四川地區(qū)精液分析室間質(zhì)量評價(jià)初探

吳應(yīng)碧,鄭 艷,余 林,賈燁菻,應(yīng)麗娟,楊婷婷,徐金艷,李福平

四川大學(xué)華西第二醫(yī)院生殖男科/出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066

目前生育率下降已經(jīng)成為一個(gè)大趨勢[1-2]，全世界不孕不育發(fā)病率為8%～12%，由男性因素導(dǎo)致的不育占40%～50%[3-4]。精液分析為評估男性生育力最基本的檢測項(xiàng)目，在男性不育的診斷、治療和科研中具有極其重要的作用[5]。精液分析與其他檢驗(yàn)項(xiàng)目比較，精液標(biāo)本黏稠度高、非勻質(zhì)性且其檢測是在運(yùn)動狀態(tài)下進(jìn)行，導(dǎo)致精液分析檢測結(jié)果變異系數(shù)(CV)較其他檢驗(yàn)項(xiàng)目大，實(shí)驗(yàn)室間的精液檢測結(jié)果可比性差[6-9]。室間質(zhì)量評價(jià)可增加精液分析實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的可比性，但目前國內(nèi)精液分析室間質(zhì)量評價(jià)整體開展較差，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評價(jià)項(xiàng)目中無精液分析項(xiàng)目，部分地區(qū)如廣東省[6]進(jìn)行了精液分析室間質(zhì)量評價(jià)的初步探索，但還未形成有效的方案，國內(nèi)精液分析室間質(zhì)量評價(jià)整體需要加強(qiáng)。目前四川地區(qū)精液分析整體現(xiàn)狀發(fā)展滯后，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果可比性差[10]，缺乏室間質(zhì)量評價(jià)。所以，本研究擬在四川地區(qū)開展精液分析的室間質(zhì)量評價(jià)活動，探索建立四川地區(qū)精液分析室間質(zhì)量評價(jià)體系，分析各實(shí)驗(yàn)室間精液分析結(jié)果的差異，為提高四川地區(qū)整體精液分析結(jié)果的準(zhǔn)確性及可比性提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1參與室間質(zhì)量評價(jià)單位 四川地區(qū)共17家實(shí)驗(yàn)室參與本次室間質(zhì)量評價(jià)，涵蓋四川地區(qū)6個(gè)市(成都市、綿陽市、攀枝花市、遂寧市、雅安市及達(dá)州市)，其中包括9家檢驗(yàn)科、5家生殖中心及3家男科實(shí)驗(yàn)室。

1.2質(zhì)控品標(biāo)本來源 用于室間質(zhì)量評價(jià)的精液標(biāo)本在四川省人類精子庫收集。在獲得健康志愿者知情同意后收集其精液，志愿者在精液收集前進(jìn)行乙型肝炎表面抗原、抗丙型肝炎抗體、抗梅毒螺旋體抗體、人類免疫缺陷病毒抗原/抗體檢測，結(jié)果均為陰性。

1.3精子濃度質(zhì)控品的制備 選取精子濃度在(10～100)×106/mL、30 min內(nèi)液化、黏稠度正常、圓細(xì)胞濃度<1.0×106/mL的精液標(biāo)本，將精液充分混合后，按每毫升精液中加入100 μL 10%(v/v)甲醛溶液充分混勻，分裝于冷凍管中，密封管口，并在冷凍管外壁貼上質(zhì)控品批號等標(biāo)識，置于4 ℃冰箱儲存。參照CNAS-GL05做均勻性評價(jià)，經(jīng)ANOVA方差分析樣品內(nèi)及樣品間無顯著差異，樣品是均勻的。

1.4精子活力質(zhì)控品的制備 選取兩份不同活力級別的精液標(biāo)本，采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)分別錄制數(shù)個(gè)15 s的視頻，錄制視頻數(shù)(即采集視野數(shù))以能評估到至少200個(gè)精子為限，計(jì)數(shù)前向運(yùn)動精子比例。將兩個(gè)標(biāo)本的所有視頻分別作為精子活力質(zhì)控品1及活力質(zhì)控品2。

1.5精子形態(tài)質(zhì)控品的制備 選取10份濃度>15×106/mL的精液標(biāo)本制作10張形態(tài)涂片，經(jīng)改良巴氏染色后，1 000倍油鏡下選取精子分布均勻的視野，采用高清攝像頭采集圖片，從上述10張涂片采集的圖片中隨機(jī)選取100個(gè)頭部和尾部完整的精子并標(biāo)記編號。

1.6質(zhì)控品發(fā)放 將精子濃度、活力及形態(tài)質(zhì)控品統(tǒng)一發(fā)放給參評單位，48 h內(nèi)按照各自實(shí)驗(yàn)室日常精液分析檢測方法分析質(zhì)控品，并反饋分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1各參評實(shí)驗(yàn)室一般概況 四川地區(qū)共17家實(shí)驗(yàn)室參與本次室間質(zhì)量評價(jià)，其中15家(88.24%)實(shí)驗(yàn)室反饋了檢測結(jié)果，包括7家檢驗(yàn)科、5家生殖中心及3家男科實(shí)驗(yàn)室。其中15家反饋精子濃度檢測結(jié)果，14家反饋精子活力及精子形態(tài)檢測結(jié)果。

2.2實(shí)驗(yàn)室檢測方法比較 各實(shí)驗(yàn)室中濃度檢測使用最多的方法為CASA檢測，活力檢測使用最多的方法為人工檢測，形態(tài)檢測全為人工檢測，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)室檢測方法及計(jì)數(shù)板類型結(jié)果比較[n/n(%)]

2.3實(shí)驗(yàn)室使用計(jì)數(shù)板類型比較 15家實(shí)驗(yàn)室中8家(53.33%)使用計(jì)數(shù)板類型為Makler計(jì)數(shù)板，各1家(6.67%)分別使用Macro計(jì)數(shù)板、精子計(jì)數(shù)池、紅寶石計(jì)數(shù)板及牛鮑計(jì)數(shù)板，3家(20.00%)使用計(jì)數(shù)板類型不清楚。

2.4實(shí)驗(yàn)室精子濃度結(jié)果比較 15家實(shí)驗(yàn)室精子濃度質(zhì)控品檢測結(jié)果的CV值為29.84%，將濃度檢測方法分為CASA方法及其他(人工和全自動)方法，CASA方法CV值(23.96%)低于其他方法CV值(43.16%)。將檢測濃度使用計(jì)數(shù)板深度分為10 μm及非10 μm(3家100 μm、1家20 μm、1家15 μm)，10 μm的計(jì)數(shù)板濃度檢測結(jié)果CV值(24.82%)明顯低于非10 μm濃度檢測結(jié)果CV值(42.66%)，見表2。

表2 15家實(shí)驗(yàn)室精子濃度結(jié)果比較

2.5實(shí)驗(yàn)室精子活力結(jié)果比較 14家實(shí)驗(yàn)室中，活力質(zhì)控品1和2的前向運(yùn)動精子比例的CV值分別為18.30%及12.97%，將活力檢測方法分為人工方法及CASA方法，CASA方法檢測前向運(yùn)動精子的CV值明顯低于人工方法，見表3。

表3 參評實(shí)驗(yàn)室前向運(yùn)動精子結(jié)果比較

2.6實(shí)驗(yàn)室精子形態(tài)結(jié)果比較 14家實(shí)驗(yàn)室中，正常精子形態(tài)百分比的CV值較高，為72.13%。在對100個(gè)精子的形態(tài)評估中，僅有34.00%(34/100)的正?；虍惓＞铀袑?shí)驗(yàn)室評估結(jié)果一致，68.00%(68/100)的精子評估結(jié)果不一致。異常形態(tài)精子中，過量殘留胞漿的CV值最高(96.71%)，見表4。頭部缺陷精子中空泡異常的CV值最高，為65.32%，頸部和中段缺陷中彎曲缺陷的CV值最高，為139.45%，主段缺陷中卷尾缺陷的CV值最高，為115.45%，見表5。

表4 參評實(shí)驗(yàn)室精子形態(tài)質(zhì)控品評估結(jié)果比較

表5 參評實(shí)驗(yàn)室精子形態(tài)不同部位異常結(jié)果比較

3 討 論

本次室間質(zhì)量評價(jià)的質(zhì)控品均在各參評實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，且均由從事精液分析的技術(shù)人員按照日常分析方式進(jìn)行檢測，可反映該實(shí)驗(yàn)室實(shí)際精液分析水平。本次室間質(zhì)量評價(jià)活動雖涵蓋四川地區(qū)6個(gè)市，但僅15家實(shí)驗(yàn)室反饋了檢測結(jié)果，因此該結(jié)果僅反映部分四川地區(qū)醫(yī)療單位精液分析室間質(zhì)量評價(jià)水平。本研究為首次在四川地區(qū)開展精液分析的室間質(zhì)量評價(jià)活動，雖參評實(shí)驗(yàn)室規(guī)模不大，但在此次組織開展室間質(zhì)量評價(jià)活動中，累積了如何組織參評實(shí)驗(yàn)室、如何制訂參評項(xiàng)目及如何制備與分發(fā)質(zhì)控品等方面的經(jīng)驗(yàn)，為后續(xù)大規(guī)模推動四川地區(qū)精液分析室間質(zhì)量評價(jià)活動打下基礎(chǔ)。

此次15家反饋了檢測結(jié)果的單位中有7家(46.67%)在檢驗(yàn)科進(jìn)行精液分析，有文獻(xiàn)提到，多數(shù)檢驗(yàn)科精液分析是按照《全國臨床檢驗(yàn)規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[11]，但《全國臨床檢驗(yàn)規(guī)程》中精液分析的項(xiàng)目、檢測方法及參考值更新較慢，與世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的精液分析標(biāo)準(zhǔn)有差異。目前全國推薦精液分析參考標(biāo)準(zhǔn)使用《WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen》第5版[12](以下簡稱WHO第5版)，因?yàn)樵撌謨栽敿?xì)介紹了精液分析不同項(xiàng)目的具體操作、方法、儀器、參考值及質(zhì)量控制措施等。

此次室間質(zhì)量評價(jià)15家實(shí)驗(yàn)室精子濃度質(zhì)控品檢測結(jié)果的CV值較高(29.84%)。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的精子濃度檢測結(jié)果CV值也較高，比利時(shí)[13]文獻(xiàn)中CV值為19.2%，國內(nèi)廣東省[6]文獻(xiàn)中CV值為34.09%，意大利[9]文獻(xiàn)中的CV值分別為46.65%、59.03%和75.14%。分析精子濃度檢測結(jié)果的CV值高于其他檢驗(yàn)項(xiàng)目的原因可能為各實(shí)驗(yàn)室參考標(biāo)準(zhǔn)、使用方法及操作等不一致，如加樣前混勻次數(shù)及混勻方式不一致。15家實(shí)驗(yàn)室中使用CASA方法檢測精子濃度的CV值為23.96%，低于其他方法檢測的CV值(43.16%)。對于精子濃度和活力分析，CASA結(jié)果較人工分析方法更客觀準(zhǔn)確，但不同的CASA分析儀器由于其分析原理不同、幀率不同、配備的精子計(jì)數(shù)池深度不同，結(jié)果會有很大差異[14-15]，仍需注意使用和評估各類型的CASA。不同計(jì)數(shù)板深度對精液分析結(jié)果也會產(chǎn)生影響，精子計(jì)數(shù)板深度與前向運(yùn)動精子呈負(fù)相關(guān)，精子計(jì)數(shù)板深度與濃度結(jié)果呈正相關(guān)[16-17]。CASA計(jì)數(shù)精子時(shí)建議使用深度為10 μm的計(jì)數(shù)板，目的是確保精子既形成單層分布又能自由活動，從而保證視野內(nèi)所有的精子都能被軟件捕捉識別。

活力質(zhì)控品1和2前向運(yùn)動精子比例的CV值分別為18.30%和12.97%，均小于20%，較濃度及形態(tài)的CV值低，這一結(jié)果可能是由于活力質(zhì)控品為視頻，不需要各實(shí)驗(yàn)室分析前進(jìn)行任何處理，從而降低了檢測的誤差和CV值。CASA檢測前向運(yùn)動精子比例的CV值明顯低于人工方法，提示CASA較人工方法分析更客觀，有更低的變異性。

本研究中，正常精子形態(tài)百分比的CV值為72.13%，國內(nèi)廣東省文獻(xiàn)中精子形態(tài)的CV值為62.01%[6]，比利時(shí)[13]及意大利[9]文獻(xiàn)中的CV值分別為79.4%及80%，精子形態(tài)的CV值遠(yuǎn)高于濃度及前向運(yùn)動精子比例的CV值，分析原因可能主要為：(1)不同實(shí)驗(yàn)室參考標(biāo)準(zhǔn)不一致，在WHO的連續(xù)幾個(gè)版本中，評估標(biāo)準(zhǔn)的變化及臨界值的變化造成檢測人員對精子形態(tài)理解不一致；(2)由于14家實(shí)驗(yàn)室全部采用人工方法進(jìn)行形態(tài)分析，人為主觀意識強(qiáng)，缺乏客觀性，同一實(shí)驗(yàn)室不同人員對同一精子的認(rèn)識均存在差異，對處于臨界形態(tài)的精子，同一技術(shù)人員兩次分析也可能存在不一致結(jié)果等。FILIMBERTI等[9]文獻(xiàn)中對參評實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行形態(tài)教學(xué)課程后，形態(tài)CV值較教學(xué)前明顯下降，證實(shí)了形態(tài)教學(xué)課程的重要性。

在異常精子形態(tài)中，頭部缺陷較其他缺陷CV值低，過量殘留胞漿CV最高，為96.71%。頭部缺陷中空泡異常的CV值最高(65.32%)，頸部和中段缺陷中頸部彎曲缺陷CV值最高(139.45%)，主段缺陷中卷尾缺陷CV值最高(115.45%)，考慮原因首先可能為多數(shù)實(shí)驗(yàn)室更關(guān)注頭部缺陷，尤其注重頭部缺陷中精子外形及頂體大小的缺陷，而對其他缺陷類型(如空泡及彎曲等)關(guān)注及認(rèn)識較少。其次，WHO第5版中對不同缺陷未給出具體定義，如卷尾的尾部需要卷曲到什么程度才能判斷為卷尾，是否需要>360°才判斷為卷尾；頸部彎曲未定義具體彎曲角度等，致使各實(shí)驗(yàn)室對精子形態(tài)有不同的理解及判斷標(biāo)準(zhǔn)等。

綜上所述，四川地區(qū)精液分析室間質(zhì)量評價(jià)中，前向運(yùn)動精子比例CV值最低，其次為濃度CV值，正常精子形態(tài)百分比CV值最高。為使四川地區(qū)不同實(shí)驗(yàn)室精液分析結(jié)果具有可比性，建議采取如下措施：首先建議各實(shí)驗(yàn)室采用WHO第5版作為實(shí)驗(yàn)室精液分析參考標(biāo)準(zhǔn)，參考該標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況選擇適合的方法和儀器設(shè)備，建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，對于主觀性強(qiáng)的精子形態(tài)分析可首先做好實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部人員比對，如采取共同閱片統(tǒng)一認(rèn)識等方法。筆者希望通過本研究摸索建立精液分析的室間質(zhì)量評價(jià)體系，推進(jìn)各實(shí)驗(yàn)室精液分析技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化操作及室內(nèi)質(zhì)量控制，提高四川地區(qū)各實(shí)驗(yàn)室檢測水平，建立四川地區(qū)精液分析室間質(zhì)評體系，最終達(dá)到實(shí)驗(yàn)室間精液分析結(jié)果互認(rèn)。