circTCF25抑制mTOR信號通路對TNF-α誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響

馮智明 尤宜潔 郝軍艦

1青海紅十字醫(yī)院血管外科（西寧810000）；2青海省人民醫(yī)院產(chǎn)科（西寧810000）

經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)（percutaneous intracavitary coronary angioplasty，PCA）是冠心病介入性治療的重要手段，然而術(shù)后6 個月內(nèi)支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率高達(dá)30% ～35%，嚴(yán)重影響冠狀動脈介入治療的效率和患者的生存質(zhì)量［1］。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）是動脈壁的主要組成部分，研究顯示，在內(nèi)外環(huán)境刺激因子作用下VSMCs 發(fā)生表型轉(zhuǎn)換觸發(fā)內(nèi)膜遷移并促進(jìn)細(xì)胞增殖，是內(nèi)膜增生、動脈壁變性和血管成形術(shù)后再狹窄的中心環(huán)節(jié)［2］。因此，抑制VSMCs 的異常遷移和侵襲可能是PCA后再狹窄的重要治療策略。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類廣泛分布的、具有共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA，參與基因表達(dá)調(diào)控，在心血管疾病進(jìn)展中具有重要作用［3］。鄒天宇等［4-5］通過circRNA 芯片、熒光定量PCR 對冠心病患者外周血單個核細(xì)胞中circRNA 表達(dá)譜進(jìn)行分析和驗證發(fā)現(xiàn)，circTCF25 表達(dá)水平顯著降低，circTCF25表達(dá)增加與冠心病發(fā)病風(fēng)險降低相關(guān)。在膀胱癌、骨肉瘤中circTCF25 高表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲具有促進(jìn)作用［6-7］。然而，關(guān)于circTCF25 對VSMCs 增殖和遷移的影響尚屬空白。本研究以腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)大鼠VSMCs 建立體外增殖和遷移模型，重點(diǎn)探討circTCF25 對VSMCs 增殖和遷移的作用，以期為PCA 后再狹窄提供有效治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞A7r5、杜爾伯格伊戈爾培養(yǎng)基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購于武漢普諾賽生命科技有限公司；Lipofectamine 2000、TRIzol RNA 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒、SYBR Green I Master Kit 購于美國Invitrogen 公司；pcDNANC、pcDNA-circTCF25 購于上海生工生物公司；mTOR 激活劑MHY1485 購于湖北信康藥化有限公司化學(xué)研究所；Transwell 小室購于美國康寧公司；放射免疫沉淀試驗緩沖液、蛋白定量檢測試劑盒購于杭州主諾生物技術(shù)有限公司；Ki67 兔單克隆抗體（ab92742）、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（E-cadherin）兔單克隆抗體（ab40772）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）兔多克隆抗體（ab18203）、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔單克隆抗體（ab181602）、山羊抗兔IgG（ab205718）購于上海艾博抗公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建體外A7r5 細(xì)胞增殖和遷移模型A7r5采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基于含95%空氣、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞80%匯合時，加入胰酶消化按照1∶3比例傳代，每周換液2 ～3 次，收集對數(shù)期細(xì)胞用于實驗。參照牛珩等［8］實驗方法用含100 ng/mL TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h 構(gòu)建體外A7r5細(xì)胞增殖和遷移模型，記為模型組。同時設(shè)置對照組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實驗分組收集對數(shù)期A7r5 細(xì)胞，利用Lipofectamine 2000 將pcDNA-NC、pcDNAcircTCF25 分別轉(zhuǎn)染A7r5 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后用含100 ng/mL TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，依次記為NC 組、circTCF25 組。轉(zhuǎn)染pcDNA-circTCF25的A7r5細(xì)胞用100 ng/mL TNF-α 和10 μmoL 的MHY1485細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，記為circTCF25+MHY1485 組。

1.2.3 RT-qPCR 檢測circTCF25、mTOR mRNA、p70S6k mRNA 表達(dá)水平使用TRIzol RNA 提取試劑盒從各組A7r5 細(xì)胞中提取總RNA。檢測circTCF25 表達(dá)時將RNA 提取液與3 U/mg RNase R室溫孵育15 min 去除線性RNA。cDNA 合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA 為模板，利用SYBR Green I Master Kit、特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計算circTCF25、mTOR mRNA、p70S6k mRNA 的相對表達(dá)量。（circTCF25 上游5′-CACTGGCGTATTTCCTGCTG-3′，下游5′-ATCTGCTTGTA GAGGGCCAG-3′；GAPDH 上游5′-ATCCACGGGAGAGCGACAT-3′，下游5′-CAGCTGCTTGTAAAGTGGAC-3′；mTOR 上游5′-AGGAAGGACGTTTGCTCAGA-3′，下游5′-TCCCTCACTGAACACAGCAG-3′；p70S6k 上游5′-GGGAAGGCTTTGCACTTTAC-3′，下游5′-TCCAGTCCCTCACGAACAAA-3′）。

1.2.4 CCK-8 法和平板克隆實驗檢測細(xì)胞增殖CCK-8 法：收集各組A7r5 細(xì)胞，接種100 μL 細(xì)胞懸液至96 孔板，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，培養(yǎng)性箱內(nèi)孵育2.5 h，在450 nm 波長處測定光密度（OD）值表示細(xì)胞活力。

平板克隆實驗：每組取300 個A7r5 細(xì)胞接種6孔板，緩慢旋轉(zhuǎn)平板使細(xì)胞分均勻散。放入培養(yǎng)箱孵育2 周直到出現(xiàn)細(xì)胞集落，終止培養(yǎng)。磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗兩次，采用4%多聚甲醛固定集落，0.5%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下計數(shù)大于50 個細(xì)胞的集落數(shù)量表示集落形成數(shù)。

1.2.5 Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移收集各組A7r5 細(xì)胞，用無血清DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整為1 × 108個/L 的單細(xì)胞懸液。向Transwell 上腔室內(nèi)加入300 μL 細(xì)胞懸液，向24 孔板下腔室加入500 μL 含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（不含細(xì)胞）。培養(yǎng)箱孵育24 h，取出Transwell 小室，用無菌濕棉簽擦去上腔室未穿膜細(xì)胞，用1%多聚甲醛、0.5%結(jié)晶紫分別對Transwell 小室下表面進(jìn)行固定和染色。顯微鏡下觀察細(xì)胞穿膜情況，隨機(jī)選擇3 個視野計數(shù)，以其均值表示細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 Western blot 檢測Ki67、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá)使用預(yù)冷的放射免疫沉淀試驗緩沖液裂解各組A7r5 細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。用蛋白試劑盒測定蛋白含量。將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶的緩沖液室溫封閉膜2 h。然后將膜置于一抗溶液（Ki67 為1∶5 000，E-cadherin、N-cadherin 和GAPDH 為1∶10 000）中室溫孵育2 h。隨后用相應(yīng)的二抗（1∶2 000）室溫孵育膜1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色，曝光。Image J 軟件分析目的條帶灰度值，用目的蛋白與內(nèi)參GAPDH 灰度值比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗獨(dú)立重復(fù)3次，計量資料滿足正態(tài)性分布用（）表示。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circTCF25 在TNF-α誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞中的表達(dá)與對照組比較，模型組A7r5 細(xì)胞中circTCF25表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組、NC 組比較，circTCF25 組A7r5 細(xì)胞中circTCF25 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 circTCF25 的表達(dá)（n=3）Tab.1 Expression of circTCF25（n=3） ±s

表1 circTCF25 的表達(dá)（n=3）Tab.1 Expression of circTCF25（n=3） ±s

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與模型組相比，#P ＜0.05；與NC組相比，&P ＜0.05

分組對照組模型組NC 組circTCF25 F 值P 值circTCF25 0.96±0.10 0.19±0.03*0.20±0.02 0.84±0.05#&146.167＜0.001

2.2 circTCF25 對TNF-α誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞增殖和遷移的影響與對照組比較，模型組A7r5 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組、NC 組比較，circTCF25 組A7r5 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 遷移細(xì)胞數(shù)的檢測Fig.1 Detection of the number of migrating cells

表2 circTCF25 對TNF-α誘導(dǎo)A7r5 增殖和遷移的影響（n=3）Tab.2 Effect of circTCF25 on proliferation and migration of A7r5 induced by TNF-α（n=3） ±s

表2 circTCF25 對TNF-α誘導(dǎo)A7r5 增殖和遷移的影響（n=3）Tab.2 Effect of circTCF25 on proliferation and migration of A7r5 induced by TNF-α（n=3） ±s

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與模型組相比，#P ＜0.05；與NC組相比，&P ＜0.05

分組對照組模型組NC 組circTCF25 組F 值P 值OD 值0.52±0.04 1.16±0.06*1.16±0.06 0.71±0.04#&121.183＜0.001集落形成數(shù)（個）54.00±0.82 135.33±2.05*135.67±2.87 64.67±1.25#&1 596.830＜0.001遷移細(xì)胞數(shù)（個）69.33±4.19 156.00±5.10*155.33±5.91 85.00±4.55#&253.446＜0.001

2.3 circTCF25 對TNF-α誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞中mTOR信號通路的影響與對照組比較，模型組A7r5 細(xì)胞中mTOR mRNA 和p70S6k mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組、NC 組比較，circTCF25 組A7r5 細(xì)胞中mTOR mRNA 和p70S6k mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 circTCF25 對TNF-α誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞中mTOR 信號通路的影響（n=3）Tab.3 Effect of circTCF25 on TNF-α induced mTOR signaling pathway in A7r5 cells（n=3） ±s

表3 circTCF25 對TNF-α誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞中mTOR 信號通路的影響（n=3）Tab.3 Effect of circTCF25 on TNF-α induced mTOR signaling pathway in A7r5 cells（n=3） ±s

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與模型組相比，#P ＜0.05；與NC組相比，&P ＜0.05

分組對照組模型組NC 組circTCF25 組F 值P 值mTOR mRNA 1.01±0.04 3.66±0.08*3.68±0.09 1.47±0.07#&1144.933＜0.001 p70S6k mRNA 1.01±0.06 4.71±0.11*4.73±0.10 1.76±0.05#&1617.543＜0.001

2.4 MHY1485 對circTCF25 作用的TNF-α誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞增殖和遷移的影響與模型組比較，circTCF25 組A7r5 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與circTCF25 組比較，circTCF25+MHY1485 組A7r5 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）。見表4。

表4 MHY1485 對circTCF25 作用的TNF-α誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞增殖遷移的影響（n=3）Tab.4 Effect of mhy1485 on proliferation and migration of A7r5 cells induced by TNF-α in circTCF25（n=3） ±s

注：與模型組相比，#P ＜0.05；與circTCF25 組相比，＠P ＜0.05

分組模型組circTCF25 組circTCF25+MHY1485 組F 值P 值OD值1.16±0.08 0.72±0.04#1.02±0.06＠39.207＜0.001集落形成數(shù)（個）135.00±2.45 63.67±1.70#117.67±1.89＠999.346＜0.001遷移細(xì)胞數(shù)（個）155.67±6.85 85.33±3.86#138.00±3.74＠158.965＜0.001

2.5 MHY1485 對circTCF25 作用的TNF-α誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin 表達(dá)的影響與對照組比較，模型組A7r5 細(xì)胞中Ki67 和N-cadherin 蛋白表達(dá)顯著升高，E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組、NC 組比較，circTCF25 組A7r5 細(xì)胞中Ki67 和N-cadherin 蛋白表達(dá)顯著降低，E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與circTCF25 組比較，circTCF25+MHY1485組A7r5 細(xì)胞中Ki67 和N-cadherin 蛋白表達(dá)顯著升高，E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表5。

圖2 Ki67、E-cadherin、N-cadherin 蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of Ki67，E-cadherin and N-cadherin

表5 Ki67、E-cadherin、N-cadherin 蛋白的表達(dá)（n=3）Tab.5 Expression of Ki67，E-cadherin and N-cadherin（n=3） ±s

表5 Ki67、E-cadherin、N-cadherin 蛋白的表達(dá)（n=3）Tab.5 Expression of Ki67，E-cadherin and N-cadherin（n=3） ±s

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與模型組相比，#P ＜0.05；與NC 組相比，&P ＜0.05；與circTCF25 組相比，＠P ＜0.05

分組對照組模型組NC 組circTCF25 組circTCF25+MHY1485 組F 值P 值Ki67 0.25±0.02 0.76±0.04*0.74±0.04 0.35±0.02#&0.64±0.03＠167.051＜0.001 E-cadherin 0.71±0.05 0.20±0.02*0.19±0.02 0.58±0.03#&0.30±0.03＠163.618＜0.001 N-cadherin 0.24±0.02 0.82±0.05*0.84±0.05 0.34±0.03#&0.71±0.04＠149.430＜0.001

3 討論

circRNAs 是進(jìn)化上保守的非編碼RNA，其具有強(qiáng)大的基因調(diào)控功能，廣泛參與調(diào)節(jié)血管生成、平滑肌細(xì)胞功能和心臟損傷反應(yīng)等生物過程，與心血管疾病的發(fā)展密切相關(guān)［9-10］。研究顯示，CircFndc3b 通過血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor，VEGF-A）調(diào)控心肌梗死后的心臟修復(fù)［11］。circ_000203 通過抑制miR-26b-5p 和miR-140-3p 與轉(zhuǎn)錄因子GATA4 結(jié)合而加重心肌肥厚［12］。此外，circ_005717 調(diào)節(jié)大鼠VSMCs 增殖、遷移和分化，具有抑制內(nèi)膜增生、延緩血管再狹窄功能［13］。然而，circTCF25 在VSMCs 增殖、遷移中的作用尚未可知。VSMCs 具有顯著的表型可塑性，在血管損傷或炎癥細(xì)胞因子刺激下，VSMCs 將脫分化并重新獲得增殖、遷移能力，這是PCA 后再狹窄、動脈粥樣硬化性狹窄的病理基礎(chǔ)。本研究顯示，TNF-α誘導(dǎo)后A7r5 細(xì)胞增殖、遷移能力增加，circTCF25 表達(dá)降低，提示circTCF25 低表達(dá)可能與A7r5 細(xì)胞異常的增殖和遷移能力有關(guān)。進(jìn)一步功能驗證顯示，circTCF25 過表達(dá)后TNF-α誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低。Ki67 是一種與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活力呈正相關(guān)，是反映細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)［14］。E-cadherin 和N-cadherin 是細(xì)胞表面粘附分子超家族重要成員，對維持組織完整性和穩(wěn)態(tài)具有重要作用，上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)、下調(diào)N-cadherin 表達(dá)促進(jìn)VSMCs 粘附降低細(xì)胞遷移能力［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，circTCF25 過表達(dá)后，TNF-α誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞Ki67、N-cadherin 蛋白表達(dá)降低，E-cadherin 蛋白表達(dá)升高，與功能實驗吻合，說明過表達(dá)circTCF25 能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs 的增殖和遷移。

mTOR 是哺乳動物表達(dá)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞發(fā)育、血管生成、自噬以及先天適應(yīng)性免疫反應(yīng)等多種病理生理過程。大量研究證實，mTOR 信號的激活除參與動脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞活化、內(nèi)皮功能紊亂、泡沫細(xì)胞形成，還與VSMCs 的異常增殖、遷移和易損斑塊形成有關(guān)［17-18］。抑制mTOR 信號通路可降低VSMCs 的增殖、遷移和侵襲能力，是預(yù)防動脈粥樣硬化的潛在策略［19-20］。本研究顯示TNF-α誘導(dǎo)后A7r5 細(xì)胞中mTOR mRNA 和p70S6k mRNA表達(dá)顯著升高，而circTCF25過表達(dá)可降低TNF-α誘導(dǎo)對mTOR mRNA和p70S6k mRNA 表達(dá)的促進(jìn)作用，提示circTCF25對VSMCs 的抗增殖、遷移作用可能與抑制mTOR信號通路活化有關(guān)。激活mTOR 信號通路可逆轉(zhuǎn)circTCF25 對TNF-α誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞增殖、遷移及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，說明circTCF25 對TNF-α誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用與抑制mTOR 信號通路活化有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circTCF25 可降低TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs 的增殖和遷移能力，其機(jī)制與抑制mTOR 信號通路活化有關(guān)，提示circTCF25 可能是PCA 后再狹窄等血管增生性疾病的潛在靶點(diǎn)。