去泛素化酶組成型光形態(tài)發(fā)生因子9信號復(fù)合體5上調(diào)甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A表達促進肝癌細胞增殖

謝培一 陳磊峰 盧虹成 杜棟年 李家娟 邵江華

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，江西省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室（南昌330006）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，全球每年的新發(fā)病例中，有51%的病例發(fā)生在我國［1］。近年來，雖然肝切除技術(shù)及肝癌綜合治療水平明顯提高，但是HCC預(yù)后仍然不佳［2-3］。其中，肝癌細胞的快速增殖是影響HCC 患者預(yù)后的重要原因之一［4］。因此，探討肝癌細胞增殖相關(guān)機制已成為目前的熱點。

組成型光形態(tài)發(fā)生因子9 信號復(fù)合體5（constitutive photomorphogenic-9 signalosome subunit 5；CSN5）最初被鑒定為激活蛋白-1（activator protein 1；AP-1）復(fù)合體成員c-Jun 的協(xié)同激活因子［5］。研究［6-7］表明CSN5 屬于去泛素化酶，主要參與細胞DNA 修復(fù)、凋亡和增殖。研究［8-9］表明CSN5 表達上調(diào)可以抑制抑癌基因的活性，還可以上調(diào)多種促癌基因表達進而促進腫瘤細胞增殖。雖然有文獻報道CSN5 在肝癌表達增加并且與增殖有關(guān)，但是CSN5 促進HCC 增殖的分子機制仍不完全清楚，有待進一步研究［10］。

另外，研究［11-12］已經(jīng)證明甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）在肝癌組織中高表達并與肝癌的增殖有關(guān)。然而，CSN5 與MAT2A 的表達與肝癌增殖之間的關(guān)系仍未見報道。本研究探討CSN5是否可以調(diào)控MAT2A的表達并進而影響肝癌細胞的增殖能力，為臨床治療肝細胞癌提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑肝癌細胞和正常肝細胞從中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫購買。DMEM 培養(yǎng)液以及胎牛血清購自美國Gibco 公司；LipofectAMINE?3000 轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol-Reagent 購自美國Invitrogen 公司；兔抗人CSN5 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，兔抗人MAT2A 多克隆抗體和鼠抗人tubulin 多克隆抗體購自美國Proteintech公司，免疫組織化學(xué)檢測試劑盒和DAB 顯色液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；含有特異性針對CSN5 基因的shRNA-1、shRNA-2 的干擾質(zhì)粒（分別命名為shCSN5-1 和shCSN5-2）以及含有陰性shRNA 的對照質(zhì)粒（命名為shNC）均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2 肝癌標(biāo)本收集在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院獲得經(jīng)過肝癌患者切下的肝癌組織和癌旁組織，從2017年6月至2019年7月收治的肝癌患者手術(shù)切除標(biāo)本63 例，其中男46 例，女17 例，患者年齡范圍為31 ～75 歲，平均年齡（62±5.1）歲。及時將新鮮的組織妥善存放在保存液中，于-80℃的液氮中保存，部分可放于福爾馬林液體中保存，1 周之內(nèi)進行石蠟組織包埋，用于免疫組織化學(xué)等研究。所有患者樣本的獲取經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會授權(quán)。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人HCC 細胞HCCLM3，MHCC97H，Huh7，HepG2 以及人永生化肝細胞株（HL-7721 等）可用包含10%胎牛血清（FBS，Hy-Clone，USA）的DMEM（Gibco）在37℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并進行傳代或轉(zhuǎn)染處理。將CSN5 shRNA-1（靶點序列為5′-AGCGAGGTAAAGTTGCGTCT-3′）、shRNA-2（靶點序列為5′-AATGCAAAACAGGTTGGCCG-3′）的shCSN5-1/2 干擾質(zhì)粒和陰性對照shRNA 干擾片段轉(zhuǎn)染至肝癌HCCLM3 細胞。轉(zhuǎn)染實驗步驟參照LipofectAMINE?3000 轉(zhuǎn)染試劑說明進行。

1.4 免疫組織化學(xué)法HCC組織及癌旁組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，脫蠟。然后，用微波加熱抗原修復(fù)液（EDTA，pH8.0）25 min 使組織的抗原充分修復(fù)，并用山羊血清封閉40 min。進而用PBS 溶液稀釋抗CSN5 單克隆抗體（sc135954，1∶500，Santa Cruz）并在4℃下孵育過夜。其次，HRP 結(jié)合二級抗體（Boster）室溫下孵育2 h。采用DAB 檢測試劑盒（Maxim）進行免疫染色2 min，并用TBST 溶液洗滌組織切片3 次。最后，由3 名對病理學(xué)家對染色后陽性區(qū)域的比例進行半定量評分［13］。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法提取總蛋白后，蛋白質(zhì)濃度由BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）進行分析。細胞提取液在裂解緩沖液中煮沸20 min，離心后，用十二烷基磺酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。分離的蛋白條帶通過電印跡法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Millipore，Bedford，MA，USA）上，然后與一抗在4℃下孵育過夜。用TBST 洗滌3 次，室溫下與第二抗體孵育2 h。主要抗體包括抗CSN5 單克隆抗體（sc135954，1∶1 000，Santa Cruz）、抗MAT2A 多克隆抗體（55309-1-AP，1∶1 000，Proteintech）和Tubulin 單克隆抗體（11224-1-AP，1∶2 000，Proteintech）。用TBST 洗滌3 次，室溫下與第二抗體孵育2 h。使用Quantity One 軟件（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）測量每個蛋白條帶的強度［14］。

1.6 實時定量PCR（qRT-PCR）采用TRIzol 法抽提各組細胞的總RNA，用紫外分光光度計測定總RNA 純度并定量。采用實時定量PCR 技術(shù)檢測細胞中RNA 水平。cDNA 用PrimeScript RT 試劑盒（Invitrogen，USA）進行反向轉(zhuǎn)錄獲得，然后使用SYBR Premix Ex-Taq（TaKaRa Bio，Shiga，Japan）按照制造商的說明進行qPCR。本實驗所用到的主要引物序列如下CSN5，F(xiàn)orward：5′-AGAGTTTGTTCCCGTGGTGC-3′，Reverse：5′-CGAGGAAGCGGAGAAGTTGT-3′；MAT2A，F(xiàn)orward：5′-CATGAACGGACAGCTCAACG-3′，Reverse：5′-AGCATAAGCAGCTGAACGGT-3′。每個樣品均設(shè)3 個復(fù)孔，設(shè)定閾值，測定平均循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達水平［15］。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法三個獨立實驗的所有結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準差表示。兩組樣本均數(shù)的比較采用配對t檢驗或獨立樣本t檢驗；多組樣本間均數(shù)的比較采用方差分析，對有意義的因素再采用LSD-t檢驗進行組間多重比較。所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5 軟件分析，P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中CSN5 的表達水平明顯增高通過免疫組織化學(xué)法檢測63 例（含31 例新鮮標(biāo)本）人體肝癌標(biāo)本及癌旁組織中CSN5 的表達情況（圖1A）發(fā)現(xiàn)CAN5 在肝癌組織中表達明顯升高。通過實時熒光定量PCR 和蛋白質(zhì)印跡法（圖1B-D）檢測了31 例新鮮標(biāo)本，結(jié)果表明肝癌組織中CSN5的mRNA 和蛋白表達水平均明顯高于癌旁組織（P＜0.01）。

圖1 CSN5 在肝癌組織中表達明顯升高Fig.1 CSN5 is aberrantly upregulated in HCC tissues

2.2 肝癌細胞株中CSN5 的表達明顯高于正常肝細胞實時熒光定量PCR（圖2A）和蛋白質(zhì)印跡法（圖2B）檢測不同肝癌細胞及正常肝細胞中CSN5 的表達情況，結(jié)果表明：4 種肝癌細胞株中CSN5 mRNA 以及蛋白表達水平均明顯均高于正常肝細胞（P＜0.05）。

圖2 CSN5 在HCC 細胞中的表達明顯上調(diào)Fig.2 CSN5 expression in HCC cell lines is significantly increased

2.3 CSN5 表達與肝癌細胞的增殖密切相關(guān)實時熒光定量PCR 結(jié)果和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果（圖3A和3B）顯示，在HCCLM3 細胞中干擾CSN5 的表達，CSN5 表達明顯下調(diào)（P＜0.001）。EdU 細胞增殖實驗結(jié)果表明，在肝癌HCCLM3 細胞中，干擾CSN5后EdU 陽性細胞所占百分比較shNC 對照組明顯降低（P＜0.01，圖3C）。

圖3 干擾CSN5 的表達抑制HCC 細胞增殖Fig.3 CSN5 suppression inhibited HCC cell growth

2.4 CSN5 通過調(diào)節(jié)MAT2A 的表達進而影響肝癌細胞的增殖熒光定量PCR 結(jié)果（圖4A 和4B）表明，在肝癌HCCLM3 細胞中干擾CSN5 的表達，CSN5 mRNA 和蛋白水平下調(diào)，MAT2A 蛋白水平也明顯下降（P＜0.01）。回復(fù)實驗顯示在MAT2A過表達的HCCLM3 細胞中，MAT2A 蛋白的表達明顯升高，但是同時干擾CSN5 表達后，可逆轉(zhuǎn)MAT2A 表達升高（圖4C）。同時，EdU 細胞增殖試驗表明，干擾CSN5 導(dǎo)致的肝癌細胞增殖能力的降低可以被MAT2A 過表達所回復(fù)（圖4D）。

圖4 CSN5 通過MAT2A 調(diào)節(jié)肝癌細胞增殖Fig.4 CSN5 regulates HCC cells proliferation through MAT2A

3 討論

肝癌細胞增殖在原發(fā)性肝癌發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因此研究肝癌細胞增殖的分子生物學(xué)機制或許對肝癌的防治有重要意義。研究已表明CSN5 是一個癌基因并且在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展扮演重要角色［13，16-17］。本研究通過檢測HCC 病人的臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)CSN5 在肝癌中的mRNA和蛋白表達明顯高于癌旁組織。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CSN5 在多株肝癌細胞中表達明顯增加，下調(diào)肝癌細胞株CSN5 的表達可以明顯抑制肝癌細胞的增殖能力。以上研究提示CSN5 在肝癌的發(fā)展過程中扮演促癌作用，或許可以作為一個潛在的腫瘤治療靶點，但是其具體調(diào)控肝癌細胞增殖的機制尚未明確，有待進一步研究。

MAT2A 主要在肝臟疾病中廣泛研究，并且研究［18-20］表明MAT2A 可以作為快速生長和去分化的標(biāo)志。研究［21-22］表明特異性蛋白1（specificity protein 1；SP1）和p65 表達增高均可以促進MAT2A 過表達。然而，肝癌細胞中CSN5 與MAT2A 的表達關(guān)系仍未見報道。在本研究中，發(fā)現(xiàn)CSN5 可以調(diào)控MAT2A 的表達進而影響肝癌細胞的增殖。結(jié)果顯示，通過干擾CSN5 在肝癌細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)CSN5 下調(diào)可以抑制MAT2A 的表達進而抑制肝癌細胞的增殖能力。最后，通過回復(fù)實驗，證實MAT2A 是CSN5 促進肝癌細胞增殖的關(guān)鍵分子。

綜上所述，CSN5 可以通過調(diào)控MAT2A 表達促進肝癌細胞的增殖。本研究為進一步研究肝癌的增殖提供了新的理論基礎(chǔ)，并為臨床上肝癌的基因治療提供了新的思路。然而本實驗還具有一定的局限性，未探究CSN5 在肝癌細胞中調(diào)控MAT2A的具體機制，未進一步擴大對臨床肝癌標(biāo)本的檢測并對肝癌病人的臨床預(yù)后進行分析。針對本實驗的不足，我們將進一步探究CSN5 通過何種方式調(diào)控MAT2A 的表達，進一步增加肝癌標(biāo)本的檢測，并對相關(guān)病人的預(yù)后信息進行歸納分析。