金毛耳草中熊果酸和齊墩果酸的含量測(cè)定

崔 田

(安徽省蚌埠市食品藥品檢驗(yàn)中心,蚌埠 233000)

金毛耳草為茜草科植物金毛耳草Hedyotischrysotricha(Palib.)Merr.的干燥全草，又名黃毛耳草，味苦，性涼，歸肝、膽、膀胱、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、利濕消腫的功效，用于腸炎、痢疾、急性黃疸型肝炎等[1]；主要成分為車葉草苷、熊果酸、白樺脂酸、齊墩果酸等[1,2]，有文獻(xiàn)報(bào)道，采用高效液相色譜法測(cè)定金毛耳草中槲皮素和蘆丁的含量[3-5]，但目前采用HPLC法同時(shí)對(duì)金毛耳草藥材中活性成分熊果酸與齊墩果酸的含量測(cè)定未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定該藥材中熊果酸與齊墩果酸的含量，為該藥材的質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，配有DAD檢測(cè)器；CP225D型十萬(wàn)分之一電子天平、BS210S型萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)。金毛耳草藥材經(jīng)蚌埠市食品藥品檢驗(yàn)中心張青云副主任中藥師鑒定為茜草科植物金毛耳草Hedyotischrysotricha(Palib.)Merr.的干燥全草。熊果酸對(duì)照品(批號(hào)：110742-201622，純度：94.7%)，齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)：110709-201607，純度：91.7%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純，水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:安捷倫ZORBAX SB-Cl8色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:甲醇-0.2%醋酸溶液(88 ∶12),流速:0.8 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;進(jìn)樣量10 μl;采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。在上述條件下,齊墩果酸和熊果酸的分離度良好(R=1.64),理論塔板數(shù)均大于5 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取熊果酸對(duì)照品、齊墩果酸對(duì)照品適量,分別精密稱定19.85 mg和20.12 mg,分別置10 ml和50 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(熊果酸濃度為1.879 8 mg/ml,齊墩果酸濃度為0.369 0 mg/ml)。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 ml至10 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液(熊果酸濃度為0.187 98 mg/ml,齊墩果酸濃度為0.036 9 mg/ml)。對(duì)照品溶液色譜圖見圖1。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末(過(guò)2號(hào)篩)0.5 g,置具塞錐形瓶中,精密加入乙醇50 ml,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),用少量乙醇洗滌濾渣和濾器,合并濾液,蒸干,殘?jiān)蛹状歼m量使溶解,轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。供試品溶液色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取熊果酸和齊墩果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2,0.5,1,2,5 ml,分別至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,得到不同濃度的系列對(duì)照品溶液,按“2.1”色譜條件進(jìn)樣,以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(x),色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y),熊果酸和齊墩果酸的線性回歸方程分別為y=178.54x-4.089 1,r=0.999 4;y=57.353x+20.592,r=0.999 1,結(jié)果表明熊果酸、齊墩果酸濃度分別在0.037 6-0.939 9 mg/ml和0.007 4-0.184 5 mg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液,按“2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,得到熊果酸峰面積的RSD值為0.74%,齊墩果酸峰面積的RSD值為1.38%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液,分別于0,2,4,6,8 h下進(jìn)樣測(cè)定,得到熊果酸峰面積的RSD值為1.34%,齊墩果酸峰面積的RSD值為1.12%,表明在室溫下放置8 h內(nèi)樣品溶液基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一編號(hào)樣品6份,按照“2.2.2”方法制備供試品溶液,按“2.1”色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定含量,得到熊果酸含量測(cè)定結(jié)果的RSD值為0.65%,齊墩果酸含量測(cè)定結(jié)果的RSD值為1.21%。

1.齊墩果酸;2.熊果酸圖1 供試品HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of sample solution

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一編號(hào)的樣品6份,各0.25 g,精密加入熊果酸對(duì)照品溶液(濃度為1.879 8 mg/ml)0.3 ml和齊墩果酸對(duì)照品溶液(濃度為0.369 0 mg/ml)0.4 ml,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算加樣回收率。熊果酸和齊墩果酸的平均加樣回收率分別為98.61%和97.63%,RSD分別為1.07%和1.13%(見表1和表2)。

表1 熊果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery test results of ursolic acid

表2 齊墩果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery test results of oleanolic acid

2.8 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地的金毛耳草藥材0.5 g,按照“2.2.2”方法制備供試品溶液,按“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定,按外標(biāo)法分別計(jì)算樣品中熊果酸與齊墩果酸的含量,結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)Table 3 Determination results (n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

熊果酸與齊墩果酸檢測(cè)可以用蒸發(fā)光檢測(cè)器也可以用紫外檢測(cè)器,紫外的靈敏度更高,而二者最大吸收在近紫外區(qū),波長(zhǎng)選擇很關(guān)鍵,參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-10],最終選擇210 nm。由于二者都屬于五環(huán)三萜類化合物,結(jié)構(gòu)非常相似,因此,選擇適合的流動(dòng)相至關(guān)重要。本文查詢了相關(guān)文獻(xiàn)[6-10],比較了甲醇-乙腈-0.05%醋酸銨、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.2%醋酸、甲醇-水等流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)用甲醇-0.2%醋酸溶液(88 ∶12)時(shí),熊果酸與齊墩果酸分離情況比較好,峰形較好,綜合考慮作為本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相。降低流速對(duì)分離度也有改善,因此選擇流速為0.8 ml/min。

3.2 提取條件的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-10],對(duì)供試品的提取方法進(jìn)行了考察,比較了甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等不同溶劑及加熱回流、超聲提取方法,結(jié)果表明,乙醇超聲提取效率較高,又簡(jiǎn)便易行,因此選擇乙醇超聲作為提取方法。同時(shí)對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考查,比較了20,30,40,50 min超聲提取的效率,結(jié)果顯示30 min后含量無(wú)明顯變化,故選擇超聲提取30 min。

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果分析

從樣品含量測(cè)定結(jié)果看,不同產(chǎn)地的金毛耳草中熊果酸和齊墩果酸含量差別較大,這可能與氣候、土壤、采收時(shí)間等有關(guān),這需要下階段進(jìn)一步具體研究。本文建立的方法簡(jiǎn)便易行,可操作性強(qiáng),可為金毛耳草藥材質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。