青杄轉(zhuǎn)錄因子基因PwNF-YB8的克隆與功能分析*

苗雅慧 鞠 丹 梁珂豪 王愛斌 劉峻玲 張凌云

(北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 森林培育與保護(hù)教育部重點實驗室 北京 100083)

核因子Y(Nuclear Factor Y, NF-Y)也叫亞鐵血紅素激活蛋白(heme activator protein, HAP)或CCAAT盒結(jié)合因子(CCAAT box binding factor)，是真核生物中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，由NF-YA/B/C 3個亞基組成(Mantovani, 1999)。一般地，NF-YB在細(xì)胞質(zhì)中先與NF-YC組合成二聚體，再進(jìn)入細(xì)胞核中與NF-YA裝配成三聚體，進(jìn)而與順式作用元件CCAAT框結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)(Frontinietal., 2004)。NF-YB是具有組蛋白(H2B)折疊結(jié)構(gòu)域的一類NF-Y亞基，先后從大鼠(Rattusnorvegicus)(Maityetal., 1990)、小鼠(Musmusculus)(Hooftetal., 1990)、酵母(Saccharomycescerevisiae)(Olesenetal., 1991) 、擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Edwardsetal., 1998)等真核生物中被鑒定出來。在酵母和哺乳動物中NF-Y是單個基因編碼，而在植物中則由多個基因組成的基因家族編碼。目前為止，在水稻(Oryzasativa)中鑒定出了11個NF-YB基因(Thirumuruganetal., 2008)，在擬南芥和矮牽牛(Petunia×hybrida)均鑒定出13個NF-YB基因(Siefersetal., 2009; Weietal., 2020)，高粱(Sorghumbicolor)中則有19個NF-YB基因(Maheshwarietal., 2019)。

NF-YB廣泛參與了植物的生長發(fā)育過程，如種子發(fā)育、花期調(diào)控、光合作用等過程。比如，陸地棉(Gossypiumhirsutum)GhNF-YB22在胚中高表達(dá)； 玉米(Zeamays)ZmNF-YB2/6/7/10/14和蓖麻(Ricinuscommunis)RcNF-YB2/12在種子發(fā)育過程中高表達(dá)，參與了植物胚發(fā)生和種子發(fā)育過程(Chenetal., 2018; Wangetal., 2018b; Zhangetal., 2016)。水稻OsNF-YB3與葉綠素生物合成相關(guān)(Miyoshietal., 2003)； 小麥(Triticumaestivum)TaNF-YB3作為一個正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子參與光合作用過程 (Stephensonetal., 2011)； 玉米ZmNF-YB16能夠正向調(diào)節(jié)光合作用過程，過表達(dá)后改善營養(yǎng)和生殖階段玉米植株的抗旱脅迫能力，提高玉米籽粒產(chǎn)量(Wangetal., 2018a)。在長日照條件下，擬南芥atnfyb2突變體的花期延遲，而過表達(dá)AtNF-YB2的擬南芥植株花期提前(Caietal., 2007)； 在擬南芥和番茄(Solanumlycopersicum)中過表達(dá)毛果楊(Populustrichocarpa)PtNF-YB1，可以促進(jìn)早期開花(Wangetal., 2019b)。此外，在擬南芥中過表達(dá)AtNF-YB1，可以提高植物的光合速率、促進(jìn)植株水勢升高，同時延遲花期，而突變體植株與野生型的花期無顯著差別，表明NF-YB基因在生長和發(fā)育中的多重作用和可能存在的功能冗余(Nelsonetal., 2007; Wenkeletal., 2006)。除參與植物的生長發(fā)育外，NF-YB在植物逆境脅迫響應(yīng)方面也發(fā)揮了重要作用。在干旱和ABA脅迫下，美洲黑楊(Populusdeltoides)PdNF-YB7的表達(dá)量升高，在擬南芥中過表達(dá)PdNF-YB7后，其耐旱性和水分利用率顯著提高(Hanetal., 2013)； 在美洲黑楊中過表達(dá)PdNF-YB21，促進(jìn)了根的生長、木質(zhì)部導(dǎo)管高度木質(zhì)化和增大，植株耐旱性顯著增強(Zhouetal., 2020)； 大蒜(Alliumsativum)AsNF-YC8在ABA處理、NaCl和PEG脅迫誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)錄水平變化明顯； 過表達(dá)AsNF-YC8的煙草(Nicotianatabacum)植株，在鹽和干旱條件下，其顯示出更強的耐受性(Sunetal., 2017)。NF-YB不僅可以由單個亞基行使功能，也可以由多個亞基互作來共同發(fā)揮效應(yīng)。擬南芥AtNF-YB2/3和AtNF-YC3/4/9能夠在體內(nèi)發(fā)生互作, 在CONSTANS(CO)介導(dǎo)的開花過程中發(fā)揮作用(Kumimotoetal., 2010; Wenkeletal., 2006)； AtNF-YA4/YB3/YC2可以與bZIP28互作，參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)過程中(Liuetal., 2010)。在水稻中，NF-YB(HAP3)亞基OsHAP3A能夠與HAP5的特定成員相互作用(Thirumuruganetal., 2008)；OsNF-YB1/9、OsNF-YC8/9/10/11/12在水稻胚乳中高表達(dá)，且YB亞基與YC亞基之間存在相互作用(Eetal., 2018)； NF-Y異源三聚體復(fù)合物NF-YB1-YC12-bHLH144能夠調(diào)節(jié)稻米品質(zhì)(Belloetal., 2019)。雖然NF-YB基因的功能已經(jīng)在一些模式植物和作物中有較多研究，但在針葉樹種中的研究卻相對滯后。

青杄(Piceawilsonii)是我國重要的造林樹種，適應(yīng)性較強，在園林綠化及工業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位(許家春等， 2004)。然而其繁育周期長，相對于其較強的抗寒性，青杄喜濕、抗旱性差，利用分子手段揭示青杄自身發(fā)育特性及抗逆機(jī)理具有重要意義。本課題組前期研究了NF-Y家族中的NF-YC亞基PwHAP5在花粉管發(fā)育及逆境響應(yīng)中的作用，發(fā)現(xiàn)其參與了花粉管的導(dǎo)向調(diào)節(jié)，同時該基因受干旱、鹽脅迫誘導(dǎo)(Lietal., 2013; Yuetal., 2011)。本研究在課題組早期獲得的PwNF-YB8的cDNA序列基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對其進(jìn)行功能研究。利用qRT-PCR分析青杄PwNF-YB8在不同組織以及不同逆境脅迫下的相對表達(dá)情況，酵母雙雜交系統(tǒng)、雙分子熒光互補試驗分析青杄PwNF-YB8與PwHAP5的互作情況，探究其在花粉萌發(fā)中的作用。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將PwNF-YB8異源過表達(dá)至擬南芥中，對其進(jìn)行抗逆表型分析。本研究有利于揭示NF-Y類轉(zhuǎn)錄因子在青杄中發(fā)揮的功能及作用，為進(jìn)一步研究青杄的生長及抗逆機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

青杄花粉于中國科學(xué)院植物研究所(北京)采集，根、莖、針葉采集后先于液氮中速凍，后存于-80 ℃?zhèn)溆茫鄸e種子為本實驗室留存。逆境響應(yīng)試驗所用為萌發(fā)后于溫室培養(yǎng)正常生長8周的青杄幼苗。pEASY-T1、Taq PCR Mastermix(KT201) 、熒光定量PCR試劑盒(SYBR FAST qPCR Kit)、多糖多酚總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR106)購于天根生物有限公司； 大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)DH5α和無縫克隆(CV1901)試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司； 限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶等購自Fermentas公司； 鮭魚精購于北京華越洋公司； NaCl、醋酸鋰、DMSO和X-α-gal購于SIGMA公司； 其他試劑購于AMERSCO公司。PwHAP5T載體、pGBKT7、pGADKT7、pCAMBIA1205載體、35S∷SPYNE、35S∷SPYCE為實驗室留存。CRISPR/Cas 9載體pCBC-DT1DT2、PHEE401E為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳其軍教授惠贈，pSUPER1300載體為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)傅瓔教授惠贈。

1.2 青杄PwNF-YB8的cDNA全長獲得及編碼蛋白的序列分析

在實驗室前期研究工作中，曾利用構(gòu)建青杄均一化cDNA文庫及EST序列分析，得到大量有效EST序列(張盾等， 2012)，隨后根據(jù)青杄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Guoetal., 2020)，篩選獲得1個NF-Y轉(zhuǎn)錄因子基因，將其命名為PwNF-YB8。利用天根公司多糖多酚總RNA提取試劑盒(DP441)提取青杄總RNA，并利用其反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR106)合成cDNA第1鏈。根據(jù)此序列設(shè)計引物YB8(表1)以青杄cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后進(jìn)行測序驗證。

表1 試驗所用引物①Tab.1 Primers used in this experiment

利用DNAMAN6.0進(jìn)行PwNF-YB8核酸序列拼接和蛋白翻譯預(yù)覽。用NCBI的Blast(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和InterPro(http:∥www.ebi.ac.uk/interpro/)預(yù)測PwNF-Y8保守結(jié)構(gòu)域。ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸組成及理化性質(zhì)預(yù)測。Protscale(http:∥web.expasy.org/protscale/)預(yù)測蛋白疏水性并用FoldIndex(http:∥bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex)預(yù)測蛋白跨膜情況。在NCBI上查找PwNF-YB8的同源蛋白并用DNAMAN6.0進(jìn)行多序列比對，系統(tǒng)發(fā)育樹用MEGA10基于鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建。

1.3 PwNF-YB8基因表達(dá)特性分析

采用天根公司多糖多酚總RNA提取試劑盒(DP441)提取青杄根、莖、針葉及花粉總RNA，并使用其反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR106)合成cDNA第1條鏈。將各組織的cDNA模板濃度經(jīng)均一化后，利用天根公司的熒光定量PCR試劑盒(SYBR)在Step One PlusTMReal-Time熒光定量PCR儀上檢測PwNF-YB8在不同組織中的相對表達(dá)情況。利用SqRT-PCR和qRT-PCR對青杄不同組織(根、莖、針葉、花粉)中PwNF-YB8基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。青杄延伸因子蛋白基因EF1-α作為內(nèi)參基因(Yuetal., 2011)，內(nèi)參特異引物為EF1-α，qRT-PCR引物為YB8-RT(表1)。試驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

逆境脅迫響應(yīng)試驗參考張通等(2014)的方法，略有改動。大體步驟如下： 選取長勢相同的8周齡青杄幼苗，置于42 ℃高溫處理，處理時間分別為0、2、4、6、8、12 h； 用20%(質(zhì)量比)PEG溶液、200 mmol·L-1NaCl鹽溶液、100 mmol·L-1脫落酸分別處理青杄幼苗0、2、4、6、8、12 h，對照組采用清水處理。將幼苗置于21 ℃、光周期/暗周期16 h/8 h、空氣濕度60%條件中。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。處理后青杄幼苗于液氮速凍處理，存于-80 ℃?zhèn)溆?。提取青杄根、莖和針葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR試驗檢測PwNF-YB8的表達(dá)量，均利用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。

1.4 突變體載體和過表達(dá)載體構(gòu)建、擬南芥的轉(zhuǎn)化與篩選

突變體載體利用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建，參照Xing等(2014)方法，步驟如下： 1) 四引物PCR擴(kuò)增，體系為1 μL pCBC-DT1T2，DT1-BsF-4、DT1-F0-4、DT2-R0-8、DT2-BsR-8各0.5 μL，Taq Mix酶10 μL，ddH2O補齊至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃高溫變性5 min； 95 ℃高溫30 s, 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)； 72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物使用Omega膠回收試劑盒(D2500-01)進(jìn)行純化。2) PCR-酶切體系： PHEE401E 2 μL，PCR反應(yīng)后片段2 μL，10×BSA 1.5 μL，10×NEB T4 Buffer 1.5 μL，T4 Ligase (NEB) 1 μL，Bsa I (NEB) 1 μL，ddH2O補足至50 μL。反應(yīng)程序如下： 37 ℃ 5 h，50 ℃ 5 min，80 ℃ 10 min。隨后將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌送測，測序成功后轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。過表達(dá)載體： 構(gòu)建PwNF-YB8 CDS全長到pCAMBIA1205載體上，以EcoRⅠ和KpnⅠ為內(nèi)切酶，設(shè)計引物YB8-1205(表1)，將融合載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)。

通過花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥(Cloughetal., 1998)。擬南芥突變體篩選： 1)侵染、篩選獲得陽性植株。野生型植株侵染后收種，將種子播種在含抗生素(50 μg·mL-1羧芐青霉素+40 μg·mL-1潮霉素)的MS固體培養(yǎng)基中，能夠長出2片子葉和2片真葉的擬南芥即為T0代陽性苗。2)篩選無抗性背景突變體植株。將T0代陽性苗播種到MS培養(yǎng)基中，得到T1代陽性苗并進(jìn)行分株收種。隨后將T1代陽性苗的種子播種于篩選培養(yǎng)基中，若不能生長，則說明該突變體無抗性背景，可以擴(kuò)繁使用。并進(jìn)一步設(shè)計靶點前后的引物Crispr 8-F 和Crispr 8-R進(jìn)行測序鑒定。過表達(dá)篩選： 侵染后得到的T0代種子播種在篩選培養(yǎng)基中，當(dāng)陽性植株長出2片子葉和2片真葉后，將其移到土里繼續(xù)生長。3周后提取陽性植株的基因組DNA，以YB8-1205為引物(表1)進(jìn)行PCR鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果逐株收集T1代植株的種子作為不同的株系(Line)，篩選至T3代穩(wěn)定純合的陽性植株。以野生型(WT)和空載體(VC)株系作為對照，通過qRT-PCR檢測各過表達(dá)株系中PwNF-YB8的表達(dá)量，選取擬南芥Actin2/8基因作為內(nèi)參基因(Zhangetal., 2018)。每次試驗分別設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)、3次生物學(xué)重復(fù)。Actin2/8和YB8-RT引物序列見表1。

1.5 PwNF-YB8的亞細(xì)胞定位分析

以含有PwNF-YB8基因CDS序列的T載體為模板，用YB8-1205(表1)作引物進(jìn)行PCR、膠回、酶切、連接，隨后將目的片段構(gòu)建至pCAMBIA1205載體。將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并培養(yǎng)。質(zhì)粒提取使用北京艾德萊公司的大型/大量質(zhì)粒提取試劑盒(PL14)，使質(zhì)粒濃度達(dá)1 μg·μL-1，利用基因槍轟擊洋蔥(Alliumcepa)表皮細(xì)胞(Yuetal., 2011)。將轟擊后的洋蔥表皮置于MS培養(yǎng)基中暗處理1天，隨后使用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

為了排除GFP位置差異對目的片段定位產(chǎn)生影響，分別使用2種表達(dá)載體(pSUPER1300載體和pCAMBIA1205載體)瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片。在pSUPER1300載體中，GFP位于目的片段的C端，在pCAMBIA1205載體中，GFP位于目的片段的N端。將PwNF-YB8構(gòu)建到含有GFP標(biāo)簽的表達(dá)載體上，用基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞和瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片的方法，研究PwNF-YB8在細(xì)胞中的定位。以轉(zhuǎn)化空pCAMBIA1205載體和pSUPER1300載體的煙草葉片為陰性對照，以轉(zhuǎn)化RACK1A-RFP載體的煙草為陽性對照(RACK1A-RFP同時定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核)進(jìn)行共轉(zhuǎn)(Nakashimaetal., 2008)。

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)中，通過PCR鑒定出陽性菌落后留存。在相應(yīng)工作濃度抗生素的YEB培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)活化農(nóng)桿菌。培養(yǎng)約2天后，在超凈工作臺中用槍頭蘸取少量農(nóng)桿菌加到含有5 mL相應(yīng)抗性的YEB培養(yǎng)液的離心管中，在28 ℃、180 r·min-1的搖床里培養(yǎng)，至OD值處于1.0～1.2之間。將農(nóng)桿菌菌液在4 500 r·min-1下離心5 min后棄掉上清液，隨后加入1 mL煙草注射緩沖液振蕩混勻，再次離心，重復(fù)1次。隨后向離心管中加入200 μL煙草注射緩沖液并吹打振蕩混勻。另取一新2 mL離心管加入菌液，并分次適量加入煙草注射緩沖液，調(diào)OD為0.8左右。將混合菌液靜置于離心管中2.5 h后注射煙草葉片。注射后的煙草在16 h光照/8 h黑暗、25 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，在共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.6 PwNF-YB8轉(zhuǎn)錄激活活性及與PwHAP5的互作分析

PwNF-YB8引入SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點，PwHAP5引入NdeⅠ和BamHⅠ的酶切位點，以相應(yīng)T載體為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得加入上述酶切位點的PwNF-YB8、PwHAP5完整編碼序列，經(jīng)過雙酶切后用T4DNA連接酶分別與pGBKT7、pGADKT7載體連接，獲得酵母表達(dá)載體pGBKT7-YB8和pGADKT7-HAP5。按Clontech公司酵母雙雜交手冊，將pGBKT7-YB8和pGADKT7-HAP5分別轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)中。自激活活性試驗中，試驗組為pGBKT7-YB8+pGADT7，以pGBKT7+pGADT7為陰性對照，以pGBKT7-p53+pGADT7為陽性對照。均勻涂在SD/-Trp-Leu二缺板上，生長3～4天后，分別挑選單克隆菌落并用無菌水稀釋，分別吸取3 μL左右的菌液滴于SD/-Trp-His-Ade三缺板中。酵母雙雜交驗證互作試驗中，陽性對照采用pGBKT7-p53+pGADKT7-T，陰性對照采用pGBKT7-YB8+pGADKT7、pGBKT7+pGADKT7-HAP5，試驗組為pGBKT7-YB8+pGADKT7-HAP5。用醋酸鋰介導(dǎo)法將4組載體分別轉(zhuǎn)入酵母AH109感受態(tài)中，先涂布于SD/-Leu-Trp固體平板，待菌株生長良好后轉(zhuǎn)入SD/-Ade-His-Leu-Trp固體平板，觀察菌落生長狀況。將試驗組和對照組酵母分別涂布于含X-α-gal(4 mg·mL-1)的SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺板上，培養(yǎng)3～4 天觀察菌落顏色變化。

雙分子熒光互補重組載體通過艾德萊公司的無縫克隆(CV1901)試劑盒進(jìn)行載體構(gòu)建。利用BamHⅠ、KpnⅠ雙酶切線性化35S∷pSPYNE和35S∷pSPYCE載體，反應(yīng)體系為2×OneStep Cloning Mix 5 μL，線性化載體與插入片段摩爾比2∶1，ddH2O補足至10 μL。50 ℃下反應(yīng)30 min，隨后吸取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序成功后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。以轉(zhuǎn)入35S∷pSPYNE+35S∷pSPYCE的農(nóng)桿菌為空對照，以轉(zhuǎn)入35S∷pSPYNE∶PwNF-YB8+35S∷pSPYCE、35S∷pSPYCE∶PwHAP5+35S∷pSPYNE農(nóng)桿菌為陰性對照，以轉(zhuǎn)入35S∷pSPYCE∶PwHAP5+35S∷pSPYNE∶PwNF-YB8的農(nóng)桿菌為試驗組。煙草注射與培養(yǎng)方法同1.5，48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察YFP熒光信號。

1.7 青杄花粉體外萌發(fā)試驗

將青杄花粉從-80 ℃冰箱中取出并置于-20 ℃冰箱中復(fù)蘇12 h，隨后再放入4 ℃冰箱中適應(yīng)12 h，萌發(fā)試驗開始前2～3 h取出在室溫條件下備用。取0.02 g花粉置于5 mL花粉液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、120 r·min-1的搖床里避光萌發(fā)。將不同時間萌發(fā)的花粉置于光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)量(當(dāng)花粉管伸長長度大于花粉直徑時即視為萌發(fā))及此時的花粉管長度。每組試驗設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)統(tǒng)計250個花粉萌發(fā)情況，統(tǒng)計出不同萌發(fā)時間下花粉萌發(fā)率及花粉管長度的平均值。于正常萌發(fā)的0、6、12、18、24、30、36 h 取樣，硼酸及鈣離子處理時分別在萌發(fā)0、12、24 h取樣。

1.8 轉(zhuǎn)PwNF-YB8基因擬南芥的種子萌發(fā)試驗及幼苗根長統(tǒng)計

以野生型(WT)和轉(zhuǎn)空載體(VC)植株為對照，統(tǒng)計突變體、過表達(dá)PwNF-YB8擬南芥種子萌發(fā)率。將各株系擬南芥種子先用5%的NaClO溶液浸泡消毒20 min，再用無菌水清洗8次，之后播到MS培養(yǎng)基上，每株系播種100粒種子。以MS培養(yǎng)基為對照，鹽處理濃度為50、100、150 mmol·L-1，甘露醇處理濃度為100、200、300 mmol·L-1，統(tǒng)計不同株系種子在不同處理下的萌發(fā)率及子葉綠化率(Zhangetal., 2018)。試驗重復(fù)3次。

將野生型(WT)、轉(zhuǎn)空載體(VC)、突變體及過表達(dá)PwNF-YB8擬南芥各株系種子先播種到MS培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)移到不同脅迫條件的MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)，各株系分別選取10株幼苗。鹽脅迫濃度依次設(shè)置為50、100、150 mmol·L-1，甘露醇處理濃度依次設(shè)置為100、200、300 mmol·L-1。待萌發(fā)幼苗在各梯度濃度MS培養(yǎng)基生長8天后，統(tǒng)計幼苗根長。試驗設(shè)置3次重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理及分析

利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，單因素方差分析采用Dunnett檢驗，P<0.05為差異顯著。利用Sigma Plot 10.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青杄PwNF-YB8基因序列分析及同源性比對

通過本實驗室青杄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得PwNF-YB8基因(GenBank 登錄號： MT230480)的cDNA序列，長度為927 bp，編碼區(qū)489 bp，共編碼162個氨基酸。55 bp處為起始密碼子ATG，541 bp處為終止密碼子TGA，并在末端發(fā)現(xiàn)Poly(A)19尾巴(圖1)。此基因編碼的蛋白具有NF-YB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域(IPR003956)、NF-YB結(jié)合位點(IPR003957)等NF-YB家族的典型特征。PwNF-YB8蛋白理論分子量18.05 kDa，預(yù)測的等電點pI為5.67。通過HNN對PwNF-YB8蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，其由α螺旋(α-helix，41.98%)、延伸鏈(extended strand，6.79%)和大量無規(guī)則卷曲(random coil，51.23%)組成。信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，PwNF-YB8蛋白為易溶、親水性較強蛋白且不含跨膜肽段。

圖1 青杄PwNF-YB8 核酸序列及編碼蛋白氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced protein amino acid sequence of PwNF-YB8 in Picea wilsonii

將青杄PwNF-YB8編碼的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行Blast，選取7個其他物種中的同源基因。多序列比對發(fā)現(xiàn)PwNF-YB8在進(jìn)化上比較保守，并且和白云杉(Piceaglauca)PgNF-YB8序列完全相同(圖2A)，預(yù)測青杄與白云杉進(jìn)化上來源于同一祖先。在用MEGA10構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的過程中發(fā)現(xiàn)青杄除了與白云杉聚為一類外，還與模式植物擬南芥的遺傳距離較近(圖2B)。

圖2 PwNF-YB8與同源蛋白的多序列比對及進(jìn)化樹分析Fig. 2 Multiple sequence alignment and evolutionary tree analysis of PwNF-YB8 and homologous proteinsA: 多序列比對結(jié)果，相似度用3種顏色標(biāo)記(黑色=100%，粉色≥75%，藍(lán)色≥50%)，粗線段表示NF-YB保守結(jié)構(gòu)域，圖中螺旋結(jié)構(gòu)域(α1，α2，α3，αc)用黑色框表示，其中每2個螺旋結(jié)構(gòu)間形成環(huán)(L1，L2，L3)，位于L2的精氨酸和位于α3的天冬氨酸在NF-YB與NF-YC相互結(jié)合上起作用，位于α2中的2個谷氨酸對NF-YA的結(jié)合發(fā)揮功能； B: 系統(tǒng)進(jìn)化樹。A: Homologous protein multiple sequence alignment Conserved percent: Black=100%, Pink≥75%, Blue≥50%; The thick line indicates the NF-YB conserved domain, the helical domains (α1, α2, α3, αc) in the figure are represented by black boxes, in which a loop (L1, L2, L3) is formed between every two helical structures; Arginine located at L2 and aspartic acid placed α3 act on the binding of NF-YB and NF-YC, and the two glutamic acids located in α2 play a role in the binding of NF-YA. B: Phylogenetic tree analysis.

2.2 青杄PwNF-YB8的表達(dá)特性分析

PwNF-YB8在青杄各組織內(nèi)均有表達(dá)。其中，在花粉中表達(dá)量最高，其次是在針葉中(圖3A)。分別測定在鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)、干旱(20%PEG)、高溫(42 ℃)、ABA(100 mmol·L-1)及不同處理時間(0、2、4、6、8、12 h)下PwNF-YB8的表達(dá)變化，結(jié)果(圖3B)表明，PwNF-YB8在鹽脅迫及干旱脅迫下有明顯響應(yīng)。鹽脅迫處理后，PwNF-YB8的表達(dá)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在鹽處理6 h后轉(zhuǎn)錄水平升至最高，為對照表達(dá)量的8.24倍。在干旱條件下，4 h時達(dá)到對照的2.08倍，其他時間內(nèi)差異不明顯。在高溫脅迫處理下，PwNF-YB8基因無顯著誘導(dǎo)表達(dá)。在ABA處理下，PwNF-YB8的表達(dá)呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，在處理12 h后相對表達(dá)量最高。

圖3 青杄PwNF-YB8的表達(dá)特性分析Fig. 3 The expression of PwNF-YB8 in Picea wilsonii不同字母表示在Dunnett檢驗下差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant difference under Dunnett’s test (P<0.05). The same below.

2.3 PwNF-Y8的亞細(xì)胞定位分析

為了排除GFP位置差異對目的片段定位產(chǎn)生影響，分別使用2種表達(dá)載體(pSUPER1300載體和pCAMBIA1205載體)瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片(圖4A)。基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，以轉(zhuǎn)入空載體的洋蔥細(xì)胞作為陰性對照(圖4B)。結(jié)果顯示，陰性對照組空載體GFP信號定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核； 試驗組中，PwNF-YB8和GFP的融合蛋白定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中，表明PwNF-YB8在細(xì)胞中均有表達(dá)，且GFP的連接位置并不影響其定位情況(圖4C)。

圖4 PwNF-YB8的亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of PwNF-YB8標(biāo)尺Bar： 50 μm.A: 2種PwNF-YB8-GFP融合蛋白表達(dá)載體示意圖； B: 基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞定位圖； C: 瞬時轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞定位圖。A: Schematic diagram of two PwNF-YB8-GFP fusion protein expression vectors; B: Location map of onion epidermal cells bombarded by gene gun; C: Location map of transiently transformed tobacco cells.

2.4 PwNF-YB8與PwHAP5互作

首先檢測PwNF-YB8的轉(zhuǎn)錄自激活活性，構(gòu)建PwNF-YB8全長載體，試驗組為pGBKT7-YB8+pGADT7，以pGBKT7-p53+pGADT7為陽性對照，以pGBKT7+pGADT7為陰性對照。結(jié)果顯示，pGBKT7+pGADT7、pGBKT7-p53+pGADT7、pGBKT7-YB8+pGADT7均能在SD/-Trp-Leu板上生長，說明重組載體成功轉(zhuǎn)到了酵母菌株中，但只有陽性對照組能夠在SD/-Trp-Leu-His板上生長，說明PwNF-YB8無轉(zhuǎn)錄激活活性(圖5A)?；プ髟囼炛性囼灲M為pGBKT7-YB8+pGADT7-HAP5，以pGBKT7-p53+pGADT7為陽性對照，以pGBKT7-YB8+pGADT7、pGBKT7+pGADT7為陰性對照。結(jié)果顯示，對照組和試驗組的酵母菌落均能在SD/-Leu-Trp二缺板上生長，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功，試驗組和陽性對照組能夠在SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺板上生長且在X-α-gal的染色下變藍(lán)，證明PwNF-YB8和PwHAP5互作(圖5B)。

圖5 PwNF-YB8的轉(zhuǎn)錄激活活性分析及與PwHAP5的互作Fig. 5 Analysis of transcriptional activation activity of PwNF-YB8 and its interaction with PwHAP5A: PwNF-YB8轉(zhuǎn)錄激活活性； B: 酵母雙雜交PwNF-YB8與PwHAP5的互作； C: PwNF-YB8與PwHAP5的雙分子熒光互補試驗分析, 標(biāo)尺=50 μm。A: PwNF-YB8 transcriptional activation activity; B: Yeast two-hybrid PwNF-YB8 and PwHAP5 interaction; C: PwNF-YB8 and PwHAP5 bimolecular fluorescence complementary experiment analysis, Bar=50 μm.

在煙草葉片中進(jìn)行雙分子熒光互補試驗(圖5C)，進(jìn)一步驗證PwNF-YB8與PwHAP5的互作。將編碼PwNF-YB8及PwHAP5蛋白的核酸序列分別構(gòu)建到nYFP和cYFP(即熒光蛋白的N端和C端)上，獲得nYFP-PwNF-YB8、cYFP-PwHAP5載體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察是否產(chǎn)生YFP熒光信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅試驗組PwNF-YB8與PwHAP5 共轉(zhuǎn)的組合可以檢測到明顯的YFP熒光信號，其他對照組合并未檢測到黃色熒光信號，表明PwNF-YB8和PwHAP5蛋白可以發(fā)生互作。

2.5 PwNF-YB8參與青杄花粉萌發(fā)過程且受鈣、硼離子誘導(dǎo)

利用青杄花粉萌發(fā)試驗檢測花粉質(zhì)量?；ǚ勖劝l(fā)過程中，從花粉一端萌發(fā)出花粉管，并隨萌發(fā)時間而逐漸伸長(圖6A)。0～6 h，花粉萌發(fā)數(shù)很少，12～24 h是萌發(fā)的高峰期，到24 h基本萌發(fā)完全萌發(fā)率達(dá)70%，之后的12 h過程中萌發(fā)率上升較慢，36 h時萌發(fā)率為75%左右(圖6B)。在花粉正常萌發(fā)過程中，對PwNF-YB8基因表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其在花粉萌發(fā)過程中變化明顯，且在花粉萌發(fā)36 h時表達(dá)量最高(圖6C)。

圖6 青杄花粉萌發(fā)及PwNF-YB8在花粉萌發(fā)過程中的表達(dá)Fig. 6 Germination of Picea wilsonii pollen and expression of PwNF-YB8 in the process of pollen germinationA: 正常萌發(fā)過程花粉形態(tài)； B: 花粉萌發(fā)過程中花粉管長度及萌發(fā)率統(tǒng)計； C: 花粉萌發(fā)過程中PwNF-YB8的相對表達(dá)量； D: 氯化鈣和硼酸誘導(dǎo)下PwNF-YB8的相對表達(dá)量分析。A: Pollen morphology during normal germination; B: Statistics of pollen tube length and germination rate during pollen germination; C: Relative expression of PwNF-YB8 during pollen germination; D: Relative expression of PwNF-YB8 induced by calcium chloride and boric acid.

青杄花粉萌發(fā)受到鈣離子及硼離子誘導(dǎo)，因此檢測0.1%(W/W) CaCl2和0.1%(W/W) H3BO3誘導(dǎo)花粉過程中PwNF-YB8表達(dá)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈣離子誘導(dǎo)下，PwNF-YB8表現(xiàn)為先下降后略微上升； 硼離子作用下，PwNF-YB8的表達(dá)量下降(圖6D)。

2.6 擬南芥突變體和轉(zhuǎn)基因植株的獲得及鑒定

通過CRISPR/Cas 9技術(shù)敲除PwNF-YB8在擬南芥中的同源基因AtNF-YB8，得到突變體nfyb8-cas9#1、nfyb8-cas9#12。DNA水平檢測證明在特定突變位點處發(fā)生了堿基突變，基因靶位點突變成功，獲得突變體(圖7A)，測序峰圖結(jié)果顯示增加的堿基處為單一峰，證明已經(jīng)獲得純合突變體(圖7B)。對突變位置進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)突變位點均在突變體植株外顯子上。經(jīng)蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，突變體植株編碼的AtNF-YB8蛋白序列提前終止(圖7C)，可以作為植物試驗材料進(jìn)行后續(xù)的表型試驗。

圖7 擬南芥突變體植株測序峰及擬南芥野生型植株、突變體植株蛋白序列Fig. 7 Sequencing peak map of Arabidopsis thaliana mutant plants and protein sequence of A. thaliana wild-type plants and mutant plantsA: AtNF-YB8基因靶位點突變模式； B: 擬南芥突變體植株測序峰圖(*表示測序峰圖中突變體植株與野生型植株測序峰圖相比增加的堿基所在位置)； C: 擬南芥突變體編碼AtNF-YB蛋白序列。A: AtNF-YB8 gene target site mutation pattern; B: Sequencing peak map of Arabidopsis mutant plants(* indicates the location of the increased bases in the sequencing peak map of the mutant plant compared to the wild type plant); C: Arabidopsis mutant encoding AtNF-YB protein sequence.

采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法，經(jīng)DNA水平檢測后共獲得6株P(guān)wNF-YB8轉(zhuǎn)基因株系(圖8A)； qRT-PCR結(jié)果表明Line4(L4)和Line5(L5)表達(dá)量相對較高，因此作為進(jìn)一步試驗的材料。結(jié)果顯示，在L4和L5株系中，PwNF-YB8基因成功轉(zhuǎn)入到擬南芥植株中(圖8B)。

圖8 轉(zhuǎn)基因PwNF-YB8擬南芥植株的獲得與鑒定Fig. 8 Obtaining and identification of transgenic PwNF-YB8 plants of Arabidopsis thalianaA: 過表達(dá)株系的PCR鑒定(M： DNA marker； Col: 擬南芥野生型植株； P: 以鑒定正確的PwNF-YB8∶1205陽性質(zhì)粒為模板的擴(kuò)增情況； 1-6: 不同陽性植株)； B: 野生型(WT)和過表達(dá)株系(P8-L4, P8-L5)中PwNF-YB8的表達(dá)量分析。A: PCR identification of overexpressing lines(M: DL2000 marker; Col: Negative control; P: Positive control; 1-6: Different positive plants); B: PwNF-YB8 expression analysis in wild type(WT) and overexpressing lines(P8-L4, P8-L5).

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在干旱脅迫下的表型分析

種子萌發(fā)試驗結(jié)果表明，所有株系的擬南芥種子萌發(fā)率隨甘露醇濃度的升高而降低。在MS培養(yǎng)基中，突變體植株的萌發(fā)率略低，而野生型、轉(zhuǎn)空載體(VC)和過表達(dá)株系間的萌發(fā)率無顯著差異。在100、200和300 mmol·L-1甘露醇濃度下，突變體植株表現(xiàn)出較高的敏感性，萌發(fā)率顯著低于其他株系。在100、200 mmol·L-1的甘露醇濃度下，L4和L5株系的萌發(fā)率顯著低于野生型。在300 mmol·L-1的甘露醇濃度下，所有株系的萌發(fā)率明顯下降，此時過表達(dá)株系與野生型、VC株系的萌發(fā)率無顯著差異，而突變體植株的萌發(fā)率相較于其他株系顯著降低(圖9A、C)。子葉綠化率統(tǒng)計結(jié)果顯示在MS培養(yǎng)基中，所有株系的子葉綠化率均達(dá)到100%； 在100 mmol·L-1甘露醇處理條件下，野生型植株、VC株系的子葉綠化率顯著高于其他株系，突變體株系和L5株系子葉綠化率較低，L4和L5株系間差異顯著； 在200 mmol·L-1甘露醇處理條件下，野生型植株、VC的子葉綠化率仍然顯著高于其他株系，突變體植株子葉綠化率最低，L4與L5株系之間差異顯著，過表達(dá)株系與野生型、VC植株的子葉綠化率差異顯著(圖9D)。

圖9 不同甘露醇濃度下擬南芥不同株系的種子萌發(fā)率和幼苗根長Fig. 9 Seed germination rate and seedling root length of different lines of Arabidopsis thaliana under different concentrations treatments of mannitolWT: 野生型株系； VC: 空載體株系； P8-L4, P8-L5: 過表達(dá)株系； nfyb8-cas9#1, nfyb8-cas9#12: 突變體株系。下同。A, C: 甘露醇處理下萌發(fā)率統(tǒng)計； D: 甘露醇處理下子葉綠化率統(tǒng)計； B, E: 甘露醇處理下幼苗根長統(tǒng)計。WT: Wild type; VC: Empty vector control; P8-L4, P8-L5: Overexpressing plants; nfyb8-cas9#1, nfyb8-cas9#12: Mutant plants. The same below. A, C: Statistics of germination rate under mannitol treatment; D: Statistics of cotyledon greening rate under mannitol treatment; B, E: Statistics of seedling root length under mannitol treatment.

擬南芥幼苗根長試驗結(jié)果表明，隨著施加甘露醇的濃度增加，所有株系的根長隨甘露醇濃度的升高而縮短。在MS培養(yǎng)基中，突變體植株的根長明顯短于其他株系，野生型、VC和過表達(dá)株系之間根長無顯著差異。在100、 200、 300 mmol·L-1的甘露醇濃度下，L4和L5株系的根長顯著長于野生型和VC株系，相比之下突變體株系對甘露醇處理更敏感，與其他株系差異顯著(圖9B、E)。

2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在鹽脅迫下的表型分析

擬南芥種子萌發(fā)試驗結(jié)果顯示，鹽處理下突變體植株顯示出更高的敏感性，種子萌發(fā)率顯著低于其他株系。例如在150 mmol·L-1NaCl濃度下，野生型植株、VC株系、L4、L5株系的最終萌發(fā)率分別為92.0%、90.0%、92.3%、94.3%，而2個突變體株系nfyb8-cas9#1、nfyb8-cas9#12的萌發(fā)率分別為46%、72.7%(圖10A、B)。

圖10 不同鹽濃度下擬南芥不同株系的種子萌發(fā)率和幼苗根長Fig. 10 Seed germination rate and seedling root length of different lines of Arabidopsis thaliana under different concentrations treatments of NaClA, B: 鹽處理下萌發(fā)率統(tǒng)計； C, D: 鹽處理下幼苗根長統(tǒng)計。A, B: Statistics of germination rate under salt treatment; C, D: Statistics of seedling root length under salt treatment.

隨后利用不同濃度的NaCl模擬鹽脅迫來探究轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗對鹽脅迫的耐受性。在0 mmol·L-1濃度下突變體根長最短，在50、100 mmol·L-1濃度下對照組與突變體根長無顯著差異，而轉(zhuǎn)基因L4和L5幼苗的根長明顯長于野生型、轉(zhuǎn)空載體及突變體株系(圖10C、D)。以上結(jié)果表明在一定濃度的鹽脅迫下，異源過表達(dá)植株相較于其他株系顯示出更優(yōu)的耐受性。

3 討論

本研究從青杄中克隆得到PwNF-YB8基因，對其編碼的氨基酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因存在典型的NF-YB轉(zhuǎn)錄因子保守位點和結(jié)合位點，屬于NF-Y轉(zhuǎn)錄因子家族。多序列對比顯示，PwNF-YB8蛋白結(jié)構(gòu)保守，二級結(jié)構(gòu)包括4個螺旋結(jié)構(gòu)和3個無規(guī)則卷曲組成的helix-loop-helix結(jié)構(gòu)。這種高度保守的結(jié)構(gòu)域在NF-Y轉(zhuǎn)錄因子和DNA結(jié)合、NF-Y與其他蛋白相互作用中至關(guān)重要(Mantovani, 1999; Romieretal., 2003)。NF-YB轉(zhuǎn)錄因子中位于α2中的2個谷氨酸對與NF-YA的結(jié)合發(fā)揮功能，位于L2的精氨酸和位于α3的天冬氨酸在NF-YB與NF-YC相互結(jié)合上起作用。一般而言，NF-Y可形成異源三聚體發(fā)揮作用。例如，擬南芥DPB3-1(NF-YC10)可以與NF-YA2和NF-YB3形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，三聚體與DREB2A在熱應(yīng)激反應(yīng)過程中協(xié)同增強熱應(yīng)激誘導(dǎo)的基因表達(dá)，增強植株的耐熱性(Satoetal., 2014)。在菜豆(Phaseolusvulgaris)×根瘤菌(Rhizobium)的互作研究中發(fā)現(xiàn)，NF-Y異源三聚體(PvNF-YC1、PvNF-YB7及PvNF-YA1)能夠參與共生結(jié)節(jié)發(fā)生過程(Ripodasetal., 2019)。近年來，一些研究表明NF-Y也可作為miRNA的靶基因，或與miRNA基因啟動子結(jié)合發(fā)揮作用。例如，GmNF-YA3可作為miR169的靶基因在植物干旱脅迫中起到正向調(diào)控作用(Nietal., 2013)，菊花(Chrysanthemum×morifolium)CmNF-YB8能夠與cmo-MIR156基因的啟動子結(jié)合，通過直接調(diào)節(jié)衰老途徑中cmo-MIR156的表達(dá)來影響開花時間(Weietal., 2017)，PwNF-YB8是否也會以類似方式發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2B)可以發(fā)現(xiàn)，青杄PwNF-YB8與白云杉NF-YB沒有發(fā)生分離，與模式植物擬南芥AtNF-YB8比較接近，而與木本植物毛果楊的PtNF-YB發(fā)生了分離，表明青杄PwNF-YB8在功能上與白云杉一致，預(yù)示NF-YB8在云杉家族中比較保守，而在功能上可能與毛果楊存在差異。

NF-YB類亞基與NF-YC類亞基間常通過互作發(fā)揮功能。例如： 水稻OsNF-YC12和OsNF-YB9可以與OsGI一起形成功能復(fù)合體，在水稻調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮功能，調(diào)控水稻的穗序(Dasetal., 2019)。同樣地，水稻OsNF-YC2和OsNF-YC4可以與OsNF-YB8、OsNF-YB10或OsNF-YB11轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而調(diào)節(jié)水稻光周期開花反應(yīng)(Kimetal., 2016)。但不是所有YB與YC類亞基都能夠互作(Hackenbergetal., 2012a; Thirumuruganetal., 2008)，如AtNF-YC12可以與13個AtNF-YB互作，而AtNF-YC13則不與AtNF-YB互作。本課題組在前期的研究中，在篩選Ca2+誘導(dǎo)的青杄花粉cDNA文庫時得到了一種NF-YC類轉(zhuǎn)錄因子，并將其命名為PwHAP5，隨后證實該轉(zhuǎn)錄因子能夠與PwFKBP12互作，參與花粉管的導(dǎo)向調(diào)節(jié)(Yuetal., 2011)。同時篩選出3個NF-YB亞基基因，分別命名為PwNF-YB3/8/13，根據(jù)NF-Y在植物體內(nèi)的異源三聚體作用模式推測其可能與PwHAP5互作。通過酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)只有PwNF-YB8能與PwHAP5互作，故在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過雙分子熒光互補技術(shù)驗證了二者的互作。qRT-PCR顯示PwNF-YB8在花粉萌發(fā)過程中，表達(dá)量變化顯著，且在36 h達(dá)到最高，PwNF-YB8也受到鈣離子、硼離子誘導(dǎo)。這些結(jié)果顯示PwNF-YB8通過與PwHAP5互作可能在青杄花粉發(fā)育過程中協(xié)同發(fā)揮作用。

NF-Y轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物應(yīng)對非生物脅迫的過程。在擬南芥與玉米中分別過表達(dá)AtNF-YB1和ZmNF-YB2的植株，相較于野生型表現(xiàn)出更強的干旱脅迫耐受性(Nelsonetal., 2007)。同樣地，異源過表達(dá)美洲黑楊PdNF-YB7的擬南芥植株，其耐旱性及水分利用率顯著提高(Hanetal., 2013)。小麥TaNF-YB3;1的表達(dá)量在模擬干旱條件下顯著上升，且ABA受體基因的轉(zhuǎn)錄水平在過表達(dá)TaNF-YB3;1的植物中上調(diào)，這表明TaNF-YB3;1很可能通過調(diào)節(jié)ABA信號而提高了植物的耐旱性(Yangetal., 2017)。本研究發(fā)現(xiàn)PwNF-YB8在青杄各組織中都有表達(dá)，且在針葉中表達(dá)量也較高。此外，qRT-PCR顯示，PwNF-YB8對干旱及鹽脅迫有明顯響應(yīng)，這暗示了PwNF-YB8可能參與植物應(yīng)對非生物脅迫的過程。為了驗證這一假說，本研究通過異源轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，研究其在植物應(yīng)對非生物脅迫過程中發(fā)揮的作用。實驗室前期在ARBC網(wǎng)站上購買了atnfyb8突變體，但經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)atnfyb8突變體植株的AtNF-YB8基因表達(dá)量并未降低，無法進(jìn)行后續(xù)的表型試驗研究(鞠丹,2017)，故利用CRISPR/Cas 9技術(shù)成功獲得擬南芥突變體，進(jìn)行表型分析。NF-YB亞基能夠促進(jìn)植物在干旱脅迫下的根系生長。在擬南芥中過表達(dá)AtHAP3b發(fā)現(xiàn)，與野生型植株相比過表達(dá)植株的初級根明顯伸長，在根尖區(qū)域調(diào)控細(xì)胞分裂和伸長 (Ballifetal., 2011)； 在大豆(Glycinemax)中過表達(dá)GmHAP3-17發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下其根系生長顯著優(yōu)于野生型植株，植物抗旱性提高(王鼎慧等,2015)。更發(fā)達(dá)的根系有利于植物抵御干旱脅迫，在甘露醇處理下，異源轉(zhuǎn)化植株的根長明顯長于其他株系，顯示出了一定耐受性，美洲黑楊PdNF-YB21與PdFUSCA3共同作用，增強了PdNCED3的表達(dá)，使ABA含量上升從而增強植物抗旱性(Zhouetal., 2020)，PwNF-YB8也在ABA處理下明顯響應(yīng)，推測其可能在類似的ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。在干旱脅迫下異源轉(zhuǎn)化擬南芥植株和突變體的種子萌發(fā)率、子葉綠化率均低于對照植株，異源過表達(dá)PwNF-YB8株系在鹽脅迫下萌發(fā)率與對照組差異不明顯，而突變體植株顯示出高敏感性。植物中NF-Y家族龐大，常存在功能冗余或分化現(xiàn)象，擬南芥nf-yc2突變體和過表達(dá)煙草NF-YC2的擬南芥植株對光氧化脅迫沒有表現(xiàn)出表型差異，這可能與NF-YC亞基之間的冗余性有關(guān)，當(dāng)一個NF-YC基因的表達(dá)被抑制時，該家族的另一成員可能彌補了這一缺陷(Hackenbergetal., 2012b)。鹽芥(Eutremasalsugineum)中EsNAC1與擬南芥的RD26高度同源，但EsNAC1異源株系與擬南芥同源基因ANAC072的過表達(dá)株系顯示出不同的表型，且異源株系非生物脅迫抗性的增強是通過調(diào)控不同靶基因的表達(dá)來實現(xiàn)的(Liuetal., 2018)。由此推測PwNF-YB8與AtNF-YB8在功能上可能存在差異，尤其是在應(yīng)對干旱和鹽脅迫時可能通過靶向不同基因來應(yīng)對不良環(huán)境。

對于針葉樹種青杄而言，建立自身體系較為困難，因此利用模式植物擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化、初步鑒定其基因功能。例如在擬南芥中過表達(dá)牛心樸子草(Cynanchumkomarovii)CkNF-YB1能夠增強植株抗旱性，擬南芥nf-yb3突變體對干旱高敏感，葉片萎蔫程度高，而在突變體中過表達(dá)CkNF-YB1后其在干旱脅迫下與野生型一致，說明CkNF-YB1能夠彌補AtNF-YB3的缺失，發(fā)揮功能(馬曉聞,2016)。此外，在擬南芥CO突變體中異源過表達(dá)烏桕(Sapiumsebiferum)SsCO基因后開花時間與野生型一致，恢復(fù)了突變體晚開花的表型(Pengetal., 2018)，在擬南芥attt2突變體中過表達(dá)茶樹(Camelliasinensis)CsMYB5b能夠恢復(fù)其種皮原花青素(proanthocyanidins, PAs)的生成使表型恢復(fù)(Wangetal., 2019a)。本研究未獲得突變體的回補株系，后續(xù)可通過在突變體植株中分別過表達(dá)青杄NF-YB8和擬南芥NF-YB8，看其是否能夠恢復(fù)表型，具體機(jī)制有待下一步研究。另外，在滲透脅迫條件下，擬南芥hap3b-1和hap3b-2突變體的開花時間明顯晚于野生型植物(Chenetal., 2007)； 過表達(dá)HAP3b的擬南芥對冷敏感而突變體耐寒性增強(梁明祥等,2010)。因此，PwNF-YB8是否參與花期調(diào)控或冷脅迫過程，有待于對成苗進(jìn)行逆境脅迫處理后進(jìn)一步驗證分析。

4 結(jié)論

青杄PwNF-YB8基因開放閱讀框為489 bp，編碼162個氨基酸，其在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有定位，自身無轉(zhuǎn)錄激活活性。PwNF-YB8基因在青杄花粉、針葉中表達(dá)量較高，在鹽脅迫、干旱脅迫處理下表達(dá)量變化顯著。PwNF-YB8能夠與NF-YC類亞基PwHAP5發(fā)生互作，參與青杄花粉萌發(fā)過程且受到鈣離子、硼離子誘導(dǎo)。相較于野生型植株，過表達(dá)PwNF-YB8基因的擬南芥幼苗在干旱、鹽脅迫下具有一定的根長生長優(yōu)勢。這些結(jié)果表明，PwNF-YB8與PwHAP5可能協(xié)同參與了花粉萌發(fā)和花粉管生長過程，其在逆境脅迫中發(fā)揮一定的作用，但具體抗逆途徑有待進(jìn)一步研究。