葡萄NF-Y核因子家族的鑒定與表達(dá)分析

馬維峰，韓愛(ài)民，乃國(guó)潔，李艷梅，李彥彪，毛 娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，蘭州 730070)

20世紀(jì)90年代以來(lái)，農(nóng)業(yè)節(jié)水生物技術(shù)領(lǐng)域的研究工作集中在模式植物擬南芥上，也通過(guò)基因轉(zhuǎn)移和重組，獲得了小麥(Triticumaestivum)[1]、玉米(Zeamays)[2]和水稻(Oryzasativa)[3]的耐旱性材料，但葡萄的耐旱基因工程還鮮有報(bào)道，而核因子Y (nuclear factor Y， NF-Y)就是其研究的熱點(diǎn)基因。目前，NF-Y已在多個(gè)物種中進(jìn)行了成員鑒定和功能驗(yàn)證，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[4]、水稻[5]、小麥[6]、胡桃(Juglansregia)[7]、香蕉(Musanana)[8]、桃(Prunuspersica)[9]、高粱(Sorghumbicolor)[10]等大量植物上。核因子又稱(chēng)作反式作用因子(Trans-acting factor)和轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TF)，是一組能夠與順式作用元件(啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等)發(fā)生特異性結(jié)合[11]，通過(guò)它們之間以及其他相關(guān)蛋白之間的相互作用，參與調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，并使之以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間和空間表達(dá)的結(jié)合蛋白，在植物光合作用，開(kāi)花調(diào)控和逆境脅迫的響應(yīng)等方面具有重要作用[12]。

NF-Y是由 NF-YA(又稱(chēng) CBF-B 或 HAP2)、NF-YB(又稱(chēng) CBF-A 或 HAP3)和 NF-YC(又稱(chēng) CBF-C 或 HAP5)組成的異源三聚體[13]，并與 CCAAT-box結(jié)合(25%真核生物基因的啟動(dòng)子區(qū)都含的一種順式作用元件)。NF-YA和NF-YC亞基包含一個(gè)富含谷氨酸的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)疏水殘基，對(duì)轉(zhuǎn)錄激活性起到重要作用[14]。在動(dòng)物和酵母中，每個(gè) NF-Y 亞基都是由單拷貝基因編碼的，而在植物擬南芥整個(gè)基因組中有10個(gè) NF-YA 編碼基因，13個(gè)NF-YB 編碼基因和13個(gè)NF-YC編碼基因[15]。Donald等[2]研究表明在擬南芥和玉米中過(guò)表達(dá)NF-YB1可以顯著地提高植株的抗旱性，在干旱條件下獲得顯著高于對(duì)照的產(chǎn)量。對(duì)擬南芥NF-YA5核因子的研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫和脫落酸(ABA)處理下NF-YA5被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)表達(dá)NF-YA5的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株比正常的野生型表現(xiàn)出葉片水分損失量少，對(duì)干旱的抗性顯著增強(qiáng)等特性。并且發(fā)現(xiàn)NF-YA5序列上存在一個(gè)microRNA(miR169)的靶位點(diǎn)，而 miR169的表達(dá)受干旱抑制[16]。與許多植物基因家族一樣，NF-Y基因家族的結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了許多基因重復(fù)，導(dǎo)致一組緊密相關(guān)的同源基因，這些同源基因可能具有重疊的表達(dá)模式，或者可能已經(jīng)經(jīng)歷了亞功能化，呈現(xiàn)特定的組織發(fā)育相關(guān)表達(dá)模式。

本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法和熒光定量PCR，對(duì)葡萄NF-Y家族的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析研究。初步探索該基因在葡萄逆境脅迫中的表達(dá)特點(diǎn)和響應(yīng)機(jī)制規(guī)律，為葡萄NF-Y的功能驗(yàn)證提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

以甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院保存的‘黑比諾’(VitisviniferaL. cv.‘Pinot Noir’)試管苗為試驗(yàn)材料，配制MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0，將試驗(yàn)材料的單芽莖段進(jìn)行繼代培養(yǎng)，采用紙橋法進(jìn)行固定，光照16 h，溫度25 ℃，黑暗8 h，溫度為 20 ℃，放置在LED白光下繼代培養(yǎng)30 d后選擇生長(zhǎng)一致且無(wú)污染的葡萄試管苗，用無(wú)菌注射器吸出原培養(yǎng)基后分別加入50 mL含有10%PEG、500 μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1NaCl的MS液體培養(yǎng)基進(jìn)行處理，每組處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，對(duì)照為等體積蒸餾水處理，對(duì)照與PEG、ABA、NaCl處理時(shí)長(zhǎng)為24 h。試驗(yàn)于2019年3月-7月于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹(shù)生理與生物技術(shù)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 葡萄NF-Y轉(zhuǎn)錄家族序列數(shù)據(jù)獲得

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)TAIR(https://www.arabidopsis.org)下載擬南芥NF-Y核因子的氨基酸序列，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)同源基因比對(duì)，共搜索到40個(gè)葡萄NF-Y家族成員，分別下載基因的全長(zhǎng)，CDS序列，氨基酸序列以及cDNA序列，并對(duì)基因全長(zhǎng)與CDS的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)NF-Y基因家族特定的結(jié)構(gòu)區(qū)域，利用在線網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)和Pfam進(jìn)行保守域預(yù)測(cè)，刪除其結(jié)構(gòu)域缺失或不完整的序列片段。

1.3 葡萄NF-Y轉(zhuǎn)錄因子家族理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)(https://web.expasy.org/protparam/)中的ProParam工具進(jìn)行蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)、氨基酸個(gè)數(shù)、分子量的統(tǒng)計(jì)。利用Predict Protein(https://www.predictprotein.org)在線分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用WOLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)在線分析葡萄NF-Y基因家族的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。使用MEGE 7.0軟件構(gòu)建NF-Y轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 葡萄NF-Y轉(zhuǎn)錄因子家族motif、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和多序列比對(duì)

利用MEME(http://meme-suite.org/)在線程序分析葡萄NF-Y轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序，預(yù)測(cè)基序的數(shù)量設(shè)置為10個(gè)；在線軟件GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；使用DNAMAN進(jìn)行結(jié)構(gòu)域序列多重比對(duì)，利用TBtools進(jìn)行染色體定位及共線性分析。

1.5 熒光定量 PCR 分析

將葡萄 NF-Y家族基因的 CDS 序列進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)(表1)[生工生物工程(上海)股份有限公司網(wǎng)站]，將設(shè)計(jì)好的引物交由該公司完成。cDNA用 Prime Script RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa，日本)并按其說(shuō)明進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在-20 ℃下保存?zhèn)溆?。?shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR)用 Light Cycler○R96 Real-Time PCR System(Roche，瑞士)實(shí)時(shí)定量 PCR 儀，用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以葡萄GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)葡萄NF-Y基因家族進(jìn)行特異性表達(dá)分析。擴(kuò)增體系含為20 μL，分別含cDNA 3 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR MIX 10 μL，ddH2O 5.4 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s共40個(gè)循環(huán)，3 次重復(fù)。

表1 葡萄NF-Y表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量引物Table 1 qRT-PCR primers for expression analysis of NF-Y in grape

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2010和SPSS 23軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用TBtools v1.0692和Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄NF-Y家族成員理化性質(zhì)分析

利用擬南芥核因子序列在葡萄基因組網(wǎng)中搜索，通過(guò)同源比對(duì)檢索鑒定出的VvNF-Y家族核因子分為VvNF-YA、VvNF-YB和VvNF-YC三個(gè)亞族，其中VvNF-YA包含5個(gè)核因子，命名為VvNF-YA1～VvNF-YA5，VvNF-YB包含13個(gè)核因子，命名為VvNF-YB1～VvNF-YB13，VvNF-YC包含6個(gè)核因子，命名為VvNF-YC1～VvNF-YC6。由表2可知，葡萄NF-Y核因子家族氨基酸大小為132～345 aa，VvNF-YA1氨基酸序列最長(zhǎng)，VvNF-YB7的氨基酸序列最短。分子質(zhì)量集中在14.56～37.70 ku。等電點(diǎn)集中在4.62～9.83，其中VvNF-YB10的等電點(diǎn)最低，VvNF-YC6的等電點(diǎn)最高。

表2 葡萄 NF-Y家族核因子蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of NF-Y nuclear factor family in grape

2.2 葡萄NF-Y家族成員亞細(xì)胞定位和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

亞細(xì)胞定位分析顯示葡萄24個(gè)NF-Y基因均定位于細(xì)胞核(表3)，且集中表達(dá)于細(xì)胞核與葉綠體中，而在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中有少量表達(dá)，此外過(guò)氧化物酶體中只有VvNF-YB6表達(dá)。另外5個(gè)蛋白 VvNF-YB2、VvNF-YA1、VvNF-YB4、VvNF-YA2、VvNF-YA4的最大積分值均為13；7個(gè)蛋白VvNF-YB3、 VvNF-YA3、VvNF-YB5、VvNF-YB6、VvNF-YB9、 VvNF-YB11、VvNF-YA5的最大積分值均為14；VvNF-YC4的最大積分值為7；VvNF-YC3的最大積分值為3，該14個(gè)蛋白均定位于細(xì)胞核中，其中VvNF-YC3的最大積分值也出現(xiàn)于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。6個(gè)蛋白VvNF-YC2、VvNF-YB7、VvNF-YB8、 VvNF-YB10、VvNF-YB12和VvNF-YC6的最大積分值分別為5.5、7、7、4、9和7，均定位于線粒體中，其中 VvNF-YB10的最大積分值也出現(xiàn)于葉綠體中。2個(gè)蛋白VvNF-YC2和VvNF-YB13最大積分值分別為7和5，定位于細(xì)胞質(zhì)中。VvNF-YB1和VvNF-YC5的最大積分值分別為6和5.5，分別定位于胞外和細(xì)胞膜中。

表3 葡萄 NF-Y 核因子亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 3 Subcellular location prediction of NF-Y in grape

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和不規(guī)則卷曲構(gòu)成，通過(guò)EXPASy提供的在線SOPMA程序?qū)ζ咸袾F-Y核因子家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析得出(表4)，24個(gè)NF-Y蛋白主要以α-螺旋(Alpha helix)(13.04%～66.91%)、β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)(0.95%～8.42%)和不規(guī)則卷曲(Random coil)(20.15%～ 77.68%)3種結(jié)構(gòu)構(gòu)成。其中A亞族α-螺旋占 13.04%～29.12%，β-轉(zhuǎn)角占2.03%～7.08%，不規(guī)則卷曲占54.95%～77.68%；B亞族α-螺旋占35.35%～63.96%，β-轉(zhuǎn)角占0.95%～8.37%，不規(guī)則卷曲占24.87%～57.82%；C亞族α-螺旋占42.31%～66.91%，β-轉(zhuǎn)角占1.65%～8.42%，不規(guī)則卷曲占20.15%～52.20%。可見(jiàn)，VvNF-YB和VvNF-YC亞族α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲所占比例相近，但遠(yuǎn)高于VvNF-YA亞族。

表4 葡萄NF-Y蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 4 Secondary structure of NF-Y protein sequence in grape

2.3 葡萄NF-Y核因子家族進(jìn)化分析

為進(jìn)一步了解VvNF-Y核因子家族的進(jìn)化特性，利用葡萄、擬南芥和水稻共94個(gè)NF-Y核因子蛋白序列構(gòu)建NF-Y核因子家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)，可見(jiàn)葡萄NF-Y核因子與擬南芥NF-Y核因子同源性較高，與水稻NF-Y核因子同源性較低。94個(gè)成員可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3個(gè)亞族，分別包含38、30和26個(gè)核因子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)NF-YA亞族核因子全部分布于第Ⅰ亞族中，NF-YC亞族核因子全部分布于第Ⅱ亞族中，NF-YB亞族核因子全部分布于第Ⅲ亞族中。此外Ⅰ亞族中包含1對(duì)直系同源核因子和7對(duì)旁系同源核因子，Ⅱ亞族中含有2對(duì)直系同源核因子和9對(duì)旁系同源核因子，Ⅲ亞族中含有7對(duì)直系同源核因子和1對(duì)旁系同源核因子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)葡萄NF-Y蛋白序列單獨(dú)聚類(lèi)形成的進(jìn)化樹(shù)與此相一致，也分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3個(gè)亞族(圖2)。

2.4 葡萄NF-Y核因子家族保守結(jié)構(gòu)域特征和基因結(jié)構(gòu)分析

葡萄NF-Y基因的結(jié)構(gòu)分析表明，24個(gè)NF-Y核因子的結(jié)構(gòu)差異明顯，如圖2-A所示，其所含內(nèi)含子數(shù)0～5，外顯子數(shù)1～6。第Ⅰ亞族中NF-YB6和NF-YB8外顯子數(shù)最多，均為5個(gè)，NF-YB5、NF-YB7、NF-YB9和NF-YB11等4個(gè)核因子內(nèi)含子數(shù)目最少，均為1個(gè)。且NF-YB1、NF-YB7、NF-YB9和NF-YB11均不含上下游編碼區(qū)。第Ⅱ亞族中VvNF-YA1和VvNF-YA5內(nèi)含子和外顯子數(shù)目相同，分別有4個(gè)、5個(gè)，VvNF-YA3和VvNF-YA4內(nèi)含子和外顯子數(shù)目相同，分別有3個(gè)、4個(gè)，VvNF-YA2只有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子。第Ⅲ亞族中VvNF-YC3和VvNF-YC6外顯子數(shù)目相近，二者具有相似性，而VvNF-YC1只有1個(gè)外顯子，沒(méi)有下游編碼區(qū)，與VvNF-YC2和VvNF-YC3差異較大。另外VvNF-YC2外顯子最多，有6個(gè)，VvNF-YC4外顯子最少，僅有1個(gè)。

葡萄NF-Y家族蛋白含有10個(gè)保守基序(圖2-B)，每個(gè)基序含有14～54個(gè)氨基酸(表5)，其中Motif1、Motif3、Motif5和Motif6都包含54個(gè)氨基酸，Motif7最少，為14個(gè)。24個(gè)NF-Y中NF-YB5、NF-YB9和NF-YB11所具有最多的Motif，為5個(gè)，而NF-YA3、NF-YA5和NF-YB13只有1個(gè)Motif，此外，分析發(fā)現(xiàn)保守基序Motif1具有較高的保守性。

表5 葡萄NF-Y蛋白氨基酸保守序列Table 5 Conserved motifs of NF-Y proteins in grape

2.5 葡萄 NF-Y 家族基因的染色體定位及共線性分析

從葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載NF-Y基因家族成員的位置和該基因所在染色體的全長(zhǎng)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)VvNF-YA5、VvNF-YB11～VvNF-YB13和VvNF-YC5～VvNF-YC6這6個(gè)基因位于未知染色體上。將VvNF-Y的24個(gè)基因利用TBtools繪制NF-Y 家族基因在染色體上的分布圖。由圖3可知，葡萄24條NF-Y基因分別位于12條染色體和未知染色體上，較為分散。其中未知染色體上分布有6個(gè)，6號(hào)和19號(hào)染色體上各分布3個(gè)，1號(hào)、5號(hào)和13號(hào)染色體各分布2個(gè)基因。7、8、9、12、14和17號(hào)染色體各分布1個(gè)，且除12號(hào)染色體和未知染色體外，NF-Y基因都位于染色體末端，而其余染色體則沒(méi)有NF-Y分布。

為進(jìn)一步了解VvNF-Y基因家族的進(jìn)化作用力，從在線網(wǎng)站(http://tools.bat.infspire.org/circoletto/)分析出identity>75%的8對(duì)葡萄NF-Y基因?qū)?圖3)進(jìn)行同義突變頻率(Ka)及非同義突變頻率(Ks)值的計(jì)算，并獲得葡萄基因的突變頻率比值(Ka/Ks)(表6)。8對(duì)基因的Ka均小于1；VvNF-YB5和VvNF-YB11的Ks最大，為50.925 1，VvNF-YA2和VvNF-YA4最小，為0.074 6。另外，Ka/Ks對(duì)基因的進(jìn)化選擇有重要的指導(dǎo)作用：Ka/Ks>1，認(rèn)為受到正向選擇作用；Ka/Ks=1，認(rèn)為受到中性選擇作用； Ka/Ks<1，則認(rèn)為受到純化選擇作用。本研究中所有基因?qū)Φ腒a/Ks均小于0.5，認(rèn)為基因?qū)χg存在純化選擇作用。

表6 葡萄NF-Y同源核因子Ka/Ks分析Table 6 Ka/Ks analysis of VvNF-Ys homologous nuclear factor

2.6 葡萄NF-Y家族基因多序列比對(duì)分析

為了進(jìn)一步研究VvNF-Y基因家族成員的保守區(qū)，利用DNAMAN 軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)VvNF-Y的3個(gè)亞族均含有保守區(qū)(圖4)。VvNF-YA蛋白含有1個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA Binding)和1個(gè)NF-YB/YC亞基互作結(jié)構(gòu)域(NF-YB/YC Interaction)；VvNF-YB蛋白包含1個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、1個(gè)NF-YA亞基互作結(jié)構(gòu)域(NF-YA Interaction)和2個(gè)NF- YC亞基互作結(jié)構(gòu)域(NF-YC Interaction)；VvNF-YC蛋白具有1個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、2個(gè)NF- YA亞基互作結(jié)構(gòu)域(NF- YA Interaction)和1個(gè)NF-YB亞基互作結(jié)構(gòu)域(NF-YB Interaction)。

2.7 葡萄NF-Y家族基因順式作用元件分析

本研究利用在線軟件PlantCARE分析了葡萄NF-Y起始密碼子上游2 000 bp的堿基序列，并利用TBtools繪制順式作用元件圖(圖5)。在葡萄NF-Y基因家族中鑒定出大量光響應(yīng)元件如G-Box、Box 4和MRE；多種激素反應(yīng)元件，包括脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、生長(zhǎng)素(AuxRE和TGA-element)、赤霉素(P-box)和茉莉酸甲酯(CGTCA-motif和TGACG-motif)；多種響應(yīng)環(huán)境信號(hào)元件，如防御與脅迫(TC-rich repeats)、厭氧誘導(dǎo)(ARE)、低溫(LTR)和干旱誘導(dǎo)(MBS)以及水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)，由此可知其表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。

2.8 葡萄NF-Y核因子家族qRT-PCR分析

qRT-PCR 結(jié)果顯示，當(dāng)VvNF-Y基因家族受到500 μmol·L-1ABA、10% PEG和200 mmol·L-1NaCl的誘導(dǎo)時(shí)，VvNF-YA、VvNF-YB和VvNF-YC亞族基因的相對(duì)表達(dá)量差異顯著(圖6)。當(dāng)受到500 μmol·L-1ABA和200 mmol·L-1NaCl處理時(shí)，VvNF-YA亞族和VvNF-YC亞族基因中各有1個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，分別是VvNF-YA2和VvNF-YC3，尤其VvNF-YC3在500 μmol·L-1ABA處理的條件下其表達(dá)量顯著上調(diào)，為CK的3.31倍，而在VvNF-YB亞族中有VvNF-YB3和VvNF-YB4表達(dá)量顯著上調(diào)，其余各VvNF-Y家族基因表達(dá)量顯著下調(diào)；在10% PEG條件下，VvNF-YA亞族和VvNF-YB亞族中各有2個(gè)基因呈上調(diào)表達(dá)，分別是VvNF-YA1、VvNF-YA2和VvNF-YB3、VvNF-YB4，尤其VvNF-YB3基因的表達(dá)量與對(duì)照相比呈顯著上調(diào)，為對(duì)照的3.50倍，其余VvNF-YA亞族和VvNF-YB亞族基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，而在VvNF-YC亞族基因中僅VvNF-YC3基因顯著上調(diào)，為對(duì)照的5.60倍，其余VvNF-YC亞族基因表達(dá)量均顯著下調(diào)。

3 討論與結(jié)論

NF-Y是NF-YA、NF-YB和NF-YC三個(gè)獨(dú)特亞族成員組成的結(jié)合于啟動(dòng)子CCAAT上的異源三聚體蛋白復(fù)合物，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出重要作用[17]。本研究從葡萄全基因組中鑒定出24個(gè)葡萄NF-Y基因家族成員，這與33個(gè)毛竹(Phyllostachysedulis)[18]和24個(gè)胡桃(Juglansregia)[7]NF-Y家族成員的數(shù)量相近，說(shuō)明通過(guò)Blast比對(duì)進(jìn)行基因篩選和MEME結(jié)構(gòu)域缺失或不完整基因的剔除條件較為合理，從而得到的葡萄NF-Y家族成員是可信的。

鑒定出的24個(gè)VvNF-Y家族成員中有5個(gè)VvNF-YA、13個(gè)VvNF-YB和6個(gè)VvNF-YC亞族成員?；蚨ㄎ话l(fā)現(xiàn)24個(gè)VvNF-Y主要定位于細(xì)胞核中，部分基因也定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，可見(jiàn)VvNF-Y核因子主要在細(xì)胞核中行使其功能。部分基因也可能在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中少量表達(dá)。此外葡萄NF-Y核因子家族氨基酸大小在132～345 aa之間，相對(duì)分子質(zhì)量集中在14.56～37.70 ku，等電點(diǎn)為4.62～9.83，這與Mai等[19]的試驗(yàn)結(jié)果相似，而在鷹嘴豆(Cicerarietinum)[20]和西瓜(Citrulluslanatus)[21]中NF-Y家族氨基酸殘基相對(duì)較多，相應(yīng)分子量也較葡萄NF-Y核因子家族大，但等電點(diǎn)范圍相近。系統(tǒng)同進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)葡萄NF-Y可歸為3個(gè)亞族(VvNF-YA1～5、VvNF-YB1～13和VvNF-YC1～6)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)成員關(guān)系較近的基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)：葡萄NF-Y基因內(nèi)含子數(shù)量少，尤其N(xiāo)F-YB5、NF-YB9、NF-YB11和NF-YC1不含內(nèi)含子，NF-YB1、NF-YB4、NF-YB7、NF-YB10、NF-YB12和NF-YA2僅具有1個(gè)內(nèi)含子，這可能是由于葡萄NF-Y基因在進(jìn)化過(guò)程中大量?jī)?nèi)含子丟失，基因結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，加速CCAAT-box的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)基因的表達(dá)有關(guān)[22-23]。

Malviya等[10]將高粱NF-Y基因家族的33個(gè)基因歸為3個(gè)亞族，且進(jìn)化距離較近的基因其結(jié)構(gòu)也越為相似，其含有少量甚至不含內(nèi)含子，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似，在桃[9]和茶樹(shù)(Camelliasinensis)[24]NF-Y基因家族生物信息學(xué)分析中也有類(lèi)似的結(jié)果。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)VvNF-Y具有NF-Y家族成員的典型特征[25]，具體表現(xiàn)為VvNF-YA、VvNF-YB和VvNF-YC蛋白均含有1個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，不同的是VvNF-YA含有1個(gè)NF-YB/YC亞基互作結(jié)構(gòu)域，VvNF-YB蛋白含有1個(gè)NF-YA亞基互作結(jié)構(gòu)域(NF-YA Interaction)和2個(gè)NF- YC亞基互作結(jié)構(gòu)域(NF- YC Interaction)，VvNF-YC蛋白具有1個(gè)NF-YB亞基互作結(jié)構(gòu)域(NF-YB Interaction)和2個(gè)NF- YA亞基互作結(jié)構(gòu)域(NF- YA Interaction)，這與滕露等[20]和Li等[9]的研究結(jié)果一致，但Yan等[8]研究發(fā)現(xiàn)香蕉NF-YB亞族基因只含有一個(gè)NF-YC亞基互作結(jié)構(gòu)域，這與本試驗(yàn)中VvNF-YB蛋白具有2個(gè)NF- YC亞基互作結(jié)構(gòu)域的結(jié)果有一定的差異。

大量研究表明植物響應(yīng)非生物脅迫是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式作用元件進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[26-27]，因此本試驗(yàn)對(duì)VvNF-Y家族基因上游 2 000 bp區(qū)域的啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行了深入分析，發(fā)現(xiàn)葡萄NF-Y基因家族具有大量G-Box、Box 4和MRE等光響應(yīng)元件、脫落酸(ABRE)、生長(zhǎng)素(AuxRE和TGA-element)和赤霉素(P-box)等激素響應(yīng)元件和厭氧誘導(dǎo)(ARE)、低溫(LTR)和干旱(MBS)等逆境信號(hào)響應(yīng)元件，推測(cè)該核因子表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，如VvNF-YA2、VvNF-YB3、VvNF-YB4和VvNF-YC3均包含ABRE和MBS作用元件，表現(xiàn)出VvNF-Y核因子家族多個(gè)基因均參與了抗旱響應(yīng)，而且在其他非生物脅迫中也具有重要作用，這已在前人的研究中得到證實(shí)，如在谷子[28]中具有抗旱作用元件的SiNF-YA1可增強(qiáng)植株的耐旱性和耐鹽性；水稻中NF-Y基因參與了葉綠體的形成，其可抑制水稻hap3基因的表達(dá)從而降低光合作用，而且OsNF-YA10基因的表達(dá)也會(huì)受干旱和鹽脅迫的影響[29-30]，擬南芥中也發(fā)現(xiàn)NF-YA5與多個(gè)下游抗旱抗逆基因表達(dá)相關(guān)[2]。

此外，qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)VvNF-YA2、VvNF-YB3、VvNF-YB4和VvNF-YC3在500 μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1NaCl和10% PEG處理下表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達(dá)，VvNF-YA1在10% PEG處理下也會(huì)顯著上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該NF-Y核因子在受到激素、干旱和鹽脅迫時(shí)具有一定的調(diào)節(jié)作用，這與前人的報(bào)道NF-Y具備多種生物學(xué)功能的研究結(jié)果相符，如水稻轉(zhuǎn)錄因子OsHAP2E不僅能增加水稻分孽數(shù)和光合作用，還能提高對(duì)鹽、干旱和病原菌等逆境抗性[31]，擬南芥AtNF-YA2和AtNF-YA10可提高植株對(duì)逆境的抗性[32]，毛果楊(P.trichocarpa)PtNF-YA9在其苗期的過(guò)表達(dá)能夠提高其耐鹽性和抗旱性[33]。近年來(lái)，通過(guò)促進(jìn)核因子的表達(dá)來(lái)提高植物抗旱性也在水稻、煙草(Nicotianatabacum)等植物中都得到證實(shí)[34-37]。

綜上可知，葡萄NF-Y核因子進(jìn)化過(guò)程較為保守，且部分NF-Y基因?qū)BA、PEG和鹽害等非生物逆境脅迫響應(yīng)明顯，為進(jìn)一步研究葡萄NF-Y核因子在非生物脅迫下的功能提供了 參考。