基于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析咖啡酰奎寧酸類化合物治療II型糖尿病的作用機制

李玲玉，朱文卿，朱姍姍，張 利，張 鵬，鄭振佳,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東泰安 271018；2.山東中平藥業(yè)有限公司，山東臨沂 273300）

糖尿病屬于內(nèi)分泌代謝紊亂疾病[1]，國際糖尿病聯(lián)合會估計2019年全球有4.63 億糖尿病患者，預(yù)計到2045年全球糖尿病患者將達到7 億[2]。糖尿病可分I 型和II 型糖尿病，其中II 型糖尿病患者約占該病的90%[3]，其發(fā)病原因主要是由于遺傳基因和不良的生活方式，尚無法根治[4]。II 型糖尿病可引起多種并發(fā)癥，導(dǎo)致血管受損并危及心、腦、腎等，嚴重危害人體健康，造成巨大的社會和經(jīng)濟負擔[5?6]。目前對II 型糖尿病患者主要采取口服降糖藥物、皮下注射胰島素、飲食控制和運動鍛煉等方式調(diào)節(jié)血糖[7]。從天然植物中尋找安全性高、副作用小的潛在功能成分成為食品營養(yǎng)健康的研究熱點[8]。

咖啡?？鼘幩犷惢衔锸侵参矬w內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗菌消炎、降血糖、降血壓等多種生物學活性[9]。研究表明咖啡酰奎寧酸類化合物能夠通過改善胰島素抵抗及調(diào)節(jié)人體對葡萄糖的吸收起到降血糖的作用[10?11]，可用于治療II 型糖尿病，但該類化合物治療II 型糖尿病的主要有效成分、作用靶點和作用機制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學融合了計算機科學、生物學、藥理學等多個學科，通過生物網(wǎng)絡(luò)模型分析活性成分-靶點-疾病間復(fù)雜的互作關(guān)系，可揭示活性成分與機體相互作用機制[12]。分子對接是依據(jù)酶的鎖-鑰匙原理，從已知結(jié)構(gòu)的化合物及蛋白出發(fā)，通過計算機模擬、化學計量學計算，識別并預(yù)測受體-配體結(jié)合的方法，預(yù)測蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點[13?14]。計算機輔助技術(shù)為研究藥用植物治療疾病多成分、多靶點、多途徑效應(yīng)機制提供了便利。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，預(yù)測咖啡酰奎寧酸類化合物作用靶點及作用機制，為II 型糖尿病的臨床飲食干預(yù)治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 咖啡酰奎寧酸類化合物對應(yīng)靶點預(yù)測

通過PubChem 及ChemDraw Ultra 8.0.3 軟件獲取咖啡?？鼘幩犷惢衔锏腟MILES 結(jié)構(gòu)，將化合物的SMILES 結(jié)構(gòu)分別輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，獲取化合物的預(yù)測靶點信息。

1.2 II 型糖尿病相關(guān)靶點的檢索

通過Pubmed、Ctd、DrugBank 及Genecards 等數(shù)據(jù)庫檢索II 型糖尿病英文名“type II diabetes”，獲得與II 型糖尿病相關(guān)的作用靶點，將所得靶點去除重復(fù)項后得到II 型糖尿病相關(guān)靶點。

1.3 咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.1”所得咖啡?？鼘幩犷惢衔飳?yīng)靶點與“1.2”所得II 型糖尿病相關(guān)靶點進行交集，得到交集靶點，獲取咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的作用靶點。將交集靶點通過STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape 構(gòu)建咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

借助WebGestalt 數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點進行GO功能分析，其包括對生物過程（biological processes，BP）、細胞組分（cell component，CC）及分子功能（molecular function，MF）的分析。利用Cytoscape軟件中的ClueGo 插件對關(guān)鍵靶點進行KEGG 通路富集分析，選取富集基因數(shù)排名前20 的通路，通過omicshare 數(shù)據(jù)庫繪制氣泡圖。

1.5 分子對接

采用AutoDock Vina 軟件對咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委煝蛐吞悄虿≈星? 的靶點蛋白與關(guān)鍵成分進行分子對接驗證。通過RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫獲取靶點蛋白晶體結(jié)構(gòu)，再利用AutoDock 對接軟件對蛋白晶體結(jié)構(gòu)去水加氫、計算電荷、去除原配體，對配體分子通過Torsion Tree 進行調(diào)整，運用AutoDock Vina 軟件計算其對接活性位點、結(jié)合能及均方根偏差（RMSD），最后將對接結(jié)果進行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡?？鼘幩犷惢衔飳?yīng)靶點預(yù)測

咖啡酰奎寧酸類化合物是由奎寧酸和不同數(shù)目的咖啡?；ㄟ^酯化反應(yīng)縮合而成，根據(jù)咖啡?；Y(jié)合數(shù)目的不同，可分為單咖啡?？鼘幩帷⒍Х弱？鼘幩岷投嗫Х弱？鼘幩醄15]。天然植物中提取分離得到的咖啡酰奎寧酸通常是以上述化合物共存的形式存在，天然植物藥理活性的發(fā)揮得益于其同分異構(gòu)體的同時存在。該類化合物主要含有酯鍵、不飽和雙鍵、鄰二酚羥基、羥基等，尤其是酚羥基具有很好的清除自由基的能力，有助于降糖活性的發(fā)揮[16]?，F(xiàn)已知咖啡?？鼘幩犷惢衔锕?8 個，利用SwissTarget-Prediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測獲得化合物的對應(yīng)靶點有483個。通過Cytoscape 軟件對上述活性化合物與預(yù)測靶點進行關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的繪制和分析，得到“咖啡?？鼘幩犷惢衔?靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。38 種咖啡?？鼘幩犷惢衔锞W(wǎng)絡(luò)靶點分析順序如下：1-O-咖啡?？鼘幩幔–1）、3-O-咖啡?？鼘幩幔–2）、4-O-咖啡?？鼘幩幔–3）、5-O-咖啡酰奎寧酸（C4）、3-O-咖啡?？鼘幩峒柞ィ–5）、3-O-咖啡?？鼘幩嵋阴ィ–6）、3-O-咖啡酰奎寧酸丁酯（C7）、4-O-咖啡?？鼘幩峒柞ィ–8）、4-O-咖啡?？鼘幩岫□ィ–9）、5-O-咖啡?？鼘幩峒柞ィ–10）、5-O-咖啡?？鼘幩岫□ィ–11）、1,3-O-二咖啡?？鼘幩幔–12）、1,4-O-二咖啡?？鼘幩幔–13）、1,5-O-二咖啡?？鼘幩幔–14）、3,5-O-二咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸A）（C15）、3,4-O-二咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸B）（C16）、4,5-O-二咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸C）（C17）、3,4-O-二咖啡?？鼘幩峒柞ィ–18）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯（C19）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯（C20）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸乙酯（C21）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸丁酯（C22）、3,5-O-二咖啡?？鼘幩岫□ィ–23）、3,5-O-二咖啡?？鼘幩岙惗□ィ–24）、3,5-O-二咖啡?？鼘幩嵋阴ィ–25）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-蘋果酰）-奎寧酸（C26）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-蘋果酸甲酯）-奎寧酸（C27）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-丙二酰）-奎寧酸（C28）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-琥珀?？鼘幩幔–29）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀?？鼘幩幔–30）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酸甲酯奎寧酸（C31）、1,4-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰甲酯奎寧酸（C32）、1,3-O-二咖啡酰-4-O-蘋果?？鼘幩幔–33）、1,3,5-O-三咖啡?？鼘幩幔–34）、1,4,5-O-三咖啡?？鼘幩幔–35）、3,4,5-O-三咖啡?？鼘幩幔–36）、3,4,5-O-三咖啡?？鼘幩峒柞ィ–37）、1,3,4,5-O-四咖啡?？鼘幩幔–38）。

圖1 “咖啡?？鼘幩犷惢衔?靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network diagram of "caffeoylquinic acids-target"

2.2 II 型糖尿病相關(guān)靶點的檢索

通過檢索Pubmed、Ctd、DrugBank 及Genecards等數(shù)據(jù)庫共獲得II 型糖尿病相關(guān)靶點2214 個。

2.3 咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將咖啡酰奎寧酸類化合物的潛在作用靶點與II 型糖尿病相關(guān)靶點取交集，共得到211 個交集靶點，作為咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的作用靶點。借助STRING 數(shù)據(jù)庫及Cytoscape 軟件的MCODE 插件共篩選出37 個關(guān)鍵靶點，并繪制出咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。此網(wǎng)絡(luò)包括37 個關(guān)鍵靶點，518 條相互關(guān)系，其中節(jié)點越大表明其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大[17]，由此推斷AKT1、MMP2、MMP8、HIF1A、IGF1R、MAPK8 等靶點蛋白可能在II 型糖尿病的治療中起關(guān)鍵作用。

圖2 咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Key target network of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的37 個關(guān)鍵靶點信息如表1所示。從表1可以看出，這些靶點與細胞的增殖分化、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化等生物學功能及調(diào)控葡萄糖代謝、調(diào)節(jié)胰島素受體等生物過程密切相關(guān)。糖尿病發(fā)病涉及體內(nèi)多個生物過程的異常，咖啡?？鼘幩犷惢衔锟赡苁峭ㄟ^多靶點、多通路調(diào)節(jié)這些生物過程來發(fā)揮其抗糖尿病作用。

表1 咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的37 個關(guān)鍵靶點信息表Table 1 37 key targets information table of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

續(xù)表1

2.4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

對37 個關(guān)鍵靶點進行GO 功能分析，分析結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示這些靶點主要參與代謝過程（metabolic process）、應(yīng)激反應(yīng)（response to stimulus）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）等生物過程，涉及細胞膜（membrane）、細胞核（nucleus）、腔上包膜（membrane-enclosed lumen）等細胞組成，以及蛋白結(jié)合（protein binding）、離子結(jié)合（ion binding）、轉(zhuǎn)移酶活性（transferase activity）等分子功能。

圖3 咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的關(guān)鍵靶點GO 分析Fig.3 GO analysis of key targets of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

對37 個關(guān)鍵靶點進行KEGG 通路富集分析，富集基因數(shù)排名前20 的信號通路如圖4所示。結(jié)果表明咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的作用機制主要涉及細胞外基質(zhì)降解（Degradation of the extracellular matrix）、基質(zhì)金屬蛋白酶的激活（Activation of Matrix Metalloproteinases）、膠原蛋白降解（Collagen degradation）、MyD88 獨立TLR3/TLR4 級聯(lián)（MyD88-independent TLR4 cascade）等多條通路，主要涉及AKT1、MMP3、MMP9、HIF1A、IGF1R、MAPK8 等靶點基因，這些基因主要通過調(diào)控葡萄糖代謝以及調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。與通路相關(guān)的基因如表2所示，通路與其相關(guān)靶點之間的相互關(guān)系如圖5所示。

圖4 咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的關(guān)鍵靶點KEGG 通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

結(jié)合表2與圖5可以看出，細胞外基質(zhì)降解（Degradation of the extracellular matrix）主要涉及CASP3、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、PLG 共7 個靶點蛋白，其中CASP3 是caspase 級聯(lián)激活下游的關(guān)鍵成分，可防止細胞因子誘導(dǎo)的β細胞凋亡，這可能有助于保護糖尿病患者免受β細胞死亡[18]；MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9 主要通過降解多種細胞外基質(zhì)及相關(guān)蛋白發(fā)揮作用；PLG 則可以調(diào)控細胞增殖?；|(zhì)金屬蛋白酶的激活（Activation of matrix metalloproteinases）信號通路與膠原蛋白降解（Collagen degradation）信號通路同樣涉及MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9 等靶點，表明MMPS 靶點在咖啡酰奎寧酸類化合物抗Ⅱ型糖尿病方面發(fā)揮著極其重要的作用。MyD88-independent TLR4 cascade 信號通路則主要涉及CASP8、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8 靶點。MAPK 是一組能被不同的細胞外刺激，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、細胞應(yīng)激等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)控細胞的生長、存活及分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種細胞生理病理過程[19]。MAPK 在炎癥條件下還可以激活與胰島素抵抗密切相關(guān)的JNK 通路和P38 通路，進而發(fā)揮治療糖尿病的作用[20]。綜上所述，一條信號通路可涉及多個基因靶點，一個基因靶點可參與多個信號通路，證實了咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病是一個涉及多靶點、多通路的復(fù)雜過程。

表2 KEGG 通路富集分析相關(guān)基因Table 2 Related genes for KEGG pathway enrichment analysis

圖5 咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的作用通路與其相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)分析Fig.5 Network analysis of the pathways of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes and their related targets

2.5 分子對接驗證

為了驗證咖啡?？鼘幩犷惢衔镱A(yù)測靶點的準確性，本研究采用AutoDock Vine 軟件對3 個關(guān)鍵成分和3 個靶點進行分子對接，以自由結(jié)合能（binding energy）作為篩選條件，結(jié)合能越小表示對接結(jié)果越好。對于多構(gòu)象的對接結(jié)果，篩選出結(jié)合能最低的對接構(gòu)象，如表3所示。化合物與分子靶點對接得分均大于5.0，表明分子對接結(jié)果良好，驗證了網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建預(yù)測的準確性。運用Pymol 軟件，根據(jù)結(jié)合能的大小選出每個靶點蛋白對接最好的化合物進行可視化分析，結(jié)果如圖6所示，其中IGF1R 與綠原酸、JAK1 與異綠原酸A 和RPS6KB1 與1,3,5-O-三咖啡酰奎寧酸均可以形成氫鍵，為進一步整合探析咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病提供了理論參考。

圖6 IGF1R、JAK1、RPS6KB1 與3 個關(guān)鍵成分的最佳對接構(gòu)象Fig.6 Optimal docking conformation of IGF1R,JAK1,RPS6KB1 and the three key components

表3 3 個靶點與3 個關(guān)鍵成分的分子對接得分Table 3 Molecular docking scores of 3 targets and 3 key components

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，借助相關(guān)數(shù)據(jù)庫和軟件對咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病的作用靶點及作用機制進行了全面系統(tǒng)的分析。研究結(jié)果顯示，通過分析得出咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關(guān)鍵靶點有37 個，靶點與靶點之間的相互關(guān)系達518 條。其作用機制主要涉及細胞外基質(zhì)降解、基質(zhì)金屬蛋白酶的激活和膠原降解等通路、主要涉及AKT1、MMP3、MMP9、HIF1A、IGF1R、MAPK8 等靶點，與目前研究的某些藥物作用于II 型糖尿病的靶點、通路基本相符[21?24]，驗證了咖啡酰奎寧酸類組分具有多成分、多靶點、多通路的特點。

王馨苑等[25]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子對接研究了黃連素治療II 型糖尿病的作用機制，結(jié)果顯示黃連素能夠通過與AKT1、MMP9 等核心靶點的穩(wěn)定結(jié)合，起到治療II 型糖尿病的作用。在機體組織缺氧時，可激活缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α，而HIF-1α表達的增多會進一步加重神經(jīng)纖維的缺血缺氧，這可能為糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機制之一[26]。呂翠巖等[27]研究發(fā)現(xiàn)抑制糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)HIF-1αmRNA 的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達，可以達到治療糖尿病的效果。MAPK 信號通路為胰島素信號的級聯(lián)通路，其可以通過多種途徑調(diào)節(jié)肝臟代謝，還可以通過上調(diào)GLUT4 的表達，促進糖的吸收與利用，增加胰島素敏感性和改善胰島素抵抗，與葡萄糖穩(wěn)態(tài)有密切的關(guān)系[28?29]。葛凌等[30]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可有效減輕大鼠外周胰島素抵抗，其作用機制可能是槲皮素激活了胰腺組織中FGF21/MAPK 信號通路，證實了MAPK 信號通路在治療II 型糖尿病中的作用。Li 等[31]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌存在明顯心肌纖維化，通過硫化氫（H2S）干預(yù)后，糖尿病大鼠心肌纖維化明顯減輕，心肌組織中膠原蛋白I 的表達水平顯著下降，且MMP-8 蛋白表達水平也明顯降低，而MMPs 的表達受MAPK 通路的調(diào)控[32]，表明H2S 改善糖尿病大鼠心肌纖維化與膠原蛋白降解以及MAPK 信號通路有關(guān)。這些研究報道表明通過網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測咖啡酰奎寧酸類化合物的作用靶點和通路具有可行性，證實了咖啡?？鼘幩犷惢衔镏委烮I 型糖尿病具有多靶點、多通路的特點，這是傳統(tǒng)“一藥一靶點”模式難以做到的，而這也符合中藥多成分、多靶點、多通路對疾病起到綜合治療作用的特點。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預(yù)測了咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的作用靶點及作用機制，闡明該類成分通過多靶點、多通路治療II 型糖尿病，為進一步實驗研究和臨床應(yīng)用提供了新思路、指明了新方向。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學分析也存在一定的局限性，其雖然能較為系統(tǒng)地預(yù)測活性成分作用靶點與作用通路，但預(yù)測結(jié)果不能完全證明其正確性，其作用機制需要開展體外和體內(nèi)實驗進行驗證。