二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

俞佳妮,賈巧君,葉子弘,楊東風(fēng),侯卓妮,肖 藝,張曉丹

(1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院 浙江省植物次生代謝調(diào)控重點實驗室,浙江 杭州 310018;2.中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018;3.寧波易中禾藥用植物研究院有限公司,浙江 寧波 315122)

二氫丹參酮Ⅰ,作為丹參有效物質(zhì)丹參酮類物質(zhì)的重要組分,在抗炎、抗癌[1-4]、抗腫瘤、心血管防治等方面均具有顯著療效[5-6],是檢驗丹參藥效的重要指標(biāo)成分之一。近年來對于中藥指紋圖譜的研究逐漸受到矚目,作為丹參有效成分之一的二氫丹參酮Ⅰ是作為丹參質(zhì)量評價的重要指標(biāo),在研究中常需要測定其含量[7-9]。然而目前國內(nèi)外對二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品研制方法的報道較少,且市面上無可購買的二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品,由于其標(biāo)準(zhǔn)樣品的缺乏,不僅制約了二氫丹參酮Ⅰ的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,也限制了國內(nèi)外研究者對二氫丹參酮Ⅰ藥理藥效的進(jìn)一步研究與二氫丹參酮Ⅰ產(chǎn)品的開發(fā)。因此全國標(biāo)準(zhǔn)樣品技術(shù)委員會批準(zhǔn)了二氫丹參酮Ⅰ國家標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制。本文以ISO Guide 35:2017作為參照,依據(jù)GB/T 15000.3—2008標(biāo)準(zhǔn)樣品系列工作導(dǎo)則[8],研制了二氫丹參酮Ⅰ的國家標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi Rotavapor R-3)、冷凍干燥儀(Scientz-12N)、液相色譜儀(Waters e2695)、中壓制備液相色譜儀(Buchi Pure C-815)、Waters快速純化制備色譜(Waters Prep 150 LC System)、傅里葉紅外光譜分析儀FT-IR(Necolit iS5)、紫外吸收圖譜分析儀(UV-2500PC series)、HYG-B恒溫?fù)u床(太倉市實驗儀器廠)、AB204-N電子天平(瑞士梅特勒公司)、乙酸乙酯和石油醚等分析純試劑(杭州常青化工有限公司),以及乙腈、甲醇、乙醇(色譜純,Merck公司),200～300目硅膠(青島海洋化工廠)和GF254硅膠板(山東煙臺匯友硅膠有限公司)。

1.2 二氫丹參酮Ⅰ樣品的制備

原料為采集于丹參道地產(chǎn)區(qū)陜西商洛丹參(SalviaMiltiorrhiza)的根(根為紅色),將其粉碎后經(jīng)乙醇溶劑回流提取3次,2～5 ℃靜置析晶后抽濾得總丹參酮粗品。采用正相硅膠柱層析進(jìn)一步純化樣品,以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫,合并收集二氫丹參酮Ⅰ斑點段。濃縮干燥后利用中壓液相色譜進(jìn)行第二次純化,以乙腈-去離子水梯度洗脫,最后用甲醇洗脫,經(jīng)薄層層析檢測后根據(jù)Rf值合并相同組分進(jìn)行真空濃縮,得到純度為90%的二氫丹參酮Ⅰ粗品。將上述粗品繼續(xù)采用Waters快速純化制備色譜,以乙腈-去離子水梯度洗脫,經(jīng)薄層層析檢測后根據(jù)Rf值合并相同組分進(jìn)行真空濃縮,經(jīng)過2次重結(jié)晶(結(jié)晶溶劑為二氯甲烷-甲醚),過濾結(jié)晶,冷凍干燥后得到純度高于99%的二氫丹參酮Ⅰ樣品。制備過程中二氫丹參酮Ⅰ純品純度確認(rèn)采用TLC分析與HPLC檢測。

1.3 分裝與儲存

在相對清潔且獨立的環(huán)境中,用電子天平精確稱量,分別將100份10 mg二氫丹參酮Ⅰ樣品裝入100個4 mL的棕色小瓶中,并且以1到100進(jìn)行編號,密封后于4 ℃保存。

1.4 雜質(zhì)分析

采用庫倫電位滴定法:瑞士萬通KF915水分測定儀,卡爾費休試劑滴定,以純水標(biāo)定所制備的二氫丹參酮Ⅰ樣品水分。采用EXPEC 7000型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定二氫丹參酮Ⅰ樣品無機雜質(zhì)。為測定無機雜質(zhì),準(zhǔn)確稱取5.32 mg樣品,溶于20 mL甲醇,完全溶解后,定容至50 mL容量瓶,搖勻待測。用校準(zhǔn)液進(jìn)行半定量曲線校準(zhǔn),建立半定量工作曲線,以質(zhì)量數(shù)為橫坐標(biāo),半定量因子為縱坐標(biāo),建立校準(zhǔn)曲線,分析樣品。

1.5 定性分析

采用熔點與元素分析樣品水分與灰分。紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)、核磁共振(NMR)進(jìn)行定性分析,對制備的樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn),分析條件如下。

紫外光譜(UV):溶劑為乙醇,紫外可見光區(qū)(200～600 nm)全波長掃描。

紅外光譜(IR):溴化鉀壓片后對吸收峰進(jìn)行分析。

液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS):儀器為布魯克microTOF-Q,質(zhì)譜條件為電離方式ESI+,毛細(xì)管電壓4.5 kV,載氣用普氮,載氣流速為4.0 L/min,載氣溫度180 ℃,掃描范圍為m/z=50～800。

核磁共振(NMR):以氘代丙酮為溶劑,四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測定。

1.6 均勻性檢驗

均勻性是用于衡量標(biāo)準(zhǔn)樣品空間分布特征的基本屬性。對于二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品來說,具有一定規(guī)格的標(biāo)準(zhǔn)樣品,在同一批次或同一瓶內(nèi)的樣品的二氫丹參酮Ⅰ的純度都應(yīng)是均勻的,在檢測時其定值應(yīng)在規(guī)定的不確定范圍內(nèi),該標(biāo)準(zhǔn)樣品才能被定義為均勻的。

為了對所制備的二氫丹參酮Ⅰ樣品進(jìn)行均勻性檢驗,首先需要對所制備的同一批樣品進(jìn)行分裝,抽樣標(biāo)準(zhǔn)按標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則[10]中對均勻性研究的要求進(jìn)行。抽樣數(shù)目確定為10個,取10瓶樣品并以1～10進(jìn)行編號,從10瓶樣品中以3種不同程序從上述編號的樣品分別各稱取0.25 mg樣品3份,并以1.0 ml色譜乙醇作為溶劑溶解后進(jìn)行HPLC分析,樣品純度值以HPLC面積歸一法進(jìn)行測定。HPLC條件為:儀器用Waters e2695型高效液相色譜儀。色譜柱為Sunfire-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動相是乙腈/(0.2%乙酸)水=50/50。流速1.0 mL/min。柱溫30 ℃。檢測波長254 nm。進(jìn)樣量10 μL。

3次的抽樣樣品編號順序為1,3,5,7,9,2,4,6,8,10號瓶;10,9,8,7,6,5,4,3,2,1號瓶;2,4,6,8,10,1,3,5,7,9號瓶。對每個樣品重復(fù)測定3次。標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性情況通過對測得數(shù)據(jù)使用方差分析法來判斷。

1.7 穩(wěn)定性檢驗

標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性是用來描述標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值隨時間的變化。本文設(shè)置了實驗將所制備樣品在0～4 ℃條件下放置24個月來檢驗其穩(wěn)定性,分別于0,1,2,3,6,9,12,18,24個月時取3個樣品,按照1.6項下色譜條件,每份試樣以測定3次的平均值為其定值結(jié)果,用峰面積歸一化法計算純度。

1.8 定值分析

1.8.1 定值分析方法

根據(jù)GB/T 15000—2008規(guī)定,對所制備樣品的定值需由多個權(quán)威實驗室進(jìn)行聯(lián)合定制分析,所選實驗室需要獲得國家或部門認(rèn)可的具備資質(zhì)。本實驗選取共8個具備資質(zhì)的權(quán)威實驗室,從所制備樣品中隨機抽取24瓶,隨機送3瓶去往各實驗室,每瓶樣品進(jìn)行平行實驗測定2次。送去的樣品在各定值實驗室使用高效液相色譜儀測定其純度,并采用HPLC面積歸一化法對純度進(jìn)行定值,色譜條件與1.6項下一致,并將檢測報告從各實驗室收集起來進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.8.2 樣品溶液制備

本實驗室以色譜乙醇溶解樣品,過0.22 μm微孔濾膜,獲得質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 二氫丹參酮Ⅰ的雜質(zhì)分析

2.2 二氫丹參酮Ⅰ的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 熔點和元素分析

使用儀器為梅特勒熔點儀MP50,其測得所制備樣品的熔點為216～217 ℃。根據(jù)JY/T 017—1996元素分析儀方法通則進(jìn)行測試,平行測試三次。根據(jù)元素分析結(jié)果可得所制備樣品的分子式為C18H14O3,計算值:C 77.69%,H 5.036%。實際測定值:C(77.68±0.007)%,H(5.062±0.005)%。

2.2.2 紫外(UV)光譜分析

掃描結(jié)果為在410.40 nm,290.40 nm,240.80 nm,215.20 nm處有吸收。

2.2.3 紅外(IR)光譜分析

2.2.4 液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)分析

ESI-MS模式下測量值m/z=301.083 9[M+Na]+,理論計算值m/z=301.083 5[M+Na]+,測得二氫丹參酮Ⅰ分子量為278.30,分子式為C18H14O3。

2.2.5 核磁共振(NMR)分析

核磁數(shù)據(jù)歸屬見表1與表2。

表1 二氫丹參酮Ⅰ的氫譜核磁共振數(shù)據(jù)(600 MHz,氘代丙酮)

表2 二氫丹參酮Ⅰ的碳譜核磁共振數(shù)據(jù)(150 MHz,acetone-d6)

由上述液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果與核磁共振分析結(jié)果與已發(fā)表文獻(xiàn)對比可知,所制備樣品種化合物的HPLC-MS和NMR數(shù)據(jù)均與二氫丹參酮Ⅰ結(jié)構(gòu)相關(guān)的文獻(xiàn)報道一致[11-12],證明該化合物確為二氫丹參酮Ⅰ,結(jié)構(gòu)式見圖1。

治療前兩組患者NIHSS、3MS、BI評分比較無顯著性差異；治療后兩組患者NIHSS評分顯著降低，3MS、BI評分均顯著升高，同組治療前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后觀察組患者NIHSS、3MS、BI評分改善情況均顯著優(yōu)于對照組，兩組比較存在顯著性差異（P＜0.05），見表2。

圖1 二氫丹參酮Ⅰ結(jié)構(gòu)式Figure 1 Chemical structure of dihydrotanshinone Ⅰ

2.3 均勻性試驗

標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性性檢驗是標(biāo)準(zhǔn)樣品研制過程中不可缺少的程序。因此在對樣品進(jìn)行分裝后,對二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗,均勻性檢驗結(jié)果見表3與表4。

表3 二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品純度均勻性檢驗結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

從上表4可見,以υ1(即組間)=9及υ2(即組內(nèi))=20,F=MS間/MS內(nèi)=1.52

2.4 穩(wěn)定性試驗

0,1,2,3,6,9,12,18,24個月樣品純度統(tǒng)計結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性檢驗試驗結(jié)果

從表5可見,在24個月中,不同時間測得的樣品純度平均值并在沒有隨時間的變化而明顯的改變,同時根據(jù)GB/T 15000—2008中對標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性分析的要求,選取直線模型作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?采用F檢驗與t檢驗對不同時間測得的樣品純度平均值數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,分析過程如下。

t檢驗斜率計算:

|b1|

因此,斜率的變化是不顯著的。因而二氫丹參酮Ⅰ樣品在兩年內(nèi)未觀測到顯著的不穩(wěn)定性。有效期t=24個月的長期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻(xiàn)為u=sb·t=0.002 003×24=0.048 072。

因此可以確定在0～4 ℃的儲存條件下,所制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品在24個月內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.5 定值結(jié)果及其不確定度評定

2.5.1 定值結(jié)果

二氫丹參酮Ⅰ純度定值結(jié)果匯總表如表6。

表6 8家實驗室二氫丹參酮Ⅰ純度定值數(shù)據(jù)

表7 8家實驗室定值數(shù)據(jù)方差分析

2.5.2 定值分析的不確定度評定

根據(jù)GB/T 15000.3—2008標(biāo)準(zhǔn)可知,定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成。標(biāo)準(zhǔn)值定值實驗引入的不確定度uchar、均勻性檢驗引入的不確定度ubb和穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度ults組成了標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測量不確定度u。依據(jù)全部測定結(jié)果,計算二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度。

由上述分析結(jié)果可知,本文所制備二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度由uchar=0.062 5%,ubb=0.013 128%,ults=0.048 072%,此外還有雜質(zhì)檢驗中水分引入的不確定度u水分=0.230 77%,灰分引入的不確定度u灰分=0.029 557組成。

則其擴展不確定度為

因此二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為:二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度為99.835%。二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品擴展不確定度按只進(jìn)不舍原則處理并統(tǒng)一小數(shù)點位數(shù)后為0.50%。

3 結(jié) 語

本文以標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則作為參照,研制了二氫丹參酮Ⅰ的標(biāo)準(zhǔn)樣品。經(jīng)檢驗,所研制的二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性與穩(wěn)定性均符合國家對標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求,所制備的樣品的純度定值結(jié)果為(99.835±0.50)%,達(dá)到了天然產(chǎn)物國家標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。該標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于丹參等藥材中的二氫丹參酮Ⅰ含量的測定,有利于對丹參產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量控制,與進(jìn)一步的藥效研究。同時也可用于一些抗衰老護膚產(chǎn)品的開發(fā)研制。