杜泊羊冷凍胚胎移植效果的影響因素及羔羊早期生長(zhǎng)性能研究

張 菊，亓 鵬，冷學(xué)義，肖發(fā)沂*，徐相亭*

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061；2.濰坊三農(nóng)偉業(yè)飼料科技有限公司，山東濰坊 262113）

杜泊綿羊（簡(jiǎn)稱杜泊羊，Dorper sheep）原產(chǎn)南非，有黑頭杜泊羊和白頭杜泊羊2 個(gè)類型，可以生產(chǎn)出世界公認(rèn)的“鉆石級(jí)”羊肉，被譽(yù)為“南非國(guó)寶”[1]。優(yōu)秀的杜泊羊被引入澳大利亞后，經(jīng)過更加系統(tǒng)地選種和育種，其生產(chǎn)性能得到進(jìn)一步提升[2-3]。濰坊普蘭特漢種羊有限公司從澳大利亞南部珀斯Plantagenet Dorper 種羊場(chǎng)引進(jìn)新鮮冷凍胚胎，通過對(duì)受體羊（湖羊和小尾寒羊）進(jìn)行同期發(fā)情處理[4-6]，將胚胎移植至受體羊的子宮角部位，經(jīng)受體羊妊娠分娩后獲得純種黑頭杜泊羊。

近期，胚胎移植技術(shù)在國(guó)內(nèi)發(fā)展比較迅速，但成功率與國(guó)外存在一定差距。影響胚胎移植效果的因素很多，目前的研究多集中在胚胎、受體以及胚胎與受體的相互作用3 個(gè)方面，其中胚胎質(zhì)量的優(yōu)劣和胚胎發(fā)育階段是影響胚胎移植成功率的重要因素，另外受體因素對(duì)移植成功率也有很大影響，包括同期發(fā)情方法、發(fā)情狀況、外源性激素使用情況以及受體的年齡和季節(jié)等[7]。本研究從冷凍胚胎的發(fā)育階段、受體羊同期發(fā)情的季節(jié)、受體品種、卵巢上不同黃體的個(gè)數(shù)、受體羊的營(yíng)養(yǎng)狀況、移植胚胎的數(shù)量分析其對(duì)胚胎移植效果的影響，并測(cè)定羔羊早期生長(zhǎng)性能，旨在為杜泊羊胚胎移植的推廣和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理 純種黑頭杜泊羊冷凍胚胎均購(gòu)自澳大利亞，種源具有四代系譜，基因純正優(yōu)良。受體羊?yàn)樾∥埠蚝秃?，健康無傳染性疾病，無繁殖性疾病。小尾寒羊和湖羊?yàn)?.5～3 歲，膘情適中。2016年4 月進(jìn)行第1 批500 枚質(zhì)量合格的冷凍胚胎的移植，選擇小尾寒羊180 只、湖羊270 只作為受體羊進(jìn)行同期發(fā)情。2016 年11 月進(jìn)行第2 批861 枚質(zhì)量合格冷凍胚胎的移植，選擇受體羊湖羊700 只進(jìn)行同期發(fā)情。試驗(yàn)在濰坊普蘭特漢種羊有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。羊飼料以玉米青貯飼料、花生秧、干苜蓿、胡蘿卜為主，自由飲水，羊圈懸掛礦物質(zhì)添磚。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 羊用孕酮陰道栓（CΙDR，Zoetis Ιnc.，新西蘭生產(chǎn)），含孕酮0.3 g/支；孕馬血清促性腺激素（PMSG，寧波第二激素廠），規(guī)格1 000 ΙU/支。

1.3 同期發(fā)情 受體羊放入 CΙDR（記為第0 天），在同期發(fā)情后第 14 天取出CΙDR 栓，注射PMSG 500 ΙU。第15 天進(jìn)行公羊試情，第17～18 天結(jié)束試請(qǐng)。對(duì)發(fā)情正常的受體母羊進(jìn)行胚胎移植。

1.4 胚胎移植

1.4.1 胚胎解凍 鑷子取出凍胚管，放入30℃的水浴鍋解胚（時(shí)間約20 s），記錄，剪頭，用推針推至培養(yǎng)皿中，查看胚胎個(gè)數(shù)與質(zhì)量，解凍后的胚胎通過體視顯微鏡觀察分為3 個(gè)級(jí)別，優(yōu)良胚胎和普通胚胎可以進(jìn)行移植。將質(zhì)量合格的胚胎放入配好的營(yíng)養(yǎng)液中，激活約18 min，40×顯微鏡下取胚胎，放入注射器內(nèi)。

優(yōu)良胚胎：胚胎的形態(tài)典型，分裂球的輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)致密，大小、色澤均勻，透明帶完整。

普通胚胎：與典型的胚胎相比，稍有變形，但分裂球的輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)較致密，分布均勻，透明帶完整。

不良胚胎：形態(tài)有明顯變異，卵裂球排列松散，輪廓不清晰或者部分不清晰，細(xì)胞質(zhì)不致密，分布不均勻，色澤發(fā)暗，有的破裂呈沙粒樣，有碎片；透明帶不完整。

1.4.2 胚胎移植 對(duì)受體羊進(jìn)行麻醉，腹部刮毛，消毒。左側(cè)乳上10 cm 插入內(nèi)視鏡，右側(cè)對(duì)應(yīng)位置切升皮膚2 cm，刀尖深入切開1 cm 將持宮鉗深入，夾出子宮角（有黃體），用0.9%的滅菌生理鹽水沖洗，針刺入子宮角，將解凍好的胚胎注入子宮內(nèi)沖洗后，放入腹腔。用一次性金屬縫合夾，將傷口夾好，10 d 后金屬縫合夾自動(dòng)脫落。用碘酊消毒傷口（如有出血，止血后夾好消毒）。并進(jìn)行胚胎移植后的記錄。最后在受體羊在腿部肌肉部位注射抗生素。

在胚胎移植后 30～35 d，進(jìn)行公羊試情法或超聲波（B 超）檢測(cè)，進(jìn)行妊娠診斷。

1.5 杜泊羊冷凍胚胎移植效果的影響因素 2016 年4 月（春季）和2016 年11 月（秋季），對(duì)湖羊進(jìn)行同期發(fā)情和胚胎移植，同期發(fā)情處理前兩個(gè)月對(duì)受體羊進(jìn)行補(bǔ)飼，比較季節(jié)對(duì)同期發(fā)情和胚胎移植效果的影響。2016年4 月，研究受體羊的品種（小尾寒羊和湖羊）、卵巢上不同黃體的個(gè)數(shù)（1 個(gè)、2～3 個(gè)）和受體羊的營(yíng)養(yǎng)狀況（中上等膘情、下等膘情）對(duì)胚胎移植效果的影響。參照國(guó)際肉羊評(píng)分系統(tǒng)，根據(jù)體型外貌、體重、年齡等指標(biāo)，對(duì)小尾寒羊和湖羊進(jìn)行總分為5 分的評(píng)定打分。最佳是5 分，優(yōu)良是4 分，普通是3 分，較差是2 分，最差是1 分。5～4 分屬于中上等膘情，3～2 分是下等膘情，1 分不能作為受體羊。根據(jù)冷凍胚胎檔案中對(duì)胚胎胚齡的描述，分為桑椹胚、晚期桑椹胚、早期囊胚、囊胚和擴(kuò)張囊胚，觀察解凍后5 個(gè)不同胚胎發(fā)育階段對(duì)移植后妊娠率的影響。根據(jù)受體羊的膘情，移入2 枚或1 枚胚胎，統(tǒng)計(jì)移植胚胎的數(shù)量對(duì)妊娠率的影響。

1.6 羔羊早期生長(zhǎng)性能的測(cè)定 母羊臨近生產(chǎn)，做好分娩準(zhǔn)備工作。羔羊出生后，迅速去除其口、鼻、耳中的黏液，讓母羊舔凈羔羊身上的黏液，稱測(cè)出生重，打耳標(biāo)并做好記錄。羔羊采取隨母哺乳，在羔羊生長(zhǎng)至1 月齡、2 月齡和3 月齡時(shí)稱重。3 月齡斷奶后，采取全舍飼。飼養(yǎng)管理按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。按口蹄疫、羊痘、支原體等疫苗的免疫接種程序接種，定期驅(qū)蟲。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010 軟件整理后，采用t檢驗(yàn)，使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同季節(jié)對(duì)受體羊的同期發(fā)情和胚胎移植的影響如表1 所示，2016 年11 月供體羊湖羊的發(fā)情率高于4月湖羊（P＜0.05），11 月和4 月的妊娠率分別為61.7%和61.8%（P＞0.05）。

表1 不同季節(jié)受體羊的同期發(fā)情和胚胎移植效果

2.2 不同品種受體羊的同期發(fā)情和胚胎移植的效果 由表2 可知，湖羊和小尾寒羊的同期發(fā)情率分別為88.1%和90.6%，妊娠率分別為61.8%和60.6%（P＞0.05）。

表2 湖羊和小尾寒羊同期發(fā)情和胚胎移植的效果

2.3 卵巢不同黃體個(gè)數(shù)對(duì)妊娠率的影響 由表3 可知，小尾寒羊雙側(cè)卵巢上有1 個(gè)黃體的移植后妊娠率為61.2%，有2～3 個(gè)黃體的移植后妊娠率為59.6%（P＞0.05）；湖羊雙側(cè)卵巢上有1 個(gè)黃體的移植后妊娠率為62.0%，有2～3 個(gè)黃體的移植后妊娠率為61.6%（P＞0.05）。

表3 不同黃體個(gè)數(shù)對(duì)妊娠率的影響

2.4 受體羊營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)胚胎移植效果的影響 如表4 所示，小尾寒羊和湖羊的營(yíng)養(yǎng)狀況均對(duì)妊娠率有顯著影響，中上等膘情小尾寒羊和湖羊移植后的妊娠率均顯著高于下等膘情。

表4 受體羊營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)妊娠率的影響

2.5 胚胎發(fā)育階段對(duì)妊娠率的影響 如表5 所示，移植擴(kuò)張囊胚的受體羊妊娠率為30.0%，顯著低于其他4 個(gè)胚胎發(fā)育階段，其他4 個(gè)胚胎發(fā)育階段的妊娠率差異不顯著。

表5 胚胎發(fā)育階段對(duì)妊娠率的影響

2.6 移植胚胎數(shù)對(duì)妊娠率的影響 由表6 可見，2016 年4 月，小尾寒羊組移植200 枚冷凍胚胎，其中110 只小尾寒羊移入單胚，妊娠率61.8%；45 只小尾寒羊移入雙胚，妊娠率57.8%（P＞0.05）；剩下的300 枚冷凍胚胎，172 只湖羊移入單胚，妊娠率64.0%；64 只湖羊移入雙胚，妊娠率56.3%，兩者差異顯著。2015 年11 月，湖羊組移植861 枚冷凍胚胎，439 只湖羊移入單胚，妊娠率63.1%；211 只湖羊移入雙胚，妊娠率58.8%，兩者差異不顯著。對(duì)以上數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，移植雙胚的妊娠率低于移植單胚妊娠率。

表6 單胚和雙胚移植情況統(tǒng)計(jì)

2.7 羔羊早期生長(zhǎng)發(fā)育情況 如表7 所示，小尾寒羊作為受體羊和湖羊作為受體羊所產(chǎn)的羔羊，出生重及1、2、3 月齡體重均沒有顯著性差異，但是小尾寒羊所產(chǎn)羔羊各階段體重均高于湖羊所產(chǎn)羔羊。小尾寒羊和湖羊所產(chǎn)羔羊的早期體重和成活率與澳大利亞提供的羔羊生長(zhǎng)數(shù)據(jù)基本一致。

表7 羔羊早期生長(zhǎng)發(fā)育情況

3 討論

肉羊胚胎移植效果在不同地區(qū)差異較大，主要受胚胎、受體和胚胎與受體的相互作用的影響[8]。本實(shí)驗(yàn)中所使用的受體羊都是1.5～3 歲的小尾寒羊和湖羊，經(jīng)統(tǒng)一飼養(yǎng)與管理，在一定程度上排除了外界環(huán)境對(duì)受體羊的影響。

季節(jié)對(duì)受體羊的同期發(fā)情率有影響。綿羊是短日照季節(jié)性多次發(fā)情的家畜，發(fā)情季節(jié)為 9～11 月[4]。本研究發(fā)現(xiàn)11 月同期發(fā)情率明顯高于4 月，但11 月與4 月的妊娠率沒有明顯差異[9-13]。4 月的同期發(fā)情率低，說明一部分綿羊?qū)ν庠醇に夭粔蛎舾?。但能夠正常發(fā)情的綿羊就是能夠正常排卵的受體羊，在促乳素、雌激素和孕激素等作用下，受體羊的子宮已經(jīng)為胚胎附植做好了準(zhǔn)備，因此妊娠率沒有明顯差異。另外，研究表明秋季和冬季進(jìn)行同期發(fā)情和胚胎移植有一定優(yōu)勢(shì)[14]，需要結(jié)合羊場(chǎng)具體的生產(chǎn)安排選擇合適的季節(jié)進(jìn)行胚胎移植。

湖羊和小尾寒羊均屬于我國(guó)優(yōu)良地方品種，兩者的同期發(fā)情率和妊娠率沒有顯著性差異，均可作為胚胎移植的受體羊。湖羊母羊的成年體重在40 kg 以上，小尾寒羊母羊的成年體重在50 kg 以上。湖羊每日的飼喂量少于小尾寒羊，因此，湖羊作為受體羊在一定程度上可以節(jié)約飼料成本。

綿羊受體血漿中的孕激素濃度與黃體的數(shù)量和大小有關(guān)，在妊娠初期孕激素有利于胚泡附植[5]。本研究中，受體羊卵巢上的黃體個(gè)數(shù)對(duì)移植胚胎的存活率沒有顯著性影響[14-15]。受體羊進(jìn)行胚胎移植后，孕酮會(huì)降低子宮肌的興奮性，刺激子宮分泌子宮乳，移植母體對(duì)胎兒抗原的免疫反應(yīng)等，有助于胚胎附植。孕激素水平達(dá)到妊娠所需的閾值就可以滿足胚泡附植，繼而維持妊娠，研究孕激素何時(shí)升高到閾值水平有利于把握胚胎移植的最佳時(shí)機(jī)[16]。

胚胎移植后的妊娠率與受體羊的膘情有直接聯(lián)系。當(dāng)受體羊的膘情良好時(shí)，大部分胚胎著床以后都能繼續(xù)發(fā)育并順利生長(zhǎng)。膘情中上等的小尾寒羊和湖羊胚胎移植后的妊娠率高，所以在進(jìn)行胚胎移植前后，加強(qiáng)受體羊的飼養(yǎng)管理非常重要[15,17]。

冷凍胚胎移植后的成功率受很多因素影響，胚齡是非常重要的影響因素[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植擴(kuò)張囊胚的受體羊妊娠率為30.0%，顯著低于其他4 個(gè)胚胎發(fā)育階段，移植囊胚的妊娠率最高，為62.5%。囊胚期胚胎內(nèi)細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞對(duì)外界不良環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，有利于移植后胚胎存活。在擴(kuò)張囊胚階段，隨著胚內(nèi)細(xì)胞的不斷分化，胚內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和充滿液體的囊胚腔，胚胎的均一性下降，可能影響了冷凍胚胎的質(zhì)量和移植后的妊娠率[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)張囊胚移植后的妊娠率很低，不建議移植擴(kuò)張囊胚。目前選擇移植的胚胎主要是囊胚和桑椹胚，但是桑椹胚與囊胚移植后妊娠率的高低在文獻(xiàn)中報(bào)道不一致[19-20]，具體的影響機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

從移植胚胎數(shù)對(duì)妊娠率的影響來看，受體羊移植雙胚的妊娠率較移植單胚低5%，這與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果不一致[19,23-25]。胚胎能否在受體羊體內(nèi)附植成功與受體羊體內(nèi)生殖激素的水平有重要關(guān)系[26-29]，妊娠初期，孕酮與雌激素協(xié)同，促進(jìn)子宮形成分泌性子宮內(nèi)膜，黏膜層加厚，有利于胚胎附植。如果此時(shí)孕酮水平不足，容易發(fā)生流產(chǎn)。分析移植雙胚較單胚低的原因，可能是受體羊孕激素水平低造成的。

羔羊早期生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，小尾寒羊作為受體羊所產(chǎn)羔羊的出生重、1 月齡、2 月齡和3 月齡的體重均高于湖羊作為受體羊所產(chǎn)羔羊，但沒有顯著性差異[30]。小尾寒羊作為受體，胎兒出生重高于湖羊作為受體羊的原因，與胚胎生活的子宮內(nèi)環(huán)境有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同發(fā)育階段的胚胎對(duì)移植妊娠率有一定影響，擴(kuò)張囊胚的妊娠率30.0%，顯著低于桑椹胚、晚期桑椹胚、早期囊胚和囊胚的妊娠率，所以不建議移植擴(kuò)張囊胚；中上等營(yíng)養(yǎng)水平受體羊的妊娠率顯著高于下等營(yíng)養(yǎng)水平受體羊，在受體羊的飼喂過程中一定要保證充足的營(yíng)養(yǎng)水平。在山東濰坊地區(qū)，小尾寒羊和湖羊均可以作為胚胎移植的受體，但小尾寒羊體型偏大，每日飼料消耗偏多，所以湖羊作為受體羊在節(jié)約飼料方面更有優(yōu)勢(shì)。