Menkes病二家系遺傳學(xué)分析

彭 薇 王三梅 馬 寧 楊 曉

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心 出生缺陷防控關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室兒童器官功能衰竭北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100700）

Menkes ?。∕D，MIM 309400）是一種X 連鎖隱性致死性疾病，新生兒的發(fā)病率為1/250000～1/100000[1]。MD 是由ATP 7 A（MIM 300011）基因變異引起的銅代謝異常疾病，該基因位于Xq12-q13.3，編碼一種跨膜銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶。絕大多數(shù)的MD患者是男性，其母親是雜合子攜帶者[2]。MD 根據(jù)表型和進(jìn)展情況可以分為3 種類型。嚴(yán)重經(jīng)典型MD（占90%～95%）在嬰兒期起病，常見進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性、頭發(fā)改變和結(jié)締組織異常，多在3 歲內(nèi)死亡；非典型輕度MD存活時(shí)間較長(zhǎng)；枕骨角綜合征（occipital horn syndrome，OHS）是以結(jié)締組織異常為主要特征，是臨床表現(xiàn)最輕的一種[3]。迄今為止共報(bào)道過3次中國(guó)人群的ATP7A基因檢測(cè)結(jié)果，2008年報(bào)道1例MD患兒ATP7A基因的新發(fā)變異[4]，2014年報(bào)道3例MD患兒的臨床與ATP7 A基因分析[5]，2017年對(duì)24例男性MD 患兒進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)[6]。目前臨床診斷MD 主要靠臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查，明確診斷則需要進(jìn)行ATP7A基因檢測(cè)。本文報(bào)告2例MD患兒及其家系，分析其臨床及遺傳學(xué)特征。

1 臨床資料

例1，男，2 月齡，孕36 周自然分娩，生后2 天因皮膚黃染入住重癥監(jiān)護(hù)病房，經(jīng)治療13 天后出院。出院后又發(fā)現(xiàn)吃奶差、皮膚蒼白再次入住本院重癥監(jiān)護(hù)病房，治療21 天出院。此次因3 天前間斷抽搐5次第3 次入院?；純撼榇r(shí)有眨眼、四肢向中位線抽動(dòng)，偶伴吐沫。體格檢查：頭圍37 cm（P3），膚色白皙，頭發(fā)稀少、卷曲、脆黃，控頭差，豎立不穩(wěn)，追視稍差，追聽可，肌張力減低。頭顱大小正常，無畸形及腫塊，眼距稍寬，眼裂小。胸廓對(duì)稱無畸形，雙肺呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)稱，呼吸頻率正常，叩診清音，聽診呼吸音清晰，未聞及干濕啰音和胸膜摩擦音。心前區(qū)無隆起和凹陷，心尖搏動(dòng)范圍正常，心率118 次/min，心律齊，各瓣膜區(qū)未聞及心臟雜音。腹部平坦，腹式呼吸存在，無腹部靜脈曲張，未見腸型及蠕動(dòng)波，無壓痛及反跳痛，未觸及包塊，肝肋緣下未觸及，未觸及膽囊，Murphy 征陰性。父母體健。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、血生化無異常，血漿銅藍(lán)蛋白低3.8 mg/dL；血、尿遺傳代謝篩查未見異常。腦電圖示異常腦電圖，睡眠期左側(cè)頂、枕、中后顳區(qū)見稍多低-中波幅棘波、尖波散發(fā)或簇發(fā)。頭顱核磁共振成像（MRI）示雙側(cè)頂枕葉、后聯(lián)合異常信號(hào)，雙側(cè)額顳頂部蛛網(wǎng)膜下隙增寬（圖1A）。

例2，男，4月齡，因精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后1月余入院?；純合礕2P2，生后1月余可逗笑，可交流，后逐漸消失。入院表現(xiàn)為無意識(shí)交流，不可逗笑?；純耗w色白皙，頭發(fā)稀少，追視、追聽稍差，頭控差，不會(huì)抓物，肌張力減低。體格檢查：發(fā)育落后于正常同齡兒，面容正常，步態(tài)正常。頭顱大小正常，無畸形及腫塊，胸廓對(duì)稱無畸形，雙肺呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)稱，呼吸運(yùn)動(dòng)和呼吸頻率正常，雙肺叩診清音，聽診呼吸音清晰，未聞及干濕啰音和胸膜摩擦音。心前區(qū)無隆起和凹陷，心尖搏動(dòng)范圍正常，心率120次/min，心律齊，各瓣膜區(qū)未聞及心臟雜音。腹部平坦，腹式呼吸存在，無腹部靜脈曲張，未見腸型及蠕動(dòng)波，無壓痛及反跳痛，未觸及包塊，肝肋緣下未觸及，未觸及膽囊，Murphy 征陰性，父母身體健康。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、血生化無異常，血漿銅藍(lán)蛋白低6.3 mg/dL；血、尿遺傳代謝病篩查未見異常。腦電圖示異常腦電圖，腦波活動(dòng)輕度延遲，睡眠期雙側(cè)枕、后顳區(qū)見稍多量中高波幅棘波、棘慢波散發(fā)、簇發(fā)。MRI示腦外間隙增寬（圖1B）。

圖1 患兒顱腦MRI 表現(xiàn)

為進(jìn)一步明確診斷及進(jìn)行遺傳咨詢，經(jīng)解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人知情同意后，采集2 例先證者及其父母外周血各2 mL EDTA抗凝。應(yīng)用北京Tiangen公司的TIANamp Blood血液基因組DNA提取試劑盒（目錄號(hào)：DP318）提取全血基因組DNA。參照文獻(xiàn)[7]共設(shè)計(jì)23 對(duì)引物，以覆蓋ATP7A基因全部外顯子及其側(cè)翼序列，引物合成由上海生物工程有限公司完成。50 μL PCR反應(yīng)體系包括：22 μL超純水，25 μL PCR MIX（北京天根生化科技公司），引物（10 pmol/μL）各1 μL，1 μL DNA模板。PCR在GeneAmp PCR System 9700 PCR儀（Applied Biosystems）上完成。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，使用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果與人類基因庫的ATP 7 A基因參考序列（NM_000052.6）進(jìn)行比對(duì)，并用反向測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

基因檢測(cè)結(jié)果顯示，例1 檢測(cè)到ATP 7 A基因第21 外顯子存在c.4077 dupT（p.Val 1360 Cysfs*7）（NM_000052.6）純合變異，家系驗(yàn)證其父母均為野生型（圖2 A）。該變異在gnomAD 數(shù)據(jù)庫中頻率為0，HGMD 數(shù)據(jù)庫未見報(bào)道，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）指南中將致病變異的證據(jù)分為非常強(qiáng)（very strong,PVS 1）、強(qiáng)（strong,PS 1-4）、中等（moderate,PM 1-6），或支持（supporting,PP1-5）。根據(jù)ACMG指南劃分為致病變異（PVS1+PM2+PM6+PP4）。例2檢測(cè)到ATP7A基因第10 外顯子存在c.2354 delC（p.Pro 785 Leufs*9）（NM_000052.6）純合變異，家系驗(yàn)證其父母均為野生型（圖2B）。該變異在gnomAD數(shù)據(jù)庫中頻率為0，HGMD數(shù)據(jù)庫未見報(bào)道，ACMG指南劃分為致病變異（PVS1+PM2+PM6+PP4）。

圖2 患兒家系A(chǔ)TP7A 基因測(cè)序圖

2 討論

MD 是一種X 染色體上ATP 7 A基因變異的致死性罕見遺傳病。ATP 7 A在細(xì)胞質(zhì)N-端含有6 個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)，8 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TM 1-8）和3 個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[2]。該病常見的臨床表現(xiàn)包括毛發(fā)異常、癲癇發(fā)作、進(jìn)行性智力發(fā)育落后、肌張力低下等，血漿銅藍(lán)蛋白降低?？商崾驹\斷，腦電圖呈中至重度異常，在癲癇發(fā)作的不同階段表現(xiàn)出不同特點(diǎn)[8]。MD 患兒早期頭顱MRI表現(xiàn)可正常，隨著病情發(fā)展可出現(xiàn)特征性影像學(xué)改變包括顱內(nèi)血管迂曲、髓鞘發(fā)育不良、腦白質(zhì)異常、腦萎縮、硬膜下積液或血腫等[9-10]。MD患兒新生兒期可出現(xiàn)持續(xù)性黃疸和喂養(yǎng)困難[5]，這與例1 患兒生后的臨床表現(xiàn)類似。例1 患兒2 月齡出現(xiàn)癲癇發(fā)作，并伴有典型的毛發(fā)改變，膚色白皙，肌張力減低；血清銅和血漿銅藍(lán)蛋白值降低；腦電圖示稍多量中棘慢波散發(fā)、簇發(fā)；頭顱MRI示雙側(cè)額顳頂部蛛網(wǎng)膜下隙增寬。例2 患兒臨床表現(xiàn)為毛發(fā)異常，智力發(fā)育落后，肌張力改變；血清銅和血漿銅藍(lán)蛋白降低；腦電圖見稍多量中高波幅棘波、棘慢波散發(fā)、簇發(fā)；頭顱MRI目前除腦外間隙增寬外未見明顯異常。通過臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查對(duì)2 例患兒可作出初步診斷。

對(duì)2 例患兒家系進(jìn)行ATP 7 A基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，例1 患兒ATP 7 A基因第21 外顯子存在c.4077 dupT/ p.Val 1360 Cysfs*7 純合變異，該變異導(dǎo)致1360 位密碼子編碼的纈氨酸變?yōu)榘腚装彼幔浜笠虍a(chǎn)生移碼而使終止密碼子在1366 位氨基酸提前產(chǎn)生。該變異位于TM 7，父母均為野生型。該變異在gnomAD、HGMD數(shù)據(jù)庫均未見報(bào)道，根據(jù)ACMG 指南劃分為致病變異。1977年伊斯坦布爾大學(xué)遺傳學(xué)系對(duì)41例經(jīng)典MD患兒進(jìn)行ATP 7 A基因檢測(cè)，檢測(cè)到1 例位于TM 7 的變異c.4030_4031 insTGCCA。2013 年哥本哈根大學(xué)又發(fā)現(xiàn)1例位于TM7的變異c.4057_4058dupAA，該患兒臨床表現(xiàn)為典型的MD，19 個(gè)月死亡，家系中有其他成員受累發(fā)病[8]。本研究例2患兒ATP7A基因第10外顯子存在c.2354delC/p.Pro785Leufs*9純合變異，該變異導(dǎo)致785 位密碼子編碼的脯氨酸變?yōu)榱涟彼幔浜笠虍a(chǎn)生移碼而使終止密碼子在793位氨基酸提前產(chǎn)生。該變異位于TM4，理論上導(dǎo)致在跨膜結(jié)構(gòu)域中段之后的蛋白功能喪失，父母均為野生型。該變異在gnomAD、HGMD數(shù)據(jù)庫均未見報(bào)道，根據(jù)ACMG指南劃分為致病變異。有研究發(fā)現(xiàn)第10 外顯子上同一位點(diǎn)發(fā)生c.2354 dupC 變異，患兒臨床表現(xiàn)為典型的MD，18個(gè)月死亡，患兒為家族中唯一發(fā)病成員[11]。

MD 可以分為3 種類型，有研究認(rèn)為其臨床表型與ATP7A基因變異類型密切相關(guān)[12]。ATP7A的致病性變異導(dǎo)致與銅轉(zhuǎn)運(yùn)障礙相關(guān)的多種臨床可識(shí)別的表型，殘留ATP 7 A功能的程度決定了其表型的嚴(yán)重程度[2]。研究發(fā)現(xiàn)，剪切變異可能產(chǎn)生一些有殘留正常功能的蛋白質(zhì)，更可能導(dǎo)致枕骨角綜合征和輕型患兒；而嚴(yán)重的外顯子缺失或無義變異常表現(xiàn)為嚴(yán)重的經(jīng)典型MD，并在兒童早期死亡[13-14]；當(dāng)?shù)鞍坠δ苁Ｓ?0%～70%時(shí)，可以表現(xiàn)為晚發(fā)的遠(yuǎn)端運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病[15]。結(jié)合基因型-表型關(guān)聯(lián)分析這兩例患兒更符合經(jīng)典型MD。

截止目前，人類HGMD 數(shù)據(jù)庫中共報(bào)道ATP 7 A基因的致病性變異約379 種，其中369 種變異與MD相關(guān)，錯(cuò)義變異約占32%，小的缺失、插入或重復(fù)變異約占22%，這些變異理論上導(dǎo)致截短蛋白的產(chǎn)生。目前的研究指出，最常見的變異類型為缺失和插入變異[16]。文獻(xiàn)報(bào)道約2/3的MD患兒為遺傳性變異，1/3為新發(fā)變異[17]，本研究的2例患兒均為新發(fā)變異。

目前MD早期可能有非特異性表型，血生化指標(biāo)的特異度不高，并且缺乏有效的治療手段，大多數(shù)未經(jīng)治療的患者在3 歲之前死亡，治療成功率取決于開始治療的時(shí)間和ATP 7 A基因變異的嚴(yán)重程度[18]，所以早期診斷和治療尤為關(guān)鍵。基因分析是檢測(cè)ATP7A變異的有效方法，國(guó)內(nèi)積累的病例尚不能提供我國(guó)MD患兒ATP7A基因變異熱點(diǎn)，不斷豐富我國(guó)ATP7A基因的變異譜可為深入研究疾病的發(fā)病機(jī)制，探尋新的治療方案提供理論基礎(chǔ)。