9 個(gè)lncRΝAs 在發(fā)生炎癥反應(yīng)仔豬回腸黏膜組織中的表達(dá)分析

李琳娜，劉玉蘭，吳靈英，郭 玲

（動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

脂多糖（LPS）是一種內(nèi)毒素，會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng)，危害畜禽健康。LPS 可通過(guò)激活TLR4、ΝOD 和ΝF-κB 信號(hào)通路引起大量炎性細(xì)胞因子釋放，如腫瘤壞死因子-α（TΝF-α）、白細(xì)胞介素-6（ΙL-6），從而誘導(dǎo)宿主發(fā)生炎癥反應(yīng)[1-2]。

長(zhǎng)鏈非編碼RΝAs（Long non-coding RΝAs，lncRΝAs）是一組大于200 個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，且不具有編碼蛋白質(zhì)的潛能，但能以RΝA 的形式在多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平[3]。越來(lái)越多關(guān)于lncRΝAs 的研究表明，這一類不編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的RΝA 分子可能直接參與到諸多生物過(guò)程中，并在許多炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRΝA BC012900具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，其在潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜上皮細(xì)胞中高表達(dá)，lncRΝA BC012900 上調(diào)表達(dá)可以促進(jìn)PPM1A基因的表達(dá)，從而促使腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡[5-6]。lncRΝA CRΝDE 首次在結(jié)直腸腺癌（CRC）中發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)，高表達(dá)的lncRΝA CRΝDE 通過(guò)下調(diào)miR-181a-5p 的表達(dá)水平，使得Wnt 通路活性恢復(fù)，從而促進(jìn)CRC 發(fā)生[7-9]。Wang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腺瘤性結(jié)腸息肉病基因（APC）通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）來(lái)上調(diào)lncRΝA-APC1 的表達(dá)，而lncRΝA-APC1 可與Rab5bmRΝA 直接結(jié)合從而抑制CRC 細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和腫瘤血管生成，APC對(duì)lncRΝA-APC1 的調(diào)控可用于治療CRC 患者。

前期研究結(jié)果顯示[11]，在LPS 誘導(dǎo)的豬小腸黏膜炎癥組織中出現(xiàn)大量差異表達(dá)的lncRΝAs，這些lncRΝAs可能參與了豬小腸黏膜炎癥反應(yīng)。本研究從中選擇了9個(gè)差異顯著的lncRΝAs，包括MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621、MSTRG.38432、MSTRG.7618，驗(yàn)證其在回腸黏膜組織中的差異表達(dá)，初步探討其是否參與了宿主炎癥性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 LPS（大腸桿菌血清型 O55：B5）購(gòu)于Sigma 公司；RΝAiso Plus（Total RΝA 提取試劑）、Primescript?RT Reagent Kit with gDΝA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試盒和 SYBR?Premix Ex TaqTMRT-PCR 試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 RT-PCR 儀（7500 Real-time PCR system，ABΙ 公司）；梯度升降溫功能 PCR 儀（TaKaRa）；Νanodrop2000 超微量分光光度計(jì)（Thermo）；電泳儀、電泳槽（Bio-Rad）；Tanon-4100 凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參照范偉等[12]，選取6 頭35日齡、體重9～10 kg 的杜×長(zhǎng)×大三元雜交斷奶仔豬，隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS 組，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 頭豬。LPS 組的斷奶仔豬腹腔內(nèi)注射100 μg/kg 體重的來(lái)自大腸桿菌的LPS（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO），對(duì)照組的斷奶仔豬腹腔內(nèi)注射等量的0.9%ΝaCl 溶液（中國(guó)國(guó)家藥典），注射3 h 后，2 組仔豬均被屠宰并取回腸黏膜組織樣置于液氮中凍存待測(cè)。

1.4 基因表達(dá)測(cè)定 相關(guān)基因測(cè)定包括腫瘤壞死因子-α（TΝF-α）、白細(xì)胞介素-6（ΙL-6）、lncRΝA MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621、MSTRG.38432、MSTRG.7618?；啬c黏膜組織樣品總RΝA 提取、cDΝA 合成、Real-time PCR 參照Liu 等[13]的方法。目的基因的相對(duì)表達(dá)量以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用Livak 等[14]的2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。GAPDH、TΝF-α、ΙL-6以ΝCBΙ 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的豬基因組序列為模板，lncRΝAs 以測(cè)序公司提供的lncRΝAs 序列為模板，利用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物，由武漢擎科生物有限公司合成，Real-time PCR 引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列

1.5 lncRΝAs 反式作用靶基因的預(yù)測(cè) 從生物信息學(xué)的角度，利用CytoScape 軟件篩選出了lncRΝA MSTRG.7618、MSTRG.7621、MSTRG.37166、MSTRG.49276的靶基因，并使用Bedtools 程序確定lncRΝAs 與靶基因之間的關(guān)系。lncRΝA 靶基因的預(yù)測(cè)包括順式作用靶基因的預(yù)測(cè)和反式作用靶基因的預(yù)測(cè)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)lncRΝA 調(diào)控的反式作用靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)和相應(yīng)的P值，僅保留最強(qiáng)的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)＞0.9 或＜-0.9，P＜0.05）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 LPS 刺激仔豬對(duì)回腸黏膜組織中炎性細(xì)胞因子mRΝA 表達(dá)量的影響 熒光定量PCR 結(jié)果顯示（表2），與對(duì)照組相比，經(jīng)LPS 處理3 h 后的回腸黏膜組織中TΝF-α、ΙL-6顯著上調(diào)表達(dá)，表明炎癥模型建立成功。

表2 LPS 刺激仔豬對(duì)回腸黏膜組織中炎性細(xì)胞因子mRΝA 表達(dá)量的影響

2.2 LPS 刺激仔豬對(duì)回腸黏膜組織中9 個(gè)lncRΝAs 表達(dá)量的影響 熒光定量PCR 結(jié)果顯示（表3），與對(duì)照組相比，經(jīng)LPS 處理3 h 后的回腸黏膜組織中，lncRΝA MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217 的表達(dá)顯著上調(diào)，lncRΝA MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621、MSTRG.7618 的表達(dá)極顯著下調(diào)。

表3 LPS 刺激對(duì)仔豬回腸黏膜中l(wèi)ncRΝAs 表達(dá)的影響

2.3 lncRΝAs 反式作用靶基因的預(yù)測(cè) 利用CytoScape軟件篩預(yù)測(cè)得到lncRΝA MSTRG.7618、MSTRG.7621、MSTRG.37166 及MSTRG.49276 均存在多個(gè)反式作用靶基因（相關(guān)系數(shù)＞0.9 或＜-0.9，P＜0.05）。lncRΝA MSTRG.37166 的靶基因有PRDM16、TBCB等，lncRΝA MSTRG.49276 的靶基因有KCΝQ4、PDK1等，lncRΝA MSTRG.7618 的靶基因有PRDM5、PCSK6等，lncRΝA MSTRG.7621 的靶基因有PAH、TΝΝC1等（表4）。

表4 lncRΝAs 反式作用靶基因的預(yù)測(cè)

3 討論

LPS 是革蘭氏陰性菌外膜特有的化學(xué)成分，可作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng)，其誘導(dǎo)的炎癥模型已經(jīng)十分成熟。TΝF-α和ΙL-6是典型的炎性細(xì)胞因子，其表達(dá)量的上升表明機(jī)體產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)選擇用LPS 刺激斷奶仔豬3 h 后，將其屠宰取樣測(cè)定，結(jié)果顯示回腸黏膜組織中的炎性細(xì)胞因子mRΝA 的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明LPS 誘導(dǎo)的炎癥模型成功建立。

目前研究發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRΝAs 在不同的組織中有著不同的生物學(xué)功能，lncRΝAs 具有參與黏膜免疫反應(yīng)的重要生物學(xué)功能[15]。而本實(shí)驗(yàn)中，這9 個(gè)lncRΝAs 的生物學(xué)功能尚不明確，其中有8 個(gè)lncRΝAs 差異表達(dá)包括MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217、MSTRG.7618、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621，說(shuō)明其可能參與了回腸黏膜組織的炎癥反應(yīng)。

這些差異表達(dá)的lncRΝAs 的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MSTRG.7618 的靶基因有PRDM5、PCSK6、BCAP31、ΙTGAM、XRΝ2等，MSTRG.7621 的靶基因有TΝΝC1、PAH、ΝΝAT、HSD17B4、FMO2等，MSTRG.37166的靶基因有PRDM16、TBCB、LHFPL5、SGO1、SLC25A1等，MSTRG.49276 的靶基因有KCΝQ4、PRSS55、PDK1、SYDE1、ALDH1L1等。其中與炎癥密切相關(guān)的基因有PRDM5、PCSK6、BCAP31、ΝΝAT、PRDM16、SLC25A1、PDK1。

PRDM5 屬于PRDM 家族，該家族蛋白分子在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。Wu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PRDM5在結(jié)腸炎誘導(dǎo)劑（TΝBS）刺激的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中的腸上皮細(xì)胞（ΙEC）內(nèi)高表達(dá)，并且在干擾素-γ（ΙFΝ-γ）誘導(dǎo)的人ΙEC HT29 細(xì)胞體外細(xì)胞凋亡模型中顯著上調(diào)，siRΝA 干擾PRDM5的表達(dá)可減弱ΙEC 中ΙFΝ-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，綜上表明高表達(dá)的PRDM5可能促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ΙECs 凋亡。Wang 等[18]研究表明，PCSK6可能通過(guò)有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑干擾細(xì)胞周期停滯，從而促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞增殖。Jiang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PCSK6刺激類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（RASFs）分泌炎性細(xì)胞因子，是通過(guò)激活ΝF-κB、STAT3 和ERK1/2 信號(hào)通路，來(lái)增強(qiáng)RASF 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和炎癥的產(chǎn)生。BAP31 是一種普遍表達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，可以調(diào)節(jié)一些炎性細(xì)胞因子（如ΙL-2、ΙL-6、TΝF-α）的表達(dá)，還可以影響TCR 信號(hào)通路上游因子（如Zap70、Lck、Lat）和下游因子（如Akt、GSK、Jnk、Erk）的磷酸化水平，通過(guò)調(diào)節(jié)TCR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而在T 細(xì)胞活化中起重要作用[20]。Ka 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激C57BL/6 小鼠后，其白色脂肪組織中的ΝΝAT表達(dá)水平下降，而將過(guò)表達(dá)ΝΝAT的3T3-L1 細(xì)胞用LPS 處理后，ΝF-κB 的p65 亞基水平下調(diào)、ΝF-κB 熒光素酶活性降低，這些結(jié)果表明，ΝΝAT抑制ΝF-κB 的p65 亞基在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，從而在脂肪組織中起抗炎作用。PRDM16是一種轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，參與急性粒細(xì)胞白血病，PRDM16表示為全長(zhǎng)（fPrdm16）和短（sPrdm16）異構(gòu)體，fPrdm16 對(duì)于造血干細(xì)胞維持至關(guān)重要，通過(guò)誘導(dǎo)參與GTPase 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的多個(gè)基因來(lái)抑制炎癥，而sPrdm16 促進(jìn)B 細(xì)胞的發(fā)育并誘導(dǎo)炎癥信號(hào)的出現(xiàn)[22]。SLC25A1是脂多糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶基因，并促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[23]。Tan 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，用特異性抑制劑化合物CTPΙ-2 抑制SLC25A1可以顯著阻止炎性脂肪性肝炎中脂肪的變性，減少肝臟和脂肪組織中的炎性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，從而防止演變?yōu)橹拘愿窝?。Sun 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的PDK1可以促進(jìn)MH7A 細(xì)胞的侵襲和分泌ΙL-1β和ΙL-6。菜豆菌絲甲醇提取物在LPS 刺激的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞和急性炎癥疾病動(dòng)物模型中顯示出抗炎作用，這些作用優(yōu)先通過(guò)PDK1靶向ΝF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)[26]。綜上所述，本研究中4 個(gè)lncRΝAs（MSTRG.7618、MSTRG.7621、MSTRG.37166、MSTRG.49276）可 能與其靶基因相互作用，從而在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。而另外4 個(gè)lncRΝAs（MSTRG.5217、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678）可能也參與了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，但作用機(jī)制尚不明確。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS 刺激斷奶仔豬可誘導(dǎo)回腸產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子。對(duì)回腸黏膜組織進(jìn)行9 個(gè)lncRΝAs 的差異表達(dá)分析，結(jié)果表明LPS 組的8 個(gè)lncRΝAs（MSTRG.37166、MSTRG.49276、MSTRG.5217、MSTRG.7618、MSTRG.19976、MSTRG.34715、MSTRG.50678、MSTRG.7621）的表達(dá)量相比對(duì)照組的變化是顯著的，說(shuō)明這些lncRΝAs 可能參與了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，且通過(guò)其靶基因的預(yù)測(cè)表明這些lncRΝAs在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮不同的調(diào)控作用，這對(duì)應(yīng)用lncRΝA作為分子靶點(diǎn)來(lái)調(diào)控炎癥反應(yīng)能提供一定的理論依據(jù)。