǎn)化生成更多的皂苷。此外，振蕩培養(yǎng)活菌數(shù)略低于靜置培養(yǎng)，但總皂苷含量卻高于靜置培養(yǎng)，這可能與振蕩培養(yǎng)時乳酸菌細(xì)胞與刺五加葉水提液之間接觸更為充分從而使酶與底物之間反應(yīng)更為徹底有關(guān)。由此說明，不同培養(yǎng)方式及培養(yǎng)時間對菌株HUCM105發(fā)酵刺五加葉總皂苷含量影響較大，菌株HUCM105與刺五加葉水提液經(jīng)振蕩培養(yǎng)可顯著提高刺五加葉總皂苷含量，在生物轉(zhuǎn)化刺五加葉總皂苷方面具有潛在的應(yīng)用價值。

3 討論

供試酸面團(tuán)源菌株HUCM105 經(jīng)形態(tài)學(xué)特征及16S rDNA 序列分析鑒定為短乳桿菌，短乳桿菌是傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)中常見的優(yōu)勢菌種之一[17]，不僅對酸面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)及風(fēng)味起積極作用[18]，而且具有潛在的益生功能[19?20]。益生菌若能在體內(nèi)發(fā)揮作用，則需要以相當(dāng)活菌數(shù)量進(jìn)入人體腸道。消化道脅迫環(huán)境被認(rèn)為是益生菌順利進(jìn)入腸道的一道屏障，故酸和膽汁通常被用于體外評價益生菌對消化道的抵抗能力[21]。短乳桿菌HUCM105 在pH2.5 以上的酸性環(huán)境孵育3 h，其活菌數(shù)無明顯變化，展現(xiàn)出了良好的酸耐受性，其對酸的耐受能力明顯優(yōu)于Mancini 等[22]報道的兩株短乳桿菌，pH2.5 條件下處理3 h 后，短乳桿菌DSM 32386 的活菌數(shù)下降了兩個數(shù)量級，而短乳桿菌DSM 20054 則無活菌檢出。短乳桿菌對膽汁的耐受能力因菌株而異，Vasiee 等[23]從意大利傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的4 株短乳桿菌中，只有3 株能在0.5%膽酸鹽環(huán)境中生長，而奶酪源短乳桿菌DSM 32386 經(jīng)0.3%膽汁處理3 h 后活菌數(shù)從105下降到102水平[22]，相比之下，短乳桿菌HUCM105在0.5%膽汁環(huán)境中培養(yǎng)3 h，活菌數(shù)無顯著變化，表現(xiàn)出良好的耐受性。由此推測，短乳桿菌HUCM105可抵抗消化道脅迫作用，并以相當(dāng)活菌數(shù)量順利進(jìn)入腸道進(jìn)而發(fā)揮其益生作用。

近年來，已有大量臨床研究顯示乳酸菌在降低人體血清膽固醇水平上具有積極作用[24]，體外試驗因周期短且操作簡便而通常作為篩選體內(nèi)具有降膽固醇作用乳酸菌的先決條件。短乳桿菌HUCM105 在富含膽固醇培養(yǎng)基中生長24 h 可去除四分之一以上的膽固醇，可作為潛在候選降膽固醇菌株，其降膽固醇能力略低于姜華等[25]報道的短乳桿菌JH-1，而Watanabe 等[19]報道的8 株短乳桿菌中，只有3 株膽固醇去除率超過20%，這也說明了短乳桿菌的降膽固醇特性存在菌株特異性。

中藥的微生物轉(zhuǎn)化作用，體現(xiàn)了中藥現(xiàn)代化[26]。乳酸菌之所以被選擇用于轉(zhuǎn)化中藥，與其高安全性有直接關(guān)系，其在單味藥及經(jīng)典方劑的生物轉(zhuǎn)化方面取得了一定進(jìn)展[7?8,27?28]。然而，關(guān)于乳酸菌生物轉(zhuǎn)化刺五加的研究鮮有報道，而開發(fā)具有類似化學(xué)成分且可再生的刺五加葉，對保護(hù)中藥刺五加資源尤為重要，故以刺五加葉為研究對象，選取了植物基來源的菌株HUCM105，試圖探尋其發(fā)酵刺五加葉的可能性并考察其對刺五加葉總皂苷含量的影響，以期為開發(fā)兼具活性乳酸菌與刺五加葉皂苷的發(fā)酵產(chǎn)品提供理論支持，結(jié)果表明供試菌株HUCM105 可以刺五加葉水提液為唯一發(fā)酵基質(zhì)，維持較高水平的活菌數(shù)量，且振蕩培養(yǎng)可提高刺五加葉總皂苷水平。刺五加葉皂苷具有降血脂作用[29]，故短乳桿菌HUCM105發(fā)酵刺五加葉產(chǎn)品在降血脂方面可體現(xiàn)雙重疊加效果，不僅可通過短乳桿菌HUCM105 自身的降膽固醇作用，也可通過其發(fā)酵促進(jìn)刺五加葉總皂苷生成途徑提高降血脂功效，具有廣闊的開發(fā)前景。短乳桿菌HUCM105 促生皂苷的機(jī)制源于何種關(guān)鍵酶作用[30]尚有待于進(jìn)一步研究。此外，已有研究表明短乳桿菌具有一定的糖苷酶活性，可使人參皂苷原型去糖基化轉(zhuǎn)化為稀有皂苷CK[7]，后者為小分子皂苷，腸道內(nèi)更易吸收而發(fā)揮藥效[31]，短乳桿菌HUCM105能否將刺五加葉皂苷原型轉(zhuǎn)化為更易吸收的小分子皂苷仍需進(jìn)一步深入研究加以確定。

總之，酸面團(tuán)源短乳桿菌HUCM105 可耐受酸和膽汁脅迫，并具有降膽固醇作用，同時可以刺五加葉水提液為唯一發(fā)酵基質(zhì)，維持較高活菌數(shù)量并可提高刺五加葉總皂苷水平，可作為候選益生菌株用于發(fā)酵刺五加葉提高其功效，進(jìn)而為益生菌發(fā)酵刺五加葉產(chǎn)品的開發(fā)提供理論支持。