溶菌酶的修飾及其在動物生產(chǎn)中的應用研究進展

張 琳，尚校蘭，李秋玲，齊 穎，劉延國

（1.廊坊師范學院，河北省動物多樣性重點實驗室，河北廊坊 065000；2.廊坊師范學院，廊坊市食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，河北廊坊 065000；3.北京安佰特科技發(fā)展有限公司，北京 102600）

近年來，抗生素濫用問題引起了全社會的關(guān)注，抗生素在畜牧業(yè)中的應用也受到了諸多限制。2016 年7 月26 日，我國農(nóng)業(yè)部（現(xiàn)為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，下同）發(fā)布2428號文件，要求2017 年5 月1 日停止使用硫酸粘桿菌素飼料添加劑預混劑。2018 年1 月11 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第2638 號公告，要求停止在食品動物中使用喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等3 種獸藥，以保障動物產(chǎn)品質(zhì)量安全，維護公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全。2019 年7 月9 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194 號公告，要求2020 年1 月1 日起將退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種。飼料端全面禁抗、養(yǎng)殖端減抗限抗已成大勢所趨。在此背景下，尋找替代抗生素的新型綠色添加劑成為動物營養(yǎng)領域的研究熱點。溶菌酶（Lysozyme，LZ）是一種有效的抗菌酶，于1921 年由蘇格蘭生物學家亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)[1]，此后便涌現(xiàn)出大量關(guān)于溶菌酶的基礎科學研究。溶菌酶是動物機體中的非特異性免疫因子，能夠直接作用于革蘭氏陽性菌（G+）細胞壁，在滲透壓作用下使微生物細胞脹裂死亡。革蘭氏陰性菌（G-）的細胞壁黏肽層外有一層脂多糖和脂蛋白，對天然溶菌酶具有抗性，故天然溶菌酶對G-幾乎無抑菌作用。近年來國內(nèi)外學者不斷嘗試通過化學、物理、生物改性等方法對溶菌酶進行修飾，拓寬其抑菌譜，提高殺菌能力。溶菌酶與抗生素殺菌機制不同，不易產(chǎn)生耐藥性，具有安全、無殘留、活性穩(wěn)定等優(yōu)良抗菌特性，已逐漸應用于畜禽飼料中。本文就溶菌酶的修飾技術(shù)以及在動物生產(chǎn)中的應用進行綜述，旨在為溶菌酶的開發(fā)和利用提供理論參考和依據(jù)。

1 溶菌酶的性質(zhì)和來源

溶菌酶是一種糖苷水解酶，純品為白色或白色晶體，熱穩(wěn)定性強，在干燥條件下可長期保存，其能夠特異性水解Ν-乙酰葡萄糖胺和Ν-乙酰胞壁酸間的β-1，4 糖苷鍵位點，進而使細胞破裂。近年來研究顯示，溶菌酶在無抗生素的畜禽飼糧中使用能夠達到與抗生素飼糧同樣的促生長效果[2-3]。Lee 等[4]研究表明，飼糧中添加外源溶菌酶能夠提高畜禽生長性能和免疫力，改善腸道形態(tài)及腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)。雖然溶菌酶抑菌效果明顯，但其抗菌譜窄，使用空間受限，為了使其能夠更廣泛地應用于動物生產(chǎn)中，國內(nèi)外學者對溶菌酶修飾做了大量研究。

2 溶菌酶的修飾方法

2.1 化學修飾 目前，溶菌酶化學修飾方法主要是利用脂肪酸、酚酸（醛）等小分子或者多糖及其他分子化合物對溶菌酶分子表面進行修飾，使疏水性有機小分子與溶菌酶的賴氨酸殘基（氨基）共價結(jié)合后起到疏水性載體的功能，將溶菌酶送至質(zhì)膜層。Liu 等[5]研究表明，中短鏈飽和脂肪酸C6:0 己酸、C10:0 葵酸、C14:0 肉豆蔻酸與溶菌酶結(jié)合能顯著提高溶菌酶對大腸桿菌（E.coli）K-12 的抗菌活性，并且酶活力損失不大。自身具有抑菌活性的酚酸（醛）類有機小分子也常被用作溶菌酶的共價修飾。Valenta 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，以E.coli和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus,S.aureus）為受試菌株，將肉桂醛與溶菌酶以1:3 的比例進行偶聯(lián)，偶聯(lián)物抑菌活性明顯提高。多糖分子還原末端的醛基可與蛋白質(zhì)分子中氨基酸側(cè)鏈的自由氨基發(fā)生美拉德反應，生成蛋白質(zhì)-多糖共價化合物，蛋白質(zhì)的凝膠性、起泡性、溶解性、乳化性等功能特性得以增強，溶菌酶的賴氨酸末端氨基是其與多糖交聯(lián)的結(jié)合位點[7]。Hashemi 等[8]研究表明，黃原膠（Xanthan Gum，XG）與溶菌酶通過美拉德反應得到的交聯(lián)物Lyz-XG 能夠顯著抑制S.aureus與E.coli生長。乙二胺四乙酸（EDTA）、乳鐵蛋白、乳酸等可作為細胞膜干擾劑，與細胞表面的脂多糖之間鹽橋二價陽離子螯合，使細菌的細胞膜失去穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)部分細菌對溶菌酶的耐受性[9]。李小曼等[10]研究發(fā)現(xiàn)，乙二胺四乙酸二鈉可協(xié)同溶菌酶作用于牙髓卟啉單胞菌，可使其抑菌作用提高約1.3～3.5 倍。

2.2 物理改性 相對于化學修飾，物理改性是利用機械能以熱、壓力等方法，通過蛋白質(zhì)變性改變分子結(jié)構(gòu)，從而提高溶菌酶的抑菌活性。研究發(fā)現(xiàn)，對溶菌酶加熱有利于氨基酸的疏水性位點暴露，從而增加熱處理衍生物（Heat-Denatured Lysozyme Derivative，HDLZ）低聚體的表面疏水性，提高溶菌酶與G-細胞膜的結(jié)合能力。Ιbrahim 等[11]研究顯示，溶菌酶的殺菌機制與抗菌肽類似，均是通過破壞細胞膜的方式殺死微生物細胞。武瑤等[12]研究表明，對海參溶菌酶的C-端多肽（SjLys-C）進行熱處理（100℃、40 min），其酶活及抑菌能力有所提高，分子動力學（MD）模擬表明，在熱處理的過程中，SjLys-C 多肽的氨基酸殘基隨溫度的變化發(fā)生內(nèi)部結(jié)構(gòu)重排，導致活性位點暴露，蛋白的抑菌活性改變，提示這可能是引起酶活增強的重要原因之一。高壓技術(shù)是一種非熱食品加工技術(shù)，高壓處理不僅可以改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，還可以改變其功能特性。Lucci 等[13]研究超高壓協(xié)同溶菌酶對單增李斯特菌存活率的影響，結(jié)果表明，100 MPa 協(xié)同224 U/mL 溶菌酶較單獨使用超高壓處理脫脂牛奶，使單增李斯特菌的數(shù)目顯著下降。高壓處理對溶菌酶的抑菌活性的調(diào)節(jié)機制可能是：高壓與溶菌酶之間的相互作用關(guān)聯(lián)蛋白的構(gòu)象改變。溶菌酶經(jīng)高壓處理后對植物乳桿菌具有抑制作用，但溶菌酶本身無此效果，這進一步證明了高壓使溶菌酶活性中心結(jié)構(gòu)改變[14]。高壓處理對溶菌酶的抑菌活性調(diào)節(jié)機制可能是對細胞壁或外膜的直接破壞作用或高壓技術(shù)使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，疏水區(qū)暴露，使蛋白不易發(fā)生凝聚，與細胞膜結(jié)合作用增強[15]。

2.3 生物改性 生物改性也是一種提升溶菌酶抑菌活性的方法，通過生物技術(shù)手段改變?nèi)芫傅慕Y(jié)構(gòu)，進而影響其功能及理化性質(zhì)。比如可將抗菌肽或疏水基團引入溶菌酶分子結(jié)構(gòu)中，增強自身疏水性，得以穿過脂多糖層進入G-的肽聚糖層，提高對G-的抑菌性能。Zhu 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，將氨基酸序列為（A-W-V-A-W-K）的抗菌肽（SP）與豬溶菌酶（Sus scrofa lysozyme，SSL）的編碼序列Ν端或C 端進行融合（圖1），結(jié)果顯示，構(gòu)建表達載體后發(fā)酵產(chǎn)物SP-SSL 既能保留豬溶菌酶殺滅G+的能力，又具備抗菌肽的抗G-活性。通過Qrt-PCR、FC 等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)SP-SSL 可以使靶細胞E.coliATCC10798 的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，靶細胞透性增強，從而使細胞內(nèi)容物流出，導致細胞死亡。

在溶菌酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中加入1 個外露的疏水性結(jié)構(gòu)域[16]，如圖2 所示，該結(jié)構(gòu)可以與外膜發(fā)生融合，溶菌酶可插入質(zhì)膜中進行殺菌[17]。有研究顯示，在溶菌酶羧基端可插入疏水性肽，改性后溶菌酶酶活性變化不大，但對E.coli的殺菌能力顯著增強，可能是由于溶菌酶對E.coli外膜和肽聚糖作用的結(jié)果[18-19]。

圖2 提高溶菌酶殺滅革蘭氏陰性菌能力的改造策略[16]

溶菌酶具有獨特的生物學功能及藥理作用，殺菌能力強，且不易產(chǎn)生耐藥菌株，雖然其抗菌譜窄，但通過化學、物理及生物改性等方法均可以提高溶菌酶對G-的殺菌能力，拓寬抑菌譜，可為畜牧業(yè)提供更多有價值的新產(chǎn)品，有著重要的現(xiàn)實意義。

3 溶菌酶在動物生產(chǎn)中應用

溶菌酶具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗病毒及提高機體免疫力等作用，其可作為飼料添加劑應用于動物生產(chǎn)中，可改善動物腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高生產(chǎn)性能。

3.1 在反芻動物生產(chǎn)中的應用 章偉建[20]從患有子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮粘液中篩選鏈球菌30 株、金黃色葡萄球菌37 株，體外用溶菌酶與氨芐西林進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，溶菌酶對金黃色葡萄球菌與鏈球菌具有較好的抗菌活性，效果與氨芐西林殺菌效果相當，但氨芐西林會產(chǎn)生大量的耐藥菌株。金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，Maga 等[21]將人胎盤組織中克隆獲得的人溶菌酶基因和人工合成的抗菌肽tachyplesins 鏈接，形成融合基因，在畢赤酵母中誘導表達，其產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、白色念珠菌等有一定的抑菌作用。歐陽萍[22]選用臨床型奶牛乳房炎典型致病菌金黃色葡萄球菌建立小鼠實驗性乳房炎感染模型并對其進行治療，結(jié)果表明，融合蛋白顯著抑制小鼠乳腺內(nèi)金黃色葡萄球菌的增殖，對小鼠乳腺炎有一定的治療作用，使抗腫瘤因子TΝF-α水平顯著下調(diào)，減輕乳腺炎癥。

3.2 在豬生產(chǎn)中的應用 腸道環(huán)境與動物健康息息相關(guān)，腸道微生物菌群是機體最復雜、最龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，在營養(yǎng)及能量代謝、免疫系統(tǒng)、屏障保護、應激調(diào)節(jié)等方面有重要影響。Maga 等[23]將溶菌酶添加于仔豬飼料中，可顯著增加仔豬糞便中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，有利于腸道健康。Oliver[24]等與Cooper[25]等也得出類似結(jié)論，證明溶菌酶可以提高斷奶仔豬腸道的絨毛高度，降低隱窩深度，提高腸道絨隱比，溶菌酶對腸道形態(tài)的改善作用可能是由于腸道微生物區(qū)系變化所致。Oliver 等[26]將一種純化的顆粒溶菌酶與抗生素對10 日齡仔豬的生長性能、小腸形態(tài)和彎曲桿菌的作用進行對比，結(jié)果顯示，與空白組相比，飼糧中添加溶菌酶或抗生素均可提高小腸絨毛高度，處理組間小腸總黏膜和黏膜的蛋白濃度以及多糖酶活性沒有顯著差異，提示溶菌酶與抗生素的使用效果相當。

3.3 在家禽生產(chǎn)中的應用 張世卿等[27]研究添加溶菌酶可降低肉仔雞的采食量、耗料增重比，提高日增重以及免疫相關(guān)指標，提示飼料中添加適量溶菌酶后，肉仔雞能量、養(yǎng)分表觀代謝率和免疫指標均有提高的趨勢。孫小青[28]在肉鴨日糧中分別添加溶菌酶與3 種抗生素（那西肽、吉他霉素、金霉素），結(jié)果顯示，對于提高肉鴨的日增重、免疫器官指數(shù)和降低日耗料量，溶菌酶的作用效果優(yōu)于那西肽、吉他霉素、金霉素；溶菌酶對肉鴨盲腸中E.coli的抑制作用也優(yōu)于3 種抗生素。王軍等[29]研究一種家禽專用溶菌酶對AA 肉仔雞生長性能和免疫器官發(fā)育情況的影響時也發(fā)現(xiàn)，溶菌酶可降低肉雞的全期耗料增重比，提高法氏囊指數(shù)。汪海[30]通過重組人溶菌酶轉(zhuǎn)基因模型研究發(fā)現(xiàn)，重組人溶菌酶對雞腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用，可以促進腸道雙歧桿菌的增長及出生后增重。另外重組人溶菌酶可通過改善雞腸道炎性損傷并提前誘發(fā)體液免疫，增強雞自身對沙門氏菌病的抑制作用。綜上所述，溶菌酶可以提高動物機體免疫力，提高機體抵抗內(nèi)外源有害微生物的能力，有效降低致病率和死亡率給養(yǎng)殖業(yè)帶來的損失。

4 結(jié)語

溶菌酶在生物體內(nèi)廣泛存在，其可作為動物保健品及飼料添加劑應用于動物生產(chǎn)中，表現(xiàn)出較好的飼料報酬與生產(chǎn)性能。由于溶菌酶與抗生素抗菌機制不同，在抑殺病原體的同時不易產(chǎn)生抗藥性，因此是替代抗生素的重要產(chǎn)品。同時，隨著基礎研究的不斷充實，未來可以使用基因工程技術(shù)手段，構(gòu)建動物源溶菌酶的表達系統(tǒng)，繼續(xù)提高重組動物源溶菌酶的活性及表達量，促進溶菌酶產(chǎn)品廣泛應用于醫(yī)藥業(yè)、食品加工業(yè)及畜牧業(yè)。