福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位成分含量及與抗氧化相關(guān)性分析

張 勇，黃思涵，林大都，莊遠杯，張聲源，謝華松

（嘉應(yīng)學院醫(yī)學院，廣東梅州 514031）

各種自由基所引發(fā)的氧化損傷是致使體內(nèi)各組織器官衰老損傷、病變的重要原因之一，許多重大疾病的誘發(fā)與之密切相關(guān)[1?2]。目前廣泛使用的抗氧化劑主要源于化學合成，具一定毒副作用，從天然藥物中尋找安全無毒的抗氧化劑已成為國內(nèi)外研究的熱點[3?5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類、酚類、皂苷、多糖等多類中藥化學成分具有良好的抗氧化活性[6?7]。我國地廣物博，天然藥用植物資源豐富，從中尋找安全、低毒、高效、價廉的天然抗氧化劑具有十分光明的前景[5]。

福建觀音座蓮（Angiopteris fokiensisHieron），又名牛蹄勞、馬蹄蕨，為合囊蕨科（Marattiaceae）觀音座蓮屬植物，主產(chǎn)于廣東、福建和廣西等地，常以根莖入藥，具有清熱解毒、止痛、涼血止血等功效[8]，形如馬蹄，可做食糧使用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，福建觀音座蓮含豐富的藥用成分，如有機酸類、黃酮類、甾體類、酚類、多糖類以及變型二肽類物質(zhì)等[9?10]，其中，福建觀音座蓮多糖具有一定的抗癌作用和免疫活性；甾體類化合物可用于真菌感染、腫瘤和心腦血管等疾病的治療[11]。目前，對福建觀音座蓮的研究大多局限于資源現(xiàn)狀研究、育苗及栽培技術(shù)研究等方面[12?13]，對福建觀音座蓮葉總黃酮、總酚提取及活性研究未見報道。為了深入研究不同溶劑對福建觀音座蓮葉中成分萃取及活性的影響，試驗測定各萃取部位中總黃酮與總酚含量，采用多種體外抗氧化活性評價方法研究其抗氧化作用，并分析活性與成分含量的相關(guān)性，以期為進一步開發(fā)利用福建觀音座蓮葉提供實驗基礎(chǔ)，同時為天然抗氧化劑的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福建觀音座蓮葉 2019年6月采自廣東省梅州市大埔縣豐溪林場；蘆丁 純度≥98%，安徽酷爾生物工程有限公司；VC（純度≥98%）、鐵氰化鉀、過硫酸鉀、三氯乙酸、無水三氯化鐵 西隴科學股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽 美國Sigma-Aldrich 公司；福林酚、沒食子酸 純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司；卵磷脂 廣東長程醫(yī)藥生物科技有限公司；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氫氧化納、二水磷酸二氫鈉 均為國產(chǎn)分析純。

BT125D 電子分析天平、D-16C 離心機 德國Sartorius 公司；EMS-40A 數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋 康恒儀器有限公司；S100/S100H 超聲波清洗器 德國Elma 公司；78-0070 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 美國KD 公司；DR6000 紫外-可見分光光度計 美國HACH 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 取干燥福建觀音座蓮葉185 g，粉碎，用10 倍量95%乙醇超聲（600 W，30 min）重復(fù)提取3 次，抽濾，合并濾液，減壓濃縮得乙醇提取物（YE-Z，9.8 g），取醇提物8 g，混懸于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將各萃取液濃縮后得相應(yīng)浸膏：石油醚部位（YE-P，2.35 g）、乙酸乙酯部位（YE-E，0.42 g）、正丁醇部位（YE-B，1.49 g）及水部位（YE-W，2.99 g）。

1.2.2 樣品總黃酮含量測定 參考文獻[14?15]方法稍作修改。精密稱取蘆丁標準品5.0 mg，無水乙醇溶解定容至25 mL 容量瓶中，搖勻即得蘆丁標準溶液（0.2 mg/mL）。精密吸取蘆丁標準溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 和3.50 mL，分別置于10 mL 棕色容量瓶中，加0.40 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；加入10% Al（NO3）3溶液0.40 mL，搖勻，靜置 6 min；再加入4% NaOH 溶液4.00 mL，無水乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min后，以不加蘆丁標準溶液的試液作空白對照，在波長為510 nm處測定吸光度，平行測定3 次。以蘆丁標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

精密吸取不同質(zhì)量濃度的待測樣液3.00 mL 按上述方法測定吸光度，代入標準曲線方程，計算樣品總黃酮含量。

1.2.3 樣品總酚含量測定 參考文獻[16?17]方法稍作適當修改。精密稱取10.0 mg 沒食子酸標品，純水溶解后定容，搖勻即得沒食子酸標準溶液（0.2 mg/mL）。分別精密吸取0.00～0.50 mL 6 個梯度的標準溶液置于6 個10 mL 比色管中，各加5.00 mL 純水，再加0.50 mL Folin-酚試劑，搖勻，靜置2 min，加 7.5%Na2CO3溶液2.00 mL，純水定容至刻度，恒溫水浴10 min，室溫暗置1 h。以空白試劑為對照，于760 nm波長處測定吸光度，平行測定3 次。以吸光度為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。

精密吸取不同質(zhì)量濃度的待測樣液1.00 mL 按上述方法測定吸光度，代入標準曲線方程，計算樣品總酚含量。

1.2.4 抗氧化活性評價

1.2.4.1 清除ABTS+·作用測定 參考文獻[18?19]方法稍做修改。將2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液與7.0 mmol/L ABTS 溶液等體積混合，避光反應(yīng)12～16 h，得ABTS+溶液。用適量磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4）稀釋ABTS+溶液至在波長734 nm處的吸光度為0.800±0.020，得ABTS+工作液；精密吸取上述溶液3.90 mL，加入至0.10 mL 不同濃度待測液中，搖勻，室溫暗置10 min，以磷酸鹽緩沖液調(diào)零，測定其在波長為734 nm 處的吸光度（Ai）；以等量無水乙醇代替樣液，同法測定吸光度（A0）；以等量磷酸鹽緩沖液代替ABTS+工作液同法測定吸光度（Aj），以VC為對照，平行測定3 次。清除率按下式計算：

1.2.4.2 清除DPPH·作用測定 參考文獻[20?21]方法稍做修改。吸取不同濃度的待測樣液2.00 mL，加入2.00 mL 0.15 mmol/LDPPH 工作液，搖勻，室溫暗置20 min，測定其在波長為517 nm處的吸光度（Ai）；以等量無水乙醇代替樣液，同法測定吸光度（A0）；以等量無水乙醇代替0.15 mmol/L DPPH 工作液的吸光度（Aj）。以VC為對照，平行測定3 次。清除率按下式計算：

1.2.4.3 鐵還原能力測定 參考文獻[22?23]方法并做修改。吸取2.50 mL 不同濃度的待測樣液至25 mL 比色管，加入磷酸鹽緩沖液（2.0 mol/L，pH6.6）與 1%鐵氰化鉀溶液各2.50 mL，搖勻，50 ℃恒溫箱避光反應(yīng)20 min，迅速冷卻，加入2.50 mL 10%三氯乙酸溶液，搖勻，離心10 min（6000 r/min）。取2.50 mL上清液，加入0.1% FeCl3溶液0.50 mL 和蒸餾水2.00 mL，搖勻，于波長700 nm 處測定吸光度（Ai）；同法測定以等量無水乙醇代替樣品溶液的吸光度（A0）和以等量蒸餾水代替反應(yīng)試劑的吸光度（Aj）。以VC為對照，平行測定3 次。還原能力按下式計算：

1.2.4.4 抑制脂質(zhì)過氧化能力測定 參考文獻[24?25]方法，分別取卵磷脂溶液、0.4 mmol/L FeSO4溶液和不同濃度的待測樣液各1 mL，依次加入至10 mL 試管，搖勻，37 ℃避光水浴1 h，加入2 mL TCA-TBAHCl 混合液，90～100 ℃水浴15 min，急速冷卻后離心10 min（3000 r/min），取上清液，用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液調(diào)零，于波長535 nm 處測定其吸光度（Ai）；同法測定以等量無水乙醇代替待測液的吸光度（A0）與以等量蒸餾水代替卵磷脂溶液的吸光度（Aj）。以VC為對照，平行測定3 次。抑制率按下式計算：

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮與總酚含量分析

以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光值為縱坐標（Y），得蘆丁線性方程：y=12.02x+0.0204（R2=9993），線性范圍為0.02～0.06 mg/mL；沒食子酸線性方程：y=98.35x+0.0295（R2=0.9997），線性范圍為0.002～0.01 mg/mL。如圖1、圖2所示，福建觀音座蓮葉提取物各萃取部位均含有總黃酮、總酚，但含量差異明顯，總黃酮含量高低排序：YE-E>YE-P>YE-Z>YE-B>YE-W，總酚含量高低排序：YE-E>YE-B>YE-W>YE-Z>YE-P。其中YE-E 的總黃酮、總酚含量均為最高，分別為271.05±2.82 mg/mL 和59.62±3.23 mg/mL，表明黃酮和酚類化合物可高度富集于乙酸乙酯部位中。該結(jié)果與趙晉彤等[27]對粗莖鱗毛蕨總酚、總黃酮含量測定結(jié)果一致，其研究顯示乙酸乙酯萃取部位的總酚、總黃酮含量最高。

圖1 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位總黃酮含量Fig.1 Content of total flavonoids in different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract

圖2 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位總酚含量Fig.2 Total phenol content in different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 對ABTS+自由基清除作用 由圖3可知，福建觀音座蓮葉各萃取部位在實驗濃度范圍內(nèi)，隨著樣品質(zhì)量濃度增大，其清除ABTS+自由基的能力增強。YE-E 對ABTS+自由基清除能力最顯著，在濃度為1.62 mg/mL 時，其清除率達95.68%。由表1可知，YE-E 清除ABTS+自由基IC50值為0.47±0.05 mg/mL，YE-P、YE-W 清除ABTS+自由基IC50值分別為2.65±0.13 和2.48±0.12 mg/mL，綜上，福建觀音座蓮葉各部位清除ABTS+自由基的能力從強到弱依次為：YEE>YE-B>YE-Z>YE-W>YE-P。但與陽性對照VC有明顯差距。產(chǎn)生該結(jié)果的原因在于不同成分極性不同，根據(jù)相似相溶原理，通過不同極性溶劑對福建觀音座蓮葉醇提取物進行萃取后，可以有效的將福建觀音座蓮葉醇提取物中不同極性物質(zhì)進行分離，結(jié)果表明福建觀音座蓮清除ABTS+自由基的有效成分為富集于中等極性的乙酸乙酯萃取物中。

表1 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位對ABTS+自由基清除作用的IC50（±SD，n=3）Table 1 IC50 of the scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on ABTS free radicals (±SD,n=3)

表1 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位對ABTS+自由基清除作用的IC50（±SD，n=3）Table 1 IC50 of the scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on ABTS free radicals (±SD,n=3)

樣品 YE-Z YE-P YE-E YE-B YE-W VC IC50（mg/mL） 2.01±0.08 2.65±0.13 0.47±0.05 1.41±0.09 2.48±0.12 0.110±0.005

圖3 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位對ABTS+自由基清除作用Fig.3 Scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on ABTS+ free radicals

2.2.2 對DPPH 自由基清除作用 由圖4可知，福建觀音座蓮葉各萃取部位具有不同程度清除DPPH自由基的能力，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各部位對DPPH 自由基的清除率隨質(zhì)量濃度升高而增大。當質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 時，清除率由高到低依次為：VC>YE-E>YE-P>YE-B>YE-Z>YE-W，以 YE-E 清除率最強（95.91%），水部位清除率最弱（41.76%）。由表2可知：YE-E 清除DPPH 自由基的IC50值為0.19±0.022 mg/mL，明顯低于其他極性提取物，抗氧化能力強，表明福建觀音座蓮葉清除DPPH 自由基的活性物質(zhì)主要集中在YE-E 中。

表2 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位對DPPH 自由基清除作用的IC50（±SD，n=3）Table 2 IC50 of the scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on DPPH free radicals (±SD，n=3)

表2 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位對DPPH 自由基清除作用的IC50（±SD，n=3）Table 2 IC50 of the scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on DPPH free radicals (±SD，n=3)

樣品 YE-Z YE-P YE-E YE-B YE-W VC IC50（mg/mL） 0.80±0.04 0.70±0.03 0.19±0.02 0.73±0.04 1.15±0.07 0.00037±0.00021

圖4 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位對DPPH 自由基清除作用Fig.4 Scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on DPPH free radicals

福建觀音座蓮葉各萃取部位對DPPH 自由基的清除活性與ABTS 自由基不一致，其可能在于：在經(jīng)過不同極性溶劑萃取后，不同部位具有含量不同且極性結(jié)構(gòu)不同的酚類和黃酮類成分，不同含量且不同極性結(jié)構(gòu)的酚類和黃酮類協(xié)同作用可能導致其趨勢不一致；不同抗氧化體系的發(fā)揮抗氧化的機理的不同，從而需要結(jié)構(gòu)不同的抗氧化活性物質(zhì)才能發(fā)揮活性[26]。

2.2.3 對鐵的還原能力 由圖5可知，福建觀音座蓮葉各萃取部位均表現(xiàn)出一定還原能力，且還原能力隨質(zhì)量濃度增大而不斷增強，呈正相關(guān)性。在同質(zhì)量濃度下，YE-E 的還原能力明顯大于其他部位，YEB 和YE-W 的還原能力在0.05～0.8 mg/mL 濃度范圍內(nèi)相差不大，在濃度為0.8～1.6 mg/mL 才出現(xiàn)差異，各部位的還原能力大小依次為：VC>YE-E>YEB>YE-W>YE-Z>YE-P。由表3線性分析可知，YEW、YE-B、YE-E、YE-P、YE-Z 的質(zhì)量濃度與吸光度的相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.9999、0.9995、0.9801、0.9850、0.9992，表明福建觀音座蓮葉各部位的還原能力在0.05～1.6 mg/mL 濃度范圍內(nèi)有良好的相關(guān)性。該活性所需質(zhì)量濃度范圍與同為蕨類植物的粗莖鱗毛蕨不同萃取部位對還原能力測定濃度范圍接近，該研究顯示粗莖鱗毛蕨乙酸乙酯萃取物還原能力（IC50值為0.05 mg/mL），提示乙酸乙酯可能是富集蕨類抗氧化活性物質(zhì)的有效溶劑[27]。

圖5 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位的鐵還原能力Fig.5 Iron reduction ability of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract

表3 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位鐵還原能力的線性分析Table 3 Linear analysis of iron reduction ability of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract

2.2.4 抑制脂質(zhì)過氧化的能力 多不飽和脂肪酸在生物體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化會產(chǎn)生大量過氧化物和丙二醛等有毒物質(zhì)，誘發(fā)細胞的氧化損傷，導致組織、器官的氧化病變等不良影響[28]。福建觀音座蓮葉提取物及不同萃取部位對脂質(zhì)過氧化的抑制能力結(jié)果如圖6，在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時，YE-E 抑制率達73.05%，且抑制能力隨質(zhì)量濃度增大呈明顯增強趨勢，而YE-W 與YE-B 隨質(zhì)量濃度的增大抑制能力變化不明顯。因此，各部位抑制能力大小依次為：VC>YE-E>YE-Z>YE-P>YE-W>YE-B。由表4可知，YE-E 抑制脂質(zhì)過氧化的能力最強，其IC50值為0.26±0.02 mg/mL 遠小于其他提取物，YE-B 抑制脂質(zhì)過氧化能力最弱，IC50值為4.90±0.27 mg/mL，表明福建觀音座蓮葉抑制脂質(zhì)過氧化的活性成分主要富集于YE-E 中。

表4 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位抑制脂質(zhì)過氧化能力的IC50（±SD，n=3）Table 4 IC50 of different extracted parts of Angiopteris Fokiensis Hieron leaf extract to inhibit lipid peroxidation (±SD,n=3)

表4 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位抑制脂質(zhì)過氧化能力的IC50（±SD，n=3）Table 4 IC50 of different extracted parts of Angiopteris Fokiensis Hieron leaf extract to inhibit lipid peroxidation (±SD,n=3)

樣品 YE-Z YE-P YE-E YE-B YE-W VC IC50（mg/mL） 0.52±0.08 0.38±0.04 0.26±0.02 4.90±0.27 2.69±0.35 0.0040±0.0003

圖6 福建觀音座蓮葉提取物不同萃取部位抑制脂質(zhì)過氧化的能力Fig.6 Ability of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract to inhibit lipid peroxidation

2.2.5 抗氧化活性與成分含量相關(guān)性分析 由表5可知，福建觀音座蓮葉各萃取部位的抗氧化活性與其總黃酮、總多酚呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。具體表現(xiàn)為：清除DPPH、ABTS+自由基能力與總黃酮相關(guān)性最高（P<0.01），鐵還原能力與總酚最為相關(guān)（P<0.01），抑制脂質(zhì)過氧化能力則與兩者相關(guān)性相當（P<0.01）。綜上，總黃酮與總酚是福建觀音座蓮葉發(fā)揮抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表5 抗氧化活性與成分含量的相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation coefficient between antioxidant activity and component content

3 結(jié)論

本研究表明福建觀音座蓮葉各萃取部位均含有總黃酮、總酚類成分和抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位總黃酮（271.05±2.82 mg/g）與總酚（59.62±3.23 mg/g）含量最高，且乙酸乙酯部位抗氧化活性優(yōu)于其他部位，其清除DPPH、ABTS+自由基的IC50值分別為0.19±0.02 和0.47±0.05 mg/mL，抑制脂質(zhì)過氧化的IC50值為0.26±0.02 mg/mL。相關(guān)性分析顯示，福建觀音座蓮葉各部位的總黃酮、總多酚含量均與抗氧化活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），表明黃酮和酚類化合物是其發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。綜上顯示，乙酸乙酯部位為福建觀音座蓮葉抗氧化最有效部位。通過本實驗可以初步確定該活性部位中主要活性物質(zhì)為酚類和黃酮類化合物，因此，后期應(yīng)重點對福建觀音座蓮葉乙酸乙酯提取物中的酚類和黃酮類成分進行分離純化，明確其活性單體成分，分析構(gòu)效關(guān)系，進一步豐富福建觀音座蓮的科學內(nèi)涵，對后續(xù)開發(fā)新型抗氧劑具有重要的指導意義。