我國牛羊主產(chǎn)區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的病原特征研究

鄭 宇，李焓笑，趙 強，王 菡，胡 盼，任洪林，李巖松，柳增善，盧士英

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種食源性腸道病原體，可引起耶爾森菌病——歐盟第三大常見的人獸共患病[1]。作為能夠在0 ℃～45 ℃生存的細菌[2]，它不僅存在于各類家養(yǎng)動物和野生牲畜中，還存在于各種冷藏食品中[3]。人食用了被小腸結(jié)腸炎耶爾森菌污染的生豬肉或新鮮牛奶等食物，會出現(xiàn)腹瀉、發(fā)燒等癥狀，并且引起局部炎癥和心血管疾病等[4]。耶爾森菌病在全球范圍內(nèi)流行，根據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心2016年的報道，美國每年有11.7萬人受到耶爾森菌病的影響，其中有640例需要住院治療，35人死亡[5]；在20世紀80年代，我國發(fā)生過2次耶爾森菌病的暴發(fā)流行[6]。由此可見，對各地區(qū)各物種的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌流行規(guī)律和病原特征的研究是非常有必要的。為此，本研究于2018-2020年從我國牛羊主產(chǎn)區(qū)的牛羊養(yǎng)殖屠宰加工場采集各類樣本(糞、乳、飼草以及環(huán)境樣本)，采用冷增菌法處理樣本后進行菌株分離培養(yǎng)鑒定、毒力基因鑒定、血清型鑒定以及耐藥性鑒定，對結(jié)果進行分析，總結(jié)了近兩年全國牛羊主產(chǎn)區(qū)該菌的流行規(guī)律和病原學(xué)特征，為預(yù)防和監(jiān)測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的傳播奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 參考菌株 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌參考菌株CMCC52225購買自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心；HZ菌株為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)贈予菌株。

1.2 樣本采集 采集2018-2020年黑龍江省、吉林省、遼寧省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、陜西省和新疆自治區(qū)牛羊養(yǎng)殖屠宰加工廠的各類樣本共2 291份，其中黑龍江省744份，吉林省937份，遼寧省426份，內(nèi)蒙古自治區(qū)100份，新疆自治區(qū)58份，陜西省26份。在各類樣本中，包含糞樣1 968份，乳樣152份，肉樣116份，環(huán)境樣本33份，飼草樣本22份。

1.3 儀器與試劑 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基CIN-1與增菌液改良磷酸鹽緩沖液，購買自青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR儀與凝膠成相分析系統(tǒng)，購買自新加坡應(yīng)用生物公司；2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix，購買自北京聚合美生物科技有限公司；立式雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱，購買自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；血清分型所用的血清試劑為實驗室保存試劑；耐藥性鑒定所用的抗菌藥物藥敏紙片，購買自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 樣本分離鑒定 取適量樣本置于10倍體積的改良磷酸鹽緩沖液中，4 ℃放置7～14 d以達到增菌效果，沾取增菌液于CIN-1培養(yǎng)基25 ℃劃線培養(yǎng)18～24 h后，挑取“公牛眼”狀紅色菌落于LB液體培養(yǎng)基中于25 ℃搖菌8 h，以foxA[7]為目的基因，直接取菌液作為模板進行PCR鑒定，將PCR結(jié)果為陽性的菌株進行生化反應(yīng)鑒定，將確定為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌株于-80 ℃保存，并利用統(tǒng)計學(xué)方法將分離結(jié)果進行統(tǒng)計與分析。

1.5 毒力基因檢測 對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的5個主要毒力基因(ail，ystB[8]，ystA，yadA，virF[9])分別進行PCR檢測，PCR反應(yīng)總體系為20 μL，其中包括2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，其余用ddH2O補足。PCR擴增程序包括94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸4 min，產(chǎn)物與DL2 000 marker用2%凝膠電泳分離(120 V，20 min)，引物序列見表1。

表1 基因檢測的PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for Yersinia enterocolitica genes detection

1.6 血清分型檢測 利用多重PCR方法[10]與玻片凝集方法進行血清型檢測。玻片凝集法是將分離的陽性菌株劃線培養(yǎng)，挑出菌落與已稀釋的血清試劑在載玻片上混勻后觀察是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，并設(shè)置生理鹽水作為空白對照。

1.7 耐藥性檢測 本實驗主要針對15種藥物進行耐藥性的檢測(氨芐西林、頭孢唑林、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、多粘菌素B、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、氯霉素、頭孢噻吩、呋喃唑酮、恩諾沙星、氟苯尼考)。具體操作如下：取適量菌液于LB平板涂勻后貼藥敏紙片，25 ℃培養(yǎng)18～24 h，通過測量抑菌圈直徑大小來判斷藥物對該菌的抑制效果。耐藥性結(jié)果判定標準見表2[11]。

表2 耐藥性結(jié)果的判定標準Tab.2 Judgment criteria for drug resistance results

2 結(jié) 果

2.1 不同地區(qū)樣本分離結(jié)果 對2 291份樣本進行PCR鑒定以及生化鑒定結(jié)果見表3，共分離到109株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，總檢出率為4.76%，其中遼寧檢出率為20.42%，新疆為15.51%，黑龍江為0.81%，吉林為0.75%，內(nèi)蒙古和陜西地區(qū)未分離出陽性菌株。利用卡方檢驗進行差異分析，結(jié)果顯示各地區(qū)檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=288.153，P<0.01)，遼寧和新疆檢出率遠高于其他地區(qū)。

表3 各地區(qū)樣本中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分離結(jié)果Tab.3 Results of Yersinia enterocolitica in samples from various regions

表4 各種類樣本中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分離結(jié)果Tab.4 Results of Yersinia enterocolitica in various samples

2.3 毒力基因檢測結(jié)果 對109株陽性菌株進行毒力基因檢測，結(jié)果顯示(見表5)有71株菌株毒力基因攜帶情況為ail-、ystA-、ystB+、yadA-、virF-，并將其定義為I型毒力基因型(65.14%)；其余的38株毒力基因攜帶情況為ail-、ystA-、ystB-、yadA-、virF-，并將其定義為II型毒力基因型(34.86%)，而上述I、II型菌株通常被認為是非致病性菌株[12]，因此，本次采樣地區(qū)中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病概率很小，并且根據(jù)毒力基因所占百分比分析，ystB是本次采樣地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的優(yōu)勢毒力基因。

2.4 血清分型檢測結(jié)果 對109株陽性分離菌株進行血清分型，結(jié)果見表5。共檢測出3種血清型，包含O∶5,27血清型51株(46.79%)，O∶6,30血清型3株(2.75%)，O∶5血清型3株(2.75%)，其余52株未分型(47.71%)。其中O∶6,30血清型只出現(xiàn)在遼寧地區(qū)(3.45%)；O∶5血清型雖然在遼寧(2.30%)和黑龍江地區(qū)(16.67%)均有檢出，但數(shù)量較少；O∶5,27血清型出現(xiàn)在黑龍江(66.67%)吉林(57.14%)和遼寧地區(qū)(49.43%)，不僅覆蓋范圍廣，而且所占比例高；新疆地區(qū)9株陽性菌株均未分型。綜上可知，O∶5,27血清型被認為是本次采樣地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的優(yōu)勢血清型。

表5 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離株的血清型與毒力基因檢測結(jié)果Tab.5 Results of serotype and virulence genetypes of Yersinia enterocolitica isolates

2.5 耐藥性檢測結(jié)果 對15種抗菌藥物的耐藥性檢測結(jié)果見表6，菌株對氨芐西林、紅霉素、磺胺異惡唑和頭孢噻吩100%耐藥，對多粘菌素B和氟苯尼考100%敏感。除此之外，菌株對呋喃唑酮和復(fù)方新諾明的耐藥率較高，均在75%以上，對氯霉素較敏感。

表6 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離株的耐藥性檢測結(jié)果Tab.6 Results of durg resistence of Yersinia enterocolitica isolates

3 討 論

對2018-2020年2 291份我國牛羊主產(chǎn)區(qū)牛羊源小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些地區(qū)的陽性樣本總檢出率為4.76%，與李旭等[13]在牛羊中的陽性總檢出率(分別為2.78%和0.89%)相符，但與2018年六安市豬糞檢出率(25%)[14]和江西省生豬源檢出率(20.86%)[15]相差較大，這可能是因為生豬是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要宿主。利用SPSS進一步分析得知各地區(qū)檢出率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中遼寧檢出率最高，其次是新疆、黑龍江和吉林。從樣本種類進行分析，環(huán)境樣本檢出率高達12.12%，其次是糞樣檢出率5.34%，而環(huán)境樣本中分離到的陽性菌株均來自于屠宰使用的案板，這提示各養(yǎng)殖屠宰加工廠要注意屠宰加工環(huán)境，以免將細菌等微生物帶入動物性食品中，影響人類健康。

毒力基因檢測結(jié)果表明，本次分離到71株毒力基因I型菌株(只含ystB毒力基因)和38株毒力基因II型菌株(不含毒力基因)。雖然I、II型被認為是非致病性菌株，但在食源性暴發(fā)疾病樣本中已經(jīng)檢測到含ystB基因的菌株[16]，這說明攜帶ystB基因的菌株或許存在一定致病力，應(yīng)該引起相應(yīng)的重視。李旭[13]等在牛源樣本分離菌株中的非致病性菌株檢出率達到94.44%，與本研究中非致病性菌株檢出率為100%的結(jié)果相符，也與本實驗室所建立的多重PCR方法[8]結(jié)果一致，這說明近年來存在于牛羊源樣本中非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌占絕大多數(shù)，而致病性菌株較少，但致病菌株的潛在影響力仍不可忽視。

目前，在世界上已知的60余個小腸結(jié)腸炎耶爾森菌血清型中，O∶3，O∶8，O∶9，O∶5,27，O∶13a等對人類具有致病力，而我國大多數(shù)致病菌株的血清型為O∶3和O∶9[17]。本次對109株陽性分離菌株進行常見的幾種血清型檢測，沒有發(fā)現(xiàn)血清型為O∶3和O∶9的菌株，有少數(shù)菌株血清型為O∶5和O∶6,30，46.79%的菌株血清型為O∶5,27，其余菌株血清型待定。該地區(qū)血清型為O∶5,27的所有菌株均未被檢測出致病基因，而Platt-Samoraj等[18]在5株分離的O∶5,27血清型菌株中檢測到3株含有ail致病基因，這說明O∶5,27血清型菌株對于國內(nèi)的養(yǎng)殖屠宰加工場所而言相對安全，但其對人類安全的威脅仍然不容小覷。

抗菌藥物的過度使用已然成為全球細菌疾病治療面臨的重要挑戰(zhàn)，為了減少小腸結(jié)腸炎耶爾森菌抗生素濫用的現(xiàn)象，本研究針對109株陽性分離株進行15種抗菌藥物的藥敏試驗，結(jié)果顯示所有分離菌株均具有耐藥現(xiàn)象，并且對氨芐西林、紅霉素、磺胺異惡唑和頭孢噻吩4種藥物耐藥率達到100%，對呋喃唑酮和復(fù)方新諾明也有較強耐藥性，對多粘菌素B、氟苯尼考和氯霉素敏感，這與Baumgartner等[19]的研究結(jié)果一致，說明多粘菌素B等3種藥物可以作為臨床治療的首選藥物。除此之外，本次分離菌株的多重耐藥率(對2種及以上抗菌藥物耐藥)達到100%，其中有74.39%的菌株對5種抗菌藥物耐藥，這可能與養(yǎng)殖場的環(huán)境消毒和喂養(yǎng)牲畜時過量添加抗生素有關(guān)。因此，我國應(yīng)對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的耐藥狀況進行監(jiān)測，避免日常動物飼養(yǎng)與臨床治療中抗生素的濫用，最終為動物和人類的健康提供保障。

利益沖突：無