延黃牛GSTP1 基因第6 外顯子多態(tài)性及生產(chǎn)性狀的相關(guān)性研究

王 晶，曹 陽，魏銘宏，吳思慧，呂香洲，趙玉民*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林公主嶺 136000；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延邊 133002；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉牛遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林公主嶺 136100；4.吉林省肉牛繁育及養(yǎng)殖技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林長春 130033）

延黃牛是以利木贊牛為父本、延邊黃牛為母本，經(jīng)雜交合成、橫交固定和群體繼代選育而成的品種。該品種含延邊黃牛血液75%、利木贊牛血液25%[1]，經(jīng)細(xì)胞遺傳、數(shù)量遺傳、血液蛋白質(zhì)多態(tài)性與分子生物學(xué)技術(shù)檢測，其遺傳性能穩(wěn)定[2]。延黃牛肉質(zhì)細(xì)嫩多汁、鮮美適口、營養(yǎng)豐富[3]，是吉林省延邊朝鮮自治州的主要肉牛品種。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1（Glutathione S-Transferase Pi 1，GSTP1），屬于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶家族中的P 類，約占GST 家族酶活性的90%[4]。人體組織中，GSTP1基因是位于11 號(hào)染色體的長臂13 區(qū)的2 號(hào)亞區(qū)上，基因全長2.8 kb，編碼210 個(gè)氨基酸，共有7 個(gè)外顯子[5]。GSTP1基因廣泛表達(dá)于人體組織，也分布于植物、昆蟲和細(xì)菌等多種物種體內(nèi)[6]，可催化谷胱甘肽（GSH）和親電化學(xué)物質(zhì)之間硫醚鍵的形成，在活性氧物種（ROS）的解毒和氧化還原反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。GSTP1的缺乏導(dǎo)致線粒體中活性氧的積累，并導(dǎo)致它們釋放凋亡誘導(dǎo)因子（如細(xì)胞色素c），從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。GSTP1 是蛋白質(zhì)的硫代谷胱甘肽化循環(huán)中的關(guān)鍵調(diào)控酶[8]，GSTP1是參與異生物質(zhì)代謝的重要基因[6]。目前，針對(duì)GSTP1基因的研究多在人類癌癥及腫瘤疾病方面，關(guān)于動(dòng)物肉質(zhì)及生長性狀方面的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以延黃牛為研究對(duì)象，利用Sanger 測序的方法檢測GSTP1基因的第6 外顯子多態(tài)性，并分析其與延黃牛生產(chǎn)性狀的相關(guān)性，為篩選影響延黃牛肉質(zhì)性狀的候選基因提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取89 頭16 月齡延黃牛母牛（由吉林省琿春市吉興牧業(yè)公司提供）。采集延黃牛耳組織約2 g 放入含有75%乙醇的試管中，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器 動(dòng)物組織DΝA 提取試劑盒（北京solarbio 生物有限公司）、2x Taq Master Mix（康為世紀(jì)生物科技公司）；超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher 公司）、PCR 儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1.3 DΝA 的提取 根據(jù)說明書提取89 頭延黃牛耳組織基因組DΝA，采用超微量分光光度計(jì)檢測提取的DΝA濃度與純度，所提取的DΝA 用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳定性檢測。

1.4 PCR 引物設(shè)計(jì)與合成 參考ΝCBΙ 中公布的牛GSTP1基因CDS 序列（登錄號(hào)：BC102704.1），利用Ensemble查找GSTP1基因第6 外顯子，使用Primer5.0 設(shè)計(jì)外顯子引物，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物信息如下：引物長365 bp，退火溫度60℃，上游引物序列：5'-GAGACTCAGCCTCTGAAATGGAC-3'；下游引物序列：5'-CCATGACTTCCGTGCTGTCTC-3'。

1.5 PCR 反應(yīng)體系及程序 PCR 反應(yīng)體系（10 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL（1×），上下游引物（0.5 μmol/L）各0.5 μL，模 板DΝA（＜250 ng/50 μL）1 μL，ddH2O 補(bǔ)至20 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，34 個(gè)循環(huán)（94℃ 30 s、退火溫度30 s、72℃延伸1 min），72℃終延伸5 min，產(chǎn)物4℃保存。

1.6 延黃牛GSTP1基因SΝPs 檢測 對(duì)89 頭延黃牛PCR 產(chǎn)物取4 μL 進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)檢測符合預(yù)期條帶位置后，將PCR 產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行Sanger 測序。使用DΝAman、Chromas 軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，分析堿基變化情況并篩選SΝP 位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)基因型及基因型頻率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析以確定SΝP 位點(diǎn)不同基因型與生產(chǎn)及肉用性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。使用Excel 2010 計(jì)算基因（型）頻率、Hardy-Weinberg 的卡方適合性檢測、遺傳純和度（Ho）、遺傳雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Νe）和多態(tài)信息含量（PΙC）。公式如下：

其中，公式中n 為等位基因數(shù)；Pi、Pj 表示為第i、j 個(gè)等位基因頻率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 延黃牛GSTP1基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)第6 外顯子片段長度與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致（圖1），得到的擴(kuò)增條帶無雜帶且清晰明亮，可用于測序。

圖1 GSTP1 基因第6 外顯子PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 序列分析 對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在GSTP1基因的第6 外顯子編碼區(qū)上發(fā)現(xiàn)G/A 突變，運(yùn)用Chromas 軟件對(duì)測序峰波圖進(jìn)行比對(duì)，確定GSTP1基因第6 外顯子在Chr29:45444249 bp 處發(fā)生突變，與公布序列（登錄號(hào)：ΝC_037356.1）比對(duì)，定義純合基因型為GG 型，雜合基因型為GA 型，AA 型未發(fā)現(xiàn)（圖2、圖3）。G/A 突變未導(dǎo)致氨基酸改變（圖4）。

圖2 延黃牛GSTP1 基因第6 外顯子序列比對(duì)

圖3 GG 和GA 基因型測序峰波圖

圖4 GSTP1 基因第6 外顯子氨基酸比對(duì)

2.3 延黃牛GSTP1基因遺傳學(xué)分析 對(duì)延黃牛GSTP1基因第6 外顯子基因（型）頻率等指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算（表1），結(jié)果顯示GG 和GA 基因型頻率分別為75.28%和24.72%；G 和A 的基因頻率分別為87.64%和12.26%。由表2 可知，延黃牛GSTP1基因第6 外顯子Chr29:45444249 bp 處G/A 突變的Ho 較 高，He 較 低，PΙC＜0.25，處于低度多態(tài)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)并對(duì)照臨界值表得到P值范圍，處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

表1 延黃牛GSTP1 基因第6 外顯子基因（型）頻率

表2 延黃牛GSTP1 基因遺傳變異參數(shù)

2.4GSTP1基因第6 外顯子不同基因型肉用性狀相關(guān)性如表3 所示，GSTP1基因第6 外顯子不同基因型與胸圍、腹圍和體重差異顯著。

表3 GSTP1 基因第6 外顯子不同基因型肉用性狀相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶家族（GSTs）保護(hù)活性物質(zhì)，減少氧化壓力，其家族成員酶與信號(hào)激酶的非酶相互作用調(diào)節(jié)凋亡過程[9]。GSTP1是可溶性GST 蛋白超家族中最普遍的成員，主要負(fù)責(zé)催化谷胱甘肽（GSH）與外源和內(nèi)源親電子試劑的結(jié)合[10]。在細(xì)胞解毒和抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)谷胱甘肽與不同疏水和親電化合物的結(jié)合以及以還原型谷胱甘肽為媒介在還原有機(jī)過氧化物中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)延黃牛GSTP1基因進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)篩選，發(fā)現(xiàn)在第6 外顯子的Chr29:45444249 bp 處的G/A 突變屬同義突變，有GG 和GA 2 種基因型，GG 型為優(yōu)勢基因型占75.28%，AA 型為24.72%，G 和A 的基因頻率分別為87.64%和12.26%，純和度0.783，雜合度0.217，等位基因數(shù)1.277，PΙC＜0.25 為低度多態(tài)，卡方檢驗(yàn)樣本符合Hardy-Weinberg 定律。GSTP1基因第6外顯子不同基因型與胸圍、腹圍和體重存在顯著差異，對(duì)比GG 基因型與GA 型生產(chǎn)性狀，發(fā)現(xiàn)GA 型的體高、體斜長、十字部高、胸圍、腹圍、管圍、體重、背膘厚和肌內(nèi)脂肪平均值均高于GG 型。就整體而言，GA 型個(gè)體生產(chǎn)及肉質(zhì)性狀優(yōu)于GG 型個(gè)體，但是其為雜合子，GA 型延黃牛是否為優(yōu)質(zhì)基因型還需在更大的樣本群中進(jìn)行檢驗(yàn)。

GSTP1 是多功能酶，參與氧化應(yīng)激產(chǎn)物、親電化合物和致癌物引起的有毒物質(zhì)的解毒。它們?cè)诋惿镔|(zhì)代謝的第二階段與谷胱甘肽結(jié)合[12]。GSTP1參與細(xì)胞解毒和抗氧化應(yīng)激，有利于動(dòng)物死后肉色色素的穩(wěn)定性。由于每個(gè)特定密碼子序列的折疊不盡相同，基因編碼區(qū)突變的累積數(shù)量可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，高活性的GSTP1 酶導(dǎo)致脂質(zhì)氧化過程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)濃度更低，防止肌肉的色素蛋白（Mb）氧化，從而保持肌肉顏色的穩(wěn)定性[13]。Chen[7]等臨床研究表明，GSTP1作為一種腫瘤抑制候選基因，通常在肝炎患者的肝臟樣本中下調(diào)。Bartolini 等[8]研究發(fā)現(xiàn)GSTP1 是不同組織中細(xì)胞蛋白質(zhì)谷胱甘肽化/去谷胱甘肽化循環(huán)的主要參與者，刺激了對(duì)其選擇性和功能性靶標(biāo)的“搜尋”。硫谷胱甘肽化發(fā)生在屬于不同功能類別的蛋白質(zhì)上，如鈣穩(wěn)態(tài)、糖酵解和能量代謝、細(xì)胞骨架組裝、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和凋亡、雌激素受體應(yīng)激、炎癥等。

近年來，關(guān)于GSTP1基因的研究多在人類疾病方面，在畜牧領(lǐng)域鮮有報(bào)道，本研究通過對(duì)延黃牛GSTP1基因SΝPs 進(jìn)行檢測及其與延黃牛生產(chǎn)性狀進(jìn)行相關(guān)分析，可以為畜產(chǎn)品品質(zhì)研究提供參考依據(jù)，提高畜牧養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)延黃牛GSTP1基因的7 個(gè)外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)第6 外顯子Chr29:45444249 bp 處存在G/A 同義突變，有2 種基因型：GG 和GA，該多態(tài)性位點(diǎn)在抽查群體中處于Hardy -Weinberg 平衡狀態(tài)，He相對(duì)較低，在延黃牛群體中變異較小，屬于低度多態(tài)（PΙC＜0.25）；第6 外顯子GA 型個(gè)體胸、腹圍、體重圍顯著高于GG 型個(gè)體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GA 型個(gè)體生產(chǎn)性狀優(yōu)于GG 型個(gè)體，GA 型基因是否為優(yōu)質(zhì)基因型還需在更大的樣本群體中進(jìn)行檢驗(yàn)。