146份甘藍(lán)型油菜種質(zhì)芽期耐鹽性篩選及評價

李 萍，燕佳琦，張 鶴，張 燕，陶順仙，張 琪，，徐愛遐，黃 鎮(zhèn)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

鹽害是危害國家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一，據(jù)統(tǒng)計，全球約20%的耕地受到鹽漬影響，導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降，農(nóng)作物產(chǎn)品質(zhì)量受到影響[1-2]。植物在鹽害條件下生存和完成整個生命周期的能力取決于其耐鹽性，耐鹽性隨物種和生長期的不同而變化[3-4]。因此，利用鹽堿土的最有效方法是篩選和種植耐鹽作物[5]。油菜作為重要的油料作物，不僅它本身具有多種用途，并且種植油菜后的土壤有機(jī)質(zhì)增加，能有效改良鹽堿地土壤，具有極大的種植潛力[6]。因此，對現(xiàn)有的油菜種質(zhì)資源開展耐鹽性鑒定，篩選出一批耐鹽性強(qiáng)的種質(zhì)，并在生產(chǎn)上加以利用，對實(shí)現(xiàn)鹽堿地的農(nóng)業(yè)高效利用，提升中國耕地的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)能力具有重要意義[7]。

研究表明，鹽分主要通過滲透脅迫和離子毒害等方式改變植物的細(xì)胞膜透性，造成氧化脅迫和代謝紊亂等現(xiàn)象，從而影響植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育、光合作用和呼吸作用等[8-9]。植物耐鹽性體現(xiàn)于不同生育階段，芽期是植物形態(tài)建成的最早時期，是對鹽脅迫最敏感的時期之一[10]。因此，在大規(guī)模篩選耐鹽的優(yōu)良種質(zhì)時，可以選擇芽期作為快速評價種子耐鹽能力的重要時期。但是，對于不同物種來說，其萌發(fā)期的耐鹽性評價指標(biāo)和方法各不相同，目前已經(jīng)對小麥[11]、水稻[12]、花生[13]和大豆[14]等多種作物開展了耐鹽性篩選鑒定。田蕾等[15]發(fā)現(xiàn)水稻芽期對鹽脅迫較為敏感，同時利用逐步回歸和主成分分析獲得3個重要指標(biāo)(發(fā)芽指數(shù)、相對根長和相對鹽害率)，并構(gòu)建了水稻芽期耐鹽性評價模型，可以作為預(yù)測和鑒定粳稻發(fā)芽期的耐鹽性的有效方法。孫璐等[16]利用42個高粱品種確定根長、鮮質(zhì)量和發(fā)芽率可以作為大批量鑒定高粱品種耐鹽性的指標(biāo)，并在此基礎(chǔ)上獲得5份高度耐鹽高粱品種。Adjel等[17]以12份大麥品種為材料進(jìn)行芽期和幼苗期耐鹽鑒定，發(fā)現(xiàn)在發(fā)芽階段，根長和發(fā)芽率最能區(qū)分敏鹽和耐鹽品種之間的差異，而在幼苗生長階段，芽鮮質(zhì)量的K+，Na+和K+/Na+比率是區(qū)別不同品種耐鹽能力的指標(biāo)。盡管國內(nèi)外已開展了關(guān)于作物耐鹽性的鑒定與研究，但對于油菜發(fā)芽期耐鹽性鑒定和品種篩選研究較少。龍衛(wèi)華等[18]采用梯度濃度中性鹽脅迫15個不同遺傳背景的甘藍(lán)型油菜自交系，提出214mmol·L-1鹽為鑒定油菜品系耐鹽性的最適濃度，根長和莖長可以作為評價油菜耐鹽性的早期評價指標(biāo)，并得到了2份最耐鹽品系和1份鹽敏感品系?；M林等[19]在油菜種子萌發(fā)期鑒定了15份春油菜種質(zhì)的耐鹽性，提出春油菜耐鹽種質(zhì)篩選及評價研究的最佳鹽質(zhì)量濃度(10g/L)，但沒有提出有效的篩選指標(biāo)，且研究的種質(zhì)資源較少，具有一定的局限性。綜合來看，從大量的油菜種質(zhì)資源中快速有效地篩選出可利用的耐鹽材料，目前還沒有可靠有效的評價體系和篩選方法。

本研究以146份甘藍(lán)型油菜品系為研究材料，在油菜發(fā)芽期進(jìn)行鹽脅迫處理，調(diào)查相關(guān)的形態(tài)指標(biāo)，運(yùn)用主成分、隸屬函數(shù)法、聚類分析等不同評價方法，對油菜種質(zhì)發(fā)芽期耐鹽特性進(jìn)行綜合評價，以期篩選出油菜發(fā)芽期耐鹽性強(qiáng)的材料，為鹽堿地區(qū)油菜的耐鹽優(yōu)異資源發(fā)掘和新品種培育提供理論支撐及材料來源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

146 份油菜種質(zhì)資源均為甘藍(lán)型油菜，它們來源或系譜明確，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳變異豐富，種子均由西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜課題組提供(表1)。

表1 鹽脅迫下146 份油菜材料的ASF值和CEI值排名Table 1 ASF value and CEI value sequence of 146 rapeseed germplasms under salt stress

(續(xù)表1 Continued table 1)

1.2 確定適宜的鹽脅迫濃度

以遺傳背景不同的6 份油菜種質(zhì)為材料(827、1006、1106、1164、1296、1583)，挑選大小均勻的油菜種子，設(shè)置6個鹽濃度，分別為0、100、150、200、250、300 mmol·L-1，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)用種50 粒。種子消毒處理并用蒸餾水清洗后放入直徑90 mm玻璃培養(yǎng)皿中，加入 7.5 mL的鹽溶液，并將其置于相對濕度為54%，溫度為25 ℃(16 h 光照/8 h 黑暗)的油菜生長室。第3 天記錄發(fā)芽種子數(shù)，第7 天調(diào)查發(fā)芽率，第8 天從每重復(fù)中隨機(jī)選取10 株幼苗，測量胚根長和胚芽長，發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)為胚根長度≥種子長度的一半。

1.3 油菜芽期耐鹽種質(zhì)的篩選

試驗(yàn)組加入230 mmol·L-1鹽溶液，對照組加入等量蒸餾水，設(shè)置3 個重復(fù)，每個重復(fù)用種50 粒，重復(fù)“1.2”的方法調(diào)查相關(guān)指標(biāo)。

發(fā)芽勢=3 d發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽率=7 d正常苗數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽相對鹽害率=(對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率×100%；

相對根長=處理根長/對照根長×100%；

相對芽長=處理芽長/對照芽長×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013 和IBM.SPSS Statistics 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。參照張會麗等[20]的方法，利用公式(1)(2)(3)計算各份材料單項指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和平均隸屬函數(shù)值；參照劉丙花等[21]的方法，利用公式(4)(5)計算各個綜合指標(biāo)的權(quán)重(Wj)和油菜耐鹽綜合評價值(CEIj)。利用系統(tǒng)聚類法，將各個發(fā)芽指標(biāo)以歐式距離作為油菜種質(zhì)間距離進(jìn)行聚類分析，建立種質(zhì)資源聚類樹狀圖。

正項指標(biāo)隸屬函數(shù)值U(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)，i=1，2，3，…，m；j=1，2，3，…，n

(1)

負(fù)項指標(biāo)隸屬函數(shù)值U(Xij)=(Xmax-Xij)/(Xmax-Xmin) ，i=1，2， 3，…，m；j=1，2，3，…，n

(2)

(3)

(4)

(5)

式(1)(2)中，Xij表示第i份材料第j個指標(biāo)的實(shí)測值，Xjmax為第j個指標(biāo)的最大值，Xjmin為第j個指標(biāo)的最小值。當(dāng)耐鹽指標(biāo)與種質(zhì)耐鹽能力呈正相關(guān)，用公式(1)；而對于相對鹽害指數(shù)來說，該指標(biāo)與耐鹽能力呈負(fù)相關(guān)，則用公式(2)。公式(3)中，Uj表示每份材料的第j個指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。式(4)中，Wj表示第j個綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的權(quán)重；Pj表示經(jīng)主成分分析所得到各材料第j個綜合指標(biāo)的方差貢獻(xiàn)率，k為選取的主成分個數(shù)。式(5)中，Zj表示各個主成分的得分值。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選油菜耐鹽種質(zhì)的適宜鹽濃度

為了確定芽期耐鹽篩選的適宜鹽濃度，挑選 6 份遺傳背景不同的材料在不同的鹽濃度下進(jìn)行處理。由表2、表3可知，低濃度(100 mmol·L-1) 下，6份材料發(fā)芽勢和發(fā)芽率較對照差異均未達(dá)到顯著，高濃度(300 mmol·L-1)時，僅有個別種子發(fā)芽，說明高濃度鹽脅迫顯著降低種子的發(fā)芽速度。鹽濃度為 200 mmol·L-1時，材料1164、1583的種子發(fā)芽率較對照比差異不顯著，材料1296、827、1106和1006與對照差異顯著，鹽濃度為 250 mmol·L-1時，6份材料與對照相比，種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率差異均達(dá)到顯著水平，說明鹽濃度為200～250 mmol·L-1可以有效區(qū)分各品系的耐鹽能力。隨后對該濃度區(qū)間進(jìn)行細(xì)化(0、200、210、220、230、240和250 mmol·L-1)，由圖1看出，在 230 mmol·L-1鹽濃度下，各份材料的萌發(fā)差異較大，可有效區(qū)分各份材料間的耐鹽差異，因此，本研究選用 230 mmol·L-1作為篩選油菜耐鹽種質(zhì)的適宜處理濃度。

表2 不同鹽濃度脅迫下6 份材料的發(fā)芽勢Table 2 Germination vigor of six materials under stress of different concentrations of salt %

表3 不同鹽濃度脅迫下6 份材料的發(fā)芽率Table 3 Germination rate of six materials under stress of different concentrations of salt %

2.2 油菜芽期耐鹽指標(biāo)的變異分析

在230 mmol·L-1鹽脅迫下，146 份油菜種質(zhì)的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、相對鹽害率、根長與芽長差異性較大，變異系數(shù)分別為136%、107%、20%、48%、77%、75% 和81%(表4)。這表明參試油菜材料耐鹽相關(guān)性狀變異豐富，性狀指標(biāo)存在較大差異，可以指示品種的耐鹽性，用于油菜種質(zhì)的耐鹽性鑒定。其中有4 份種質(zhì)未發(fā)芽，相對鹽害率達(dá)到100%。有4 份種質(zhì)發(fā)芽率達(dá)70% 以上，對鹽脅迫的抗性能力較強(qiáng)。綜合來看，種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率集中在20% 以下，芽期相對鹽害率主要分布在80% 以上，芽長和根長小于0.2 cm的種質(zhì)分別占21.2% 和37.0%(圖2)，說明鹽脅迫嚴(yán)重抑制根和芽的生長和發(fā)育。

表4 230 mmol·L-1 鹽脅迫下油菜各發(fā)芽指標(biāo)的變異分析Table 4 Variation analysis of all germination indexes of rapeseed under 230 mmol·L-1NaCl

2.3 鹽脅迫下油菜各指標(biāo)的相關(guān)性分析

發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、芽長、相對根長和相對芽長中，任意兩個指標(biāo)之間均呈極顯著正相關(guān)，其中發(fā)芽勢與發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)最大為 0.967，而發(fā)芽率與相對芽長的相關(guān)系數(shù)最小為 0.358；發(fā)芽相對鹽害率與發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、芽長、相對根長和相對芽長呈極顯著負(fù)相關(guān)，其中與發(fā)芽勢、發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)較大，分別為 -0.967 和 -1.00(表5)。因此，鹽脅迫下油菜各指標(biāo)之間存在不同程度的相關(guān)性。

表5 230 mmol·L-1 鹽脅迫下油菜各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of all germination indexes of rapeseed under salt stress of 230 mmol·L-1

2.4 主成分分析

為確定篩選油菜芽期耐鹽性的主要指標(biāo)，對 146份自然群體的 7個性狀進(jìn)行主成分分析(表6)。通過主成分分析，根據(jù)各主成分的特征值和貢獻(xiàn)率進(jìn)行主成分提取。特征值大于1的主成分有2 個，第一主成分的特征值為4.617，方差貢獻(xiàn)率達(dá)65.964%；第二主成分的特征值為1.795，方差貢獻(xiàn)率是25.644%，這兩個主成分累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)91.6%(表6)，可代替7 個萌發(fā)指標(biāo)的絕大部分信息，綜合反映鹽脅迫下油菜芽期的萌發(fā)特性，可以作為油菜耐鹽種質(zhì)評價的綜合指標(biāo)。

由表6和表7可知，對第一主成分產(chǎn)生正向影響的指標(biāo)有發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長、芽長、相對根長、相對芽長，載荷數(shù)都比較高，都在0.76 以上。載荷較高但對第一主成分產(chǎn)生負(fù)向影響的指標(biāo)是相對鹽害指數(shù)，其數(shù)值為-0.802。對第二主成分產(chǎn)生負(fù)向影響的指標(biāo)有發(fā)芽勢和發(fā)芽率，載荷數(shù)為-0.584 和-0.593，相對鹽害指數(shù)和相對芽長為較高的正載荷指標(biāo)，載荷值為0.5 以上。

表6 甘藍(lán)型油菜各指標(biāo)的主成分的方差貢獻(xiàn)率Table 6 Variance contribution rate of principal components of each index in rapeseed

表7 甘藍(lán)型油菜耐鹽指標(biāo)的主成分載荷矩陣Table 7 Loading matrix of two principal components

2.5 基于平均隸屬函數(shù)值、綜合評價指數(shù)值的油菜耐鹽綜合評價

平均隸屬函數(shù)值(ASF值)和綜合評價指數(shù)(CEI)，作為評價耐鹽性強(qiáng)弱標(biāo)準(zhǔn)的度量值，ASF值和CEI值越大，耐鹽性越強(qiáng)。利用公式(3)計算油菜種質(zhì)的平均隸屬函數(shù)值(ASF值)，并對146份油菜種質(zhì)進(jìn)行排序(表1)。平均隸屬函數(shù)值為0.00～5.33，綜合排名前十的種質(zhì)從大到小依次為1164、1462、928、862、1028、861、1624、1030、1185和1395，綜合排名后十的種質(zhì)從小到大依次為962、1352、1032、1079、940、1047、1334、1006、1484和1497。將發(fā)芽指標(biāo)原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，利用公式(5)計算綜合評價指數(shù)(CEI= 0.72Z1+0.28Z2)。綜合評價指數(shù)為-2.51～ 4.76，146 份油菜種質(zhì)耐鹽性強(qiáng)的種質(zhì)綜合排名前十的是928、1164、1028、1624、1462、1030、1395、1613、862和1185。敏鹽材料依次為1352、962、1032、940、1334、1497、1079、1047、1006和1413。本試驗(yàn)用這2 種綜合評價體系來評價146 份油菜種質(zhì)的耐鹽情況，結(jié)果表明，146 份材料在不同評價體系中排名略有不同，但排名順序差異不大，耐鹽材料和敏鹽材料的篩選結(jié)果基本一致。

2.6 聚類分析

基于耐鹽綜合評價指數(shù)(CEI)，通過最遠(yuǎn)距離法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，在歐氏距離為5處將146 份油菜種質(zhì)分為四大類(圖3)。第Ⅰ類為高度耐鹽材料，包括928、1164、1624、1462、1030和1028；第Ⅱ類為中度耐鹽材料，包括1395、1613、862和861等11 份；第Ⅲ類為低耐鹽材料，包括853、1210、1075、1098、1649和1650等64 份；第Ⅳ類為敏鹽材料，包括1006、1032、1047和1352等 65份。

3 討 論

目前，中國土壤鹽漬化十分嚴(yán)重，而通過種植耐鹽作物對鹽漬土進(jìn)行生物改良是目前最為經(jīng)濟(jì)、最有效的途徑[22]，這對油菜的耐鹽性提出了更高的要求。中國作為白菜型油菜和芥菜型油菜的起源中心，種質(zhì)資源豐富，遺傳變異較為廣泛，這為開展油菜優(yōu)良種質(zhì)資源研究與創(chuàng)新提供了重要的材料基礎(chǔ)[23]。因此，加強(qiáng)現(xiàn)有油菜種質(zhì)資源耐鹽性的系統(tǒng)評價和利用，對選育耐鹽油菜新品種具有極大的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)探究6 個不同鹽濃度對6 份遺傳背景不同材料的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200～250 mmol·L-1鹽濃度可以鑒定不同材料耐鹽的差異性，為了快速篩選出高度耐鹽材料，試驗(yàn)最終選擇230 mmol·L-1作為本試驗(yàn)的篩選濃度，與龍衛(wèi)華等[18]認(rèn)為214 mmol·L-1的鹽濃度最適于鑒定耐鹽性的研究結(jié)果接近。以該濃度對146 份種質(zhì)材料進(jìn)行芽期耐鹽性綜合評價，研究發(fā)現(xiàn)，230 mmol·L-1濃度的鹽脅迫下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和芽長的變異系數(shù)分別為136%、107%和81%，進(jìn)一步表明油菜種質(zhì)資源的耐鹽性存在廣泛變異。

鹽脅迫下，油菜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、苗長及根數(shù)等形態(tài)指標(biāo)呈現(xiàn)不同程度的下降[24]。目前，油菜耐鹽性篩選指標(biāo)并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。但有研究表明，發(fā)芽勢和發(fā)芽率在油菜各個品種之間差異很大，可以作為指示油菜鹽逆境反應(yīng)的指標(biāo)[25]；劉自剛等[26]認(rèn)為鹽敏感品系的胚根長/胚芽長比值顯著高于耐鹽品系，耐鹽品系胚根伸長對鹽脅迫更加敏感，也可以將胚根長作為篩選耐鹽材料的指標(biāo)；Irandokht等[27]對300 份油菜種質(zhì)進(jìn)行早期耐鹽篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下種子的發(fā)芽率降幅最大，而發(fā)芽率、出苗率、地上部和根的長度及質(zhì)量是油菜耐鹽性篩選的重要指標(biāo)；Wu等[28]通過芽鮮質(zhì)量這一指標(biāo)建立數(shù)學(xué)評價模型，能預(yù)測甘藍(lán)型油菜萌發(fā)期的耐鹽能力，可以作為大規(guī)模篩選油菜耐鹽性的可靠指標(biāo)。本研究通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、芽長、相對根長和相對芽長之間相互呈極顯著正相關(guān)，而與發(fā)芽相對鹽害率呈極顯著負(fù)相關(guān)，部分相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9 以上，各個指標(biāo)相關(guān)性極為明顯。這些指標(biāo)對耐鹽綜合評價指標(biāo)的貢獻(xiàn)率不同，因此，如果想要準(zhǔn)確反映某一油菜材料的耐鹽性，應(yīng)當(dāng)盡可能調(diào)查多個指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，才能全方位反映油菜種子的耐鹽性。

近年來，隨著作物抗逆性研究的發(fā)展，利用主成分分析、平均隸屬函數(shù)值法和聚類分析等對大豆[29]、花生[30]、油菜[31]、高粱[32]和馬鈴薯[33]等作物進(jìn)行抗逆性篩選鑒定，已經(jīng)成為綜合評價作物抗逆性的有效且可靠的方法。本研究通過測定油菜發(fā)芽期相關(guān)指標(biāo)，分析各個耐鹽指標(biāo)的相關(guān)性，并采用主成分分析法綜合分析各個指標(biāo)在耐鹽性分析中所占的權(quán)重，基于平均隸屬函數(shù)值、綜合評價指數(shù)值對所有供試材料的耐鹽性進(jìn)行綜合評價并排序。最后通過聚類分析，將146 份油菜種質(zhì)耐鹽性分為四大類。通過不同的評價體系，綜合篩選出6 份高度耐鹽的材料，包括：1164、928、1624、1462、1030和1028。其中1164品系的平均隸屬函數(shù)值(ASF值)為5.33，排名第1，綜合評價指數(shù)(CEI)為4.52，排名第2 ，在2 種評價體系中綜合表現(xiàn)最好，耐鹽性最強(qiáng)。但由于作物在不同生長發(fā)育階段所表現(xiàn)的耐鹽性可能存在一定差異，在發(fā)芽期篩選出的耐鹽性較好的油菜種質(zhì)是否在苗期或者成株期表現(xiàn)出相同的特性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究通過鹽濃度梯度試驗(yàn)篩選出甘藍(lán)型油菜芽期耐鹽處理的適宜濃度為230 mmol·L-1，在該鹽濃度處理下測定了146份甘藍(lán)型油菜芽期耐鹽相關(guān)形態(tài)指標(biāo)，利用相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)法和聚類分析等分析方法對146份甘藍(lán)型油菜的耐鹽性進(jìn)行綜合評價，篩選出6份強(qiáng)耐鹽的甘藍(lán)型油菜種質(zhì)。本研究為甘藍(lán)型油菜耐鹽性評價以及耐鹽性育種提供了參考。