白血病抑制因子抑制缺氧缺血新生大鼠模型神經(jīng)元凋亡的機(jī)制研究

湯麗萍,閆 瑾,王 浩,范 芳*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科,西安 710032;2西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:76709358@qq.com)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopatly,HIE)可引起神經(jīng)炎癥,并導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡并進(jìn)一步加重腦損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥的主要因子[1]。尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞活化和富集是缺氧缺血的病理特征。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞毒因子觸發(fā)神經(jīng)炎癥并引起神經(jīng)元功能障礙[2]。

白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是白細(xì)胞介素6細(xì)胞因子家族中的一種糖蛋白,在中樞神經(jīng)系統(tǒng),LIF主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放,可促進(jìn)神經(jīng)活動(dòng)增加、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和神經(jīng)元存活[3]。據(jù)報(bào)道,在新生兒腦梗死后,LIF的表達(dá)顯著增加,LIF通過誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷酸化以及Delta-like-1和Notch1的表達(dá)來調(diào)節(jié)新生兒腦缺血急性恢復(fù)期間神經(jīng)前體細(xì)胞的擴(kuò)張[4]。然而,目前尚不清楚LIF對(duì)HIE損傷后的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)[5]和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)[6]是與腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化和隨后的炎癥反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB部分依賴于NLRP3炎癥體的調(diào)節(jié),并共同參與神經(jīng)炎癥過程。適當(dāng)抑制NLRP3炎癥體和NF-κB p65核轉(zhuǎn)位可以有效抑制缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)炎癥[7]。

目前,關(guān)于LIF在新生大鼠HIE模型中調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡的機(jī)制尚不明確。因此,本研究旨在從NLRP3和NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥方面來揭示LIF在HIE發(fā)病過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

過表達(dá)LIF的慢病毒(LV-LIF)和對(duì)照慢病毒(LV-NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。2,3,5-三苯基四氮唑氯(TTC)購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;尼氏染色和TUNEL染色試劑盒購自瑞士羅氏公司;Trizol、Prime Script TM RT Reagent試劑盒、SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ購自日本Takara Biotechnology公司;核質(zhì)蛋白提取試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;BCA蛋白分析試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;Alexa Fluor 488-偶聯(lián)山羊抗鼠IgG購自美國(guó)Proteintech公司,其余抗體均購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國(guó)Bio-Rad公司;DAPI購自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

90只7日齡SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)新生大鼠由西安醫(yī)學(xué)院[SYXK(陜)2016-004]提供,體質(zhì)量16-20 g,雌雄不限。大鼠在12 h的光/暗周期、21-24 ℃、55%相對(duì)濕度的環(huán)境下飼養(yǎng),由母鼠自由哺乳。

1.3 新生大鼠缺氧缺血誘導(dǎo)模型

將新生大鼠置于溫控室中,用乙醚進(jìn)行全身麻醉誘導(dǎo)。新生大鼠被固定在一個(gè)立體定向器中,暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈,分離神經(jīng)和靜脈,用5-0絲線結(jié)扎頸總動(dòng)脈,縫合傷口。1 h后,將新生大鼠暴露在37 ℃的低氧密封室(92% N2和8% O2)中2 h。結(jié)束后,將新生大鼠送回母鼠籠中。假手術(shù)大鼠僅暴露頸總動(dòng)脈,但不結(jié)扎總動(dòng)脈,也不低氧處理。

1.4 動(dòng)物分組及處理

在HIE建模前7 d,對(duì)50只新生大鼠腦室注射過表達(dá)LIF的慢病毒(LV-LIF)或?qū)φ章《?LV-NC)。大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉,在右側(cè)大腦半球鉆孔,將10 μl注射器立體定向插入為腦室注射準(zhǔn)備的孔中。右側(cè)大腦半球分別注射5 μl LV-LIF(1×109TU/ml)或LV-NC(1×109TU/ml),注射速率為0.5 μl/min。LV-LIF或LV-NC給藥及HIE建模后,根據(jù)處理方法將新生大鼠分為以下4組:假手術(shù)組(n=15):僅進(jìn)行假手術(shù);HIE組(n=15),僅進(jìn)行HIE建模;HIE+LV-NC組(n=15):在HIE模型大鼠基礎(chǔ)上進(jìn)行LV-NC腦內(nèi)給藥;HIE+LV-LIF組(n=15):在HIE模型大鼠基礎(chǔ)上進(jìn)行LV-LIF腦內(nèi)給藥。

1.5 梗死體積檢測(cè)

建模48 h后分離腦組織,在-20 ℃冰凍20 min后,連續(xù)冠狀切片5片(2 mm厚),然后將切片孵育在37 ℃下用2% 2,3,5-三苯基四氮唑氯(TTC)染色25 min。用Image J軟件分析梗死體積。

1.6 神經(jīng)行為評(píng)估

根據(jù)Longa評(píng)分[8]進(jìn)行神經(jīng)行為評(píng)估,用Longa評(píng)分檢測(cè)神經(jīng)功能缺損程度。0分,無明顯缺陷;1分,左前爪不能充分伸展;2分,左前肢伸展困難,向左轉(zhuǎn)圈;3分,向左傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識(shí)水平下降。得分越高,損害越嚴(yán)重。2分和3分的動(dòng)物納入研究中,而得分為0,1,4分的HIE新生大鼠則被排除在外。

1.7 尼氏染色和TUNEL染色檢測(cè)大鼠腦細(xì)胞凋亡

建模48 h后,用水合氯醛麻醉新生大鼠,快速移出大腦,在4 ℃下4%多聚甲醛固定。冠狀切開腦組織,厚度為4 μm。根據(jù)制造商的說明對(duì)切片進(jìn)行尼氏染色和TUNEL染色。每組隨機(jī)選擇5片,并用OLYMPUS CKX41顯微鏡分析。通過Image J軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 RT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織LIF mRNA表達(dá)水平

用Trizol提取腦組織總RNA,用Prime Script TM RT Reagent試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在Bio-Rad Q5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上使用SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行PCR。循環(huán)條件包括95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下所示:LIF正向:5′-TGCTCTGGCTTTAGTGGAAAATATG-3′,反向:5′-CTCTTAGGAGTGGATAGTCAGTCCG-3′;β-actin正向:5′-TGACGACCATTCTGACAGGA-3′,反向:5′-GTGTGGGTGAACTCAGGTAA-3。

1.9 Western blot檢測(cè)LIF、NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB p65和IκBα蛋白表達(dá)水平

取缺血半影區(qū)的腦組織。通過核質(zhì)蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)。用BCA蛋白分析試劑盒檢測(cè)蛋白的濃度。用10%SDS-PAGE電泳分離總蛋白(50 μg),并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,并用以下一抗在4 ℃孵育過夜:抗LIF(1 ∶2 000)、抗NLRP3(1 ∶2 000)、抗ASC(1 ∶2 000)、抗Caspase-1(1 ∶1 000)、抗NF-κB p65(1 ∶2 000),抗IκBα(1 ∶2 000)、抗Lamin B1(1 ∶1 000)和抗β-actin(1 ∶1 000)兔單克隆抗體。用TBST洗滌3次后,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性二抗在37 ℃孵育1 h,通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯影。Lamin B1作為細(xì)胞核蛋白內(nèi)參,β-actin作為細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)大鼠腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平

用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定腦組織勻漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的水平。

1.11 免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)大鼠腦切片中Iba-1的表達(dá)

腦切片在室溫下用4%甲醛溶液固定30 min,用1% Triton X-100孵育30 min,用5%山羊或驢血清在37 ℃封閉1 h,然后用以下一抗在4 ℃孵育過夜:Iba-1(1 ∶200)。用PBS洗滌3次后,切片與Alexa Fluor 488-偶聯(lián)山羊抗鼠IgG(1 ∶200)熒光二抗在37 ℃反應(yīng)1 h。用DAPI(1 ∶200)在37 ℃染色10 min。所有圖像均使用尼康A(chǔ)1R/A1激光共聚焦顯微鏡觀察和獲取。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LIF在HIE新生大鼠腦組織中的表達(dá)

與假手術(shù)組相比,HIE組大鼠LIF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組過表達(dá)LIF的慢病毒給藥后大鼠LIF mRNA和蛋白的表達(dá)水平均升高(P<0.05),HIE組與HIE+LV-NC組的LIF mRNA和蛋白的表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05,見圖1)。

A.Western blot檢測(cè)LIF蛋白的表達(dá)B.RT-PCR檢測(cè)LIF mRNA的表達(dá)與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖1 LIF在不同干預(yù)的新生大鼠腦組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of LIF in the brain tissue of newborn rats after different treatment

2.2 過表達(dá)LIF對(duì)HIE新生大鼠的神經(jīng)行為的影響

假手術(shù)組新生大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分,說明該組大鼠無明顯神經(jīng)缺陷。HIE組和HIE+LV-NC組新生大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為2.7±0.5分和2.6±0.3分。與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分(1.5±0.4)顯著降低(P<0.05,見圖2)。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖2 新生大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分Figure 2 Neurological deficit score of newborn rats after different treatment

2.3 過表達(dá)LIF對(duì)HIE新生大鼠腦梗死體積的影響

TTC染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組新生大鼠無腦梗死區(qū)域,HIE組和HIE+LV-NC組的腦梗死體積分別為27.6%±3.1%和26.8%±3.1%。與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組大鼠的腦梗死體積(14.8%±2.6%)顯著降低(P<0.05,見圖3)。

2.4 過表達(dá)LIF對(duì)HIE新生大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

尼氏染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,HIE組梗死區(qū)空泡化、神經(jīng)元丟失和組織破壞增加;與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組的空泡化、神經(jīng)元丟失和組織破壞明顯減輕。TUNEL染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,HIE組細(xì)胞凋亡指數(shù)增加(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05,見圖4,5)。

圖4 新生大鼠腦組織的尼氏染色和TUNEL染色Figure 4 Nissl staining and TUNEL staining of neonatal rat brain tissue

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖5 TUNEL染色評(píng)估新生大鼠海馬和皮層的細(xì)胞凋亡指數(shù)Figure 5 Apoptosis index of hippocampus and cortex of newborn rats by TUNEL staining

2.5 過表達(dá)LIF對(duì)HIE新生大鼠神經(jīng)炎癥的影響

與假手術(shù)組相比,HIE組新生大鼠腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均升高(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均降低(P<0.05,見圖6)。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖6 新生大鼠腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平Figure 6 The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the brain homogenate of newborn rats

2.6 過表達(dá)LIF對(duì)HIE新生大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

與假手術(shù)組相比,HIE組新生大鼠腦組織中Iba-1的相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組腦組織中Iba-1的相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.05,見圖7)。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖7 新生大鼠腦組織中Iba-1的免疫熒光染色Figure 7 Immunofluorescence staining of Iba-1 in the brain tissue of newborn rats

2.7 LIF對(duì)HIE新生大鼠腦缺血半影區(qū)內(nèi)NLRP3和NF-κB信號(hào)通路的影響

與假手術(shù)組相比,HIE組大鼠腦缺血半影區(qū)內(nèi)NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組大鼠腦缺血半影區(qū)內(nèi)NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05,見圖8)。與假手術(shù)組相比,HIE組大鼠腦缺血半影區(qū)內(nèi)NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平升高,而IκBα的蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組大鼠腦缺血半影區(qū)內(nèi)NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平降低,而IκBα的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05,見圖9)。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖9 新生大鼠腦缺血半影區(qū)中NF-κB p65和IκBα的蛋白表達(dá)Figure 9 Protein expression of NF-κB p65 and IκBα in the penumbra of cerebral ischemia in neonatal rats

3 討論

白血病抑制因子是一種多功能的高度糖基化蛋白,在體內(nèi)多器官和組織中合成和分泌,參與內(nèi)分泌、生殖、炎癥和免疫系統(tǒng)的許多重要生物學(xué)功能,并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)揮作用[4]。LIF通過與其受體以及糖基化的gp130蛋白復(fù)合物結(jié)合,激活多條下游信號(hào)通路。根據(jù)組織類型、細(xì)胞和發(fā)育階段的不同,LIF可以激活和調(diào)節(jié)各種類型的信號(hào)通路,包括JAK/STAT3、PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路[9-11]。在正常組織中,LIF的轉(zhuǎn)錄水平很低,但在損傷后其表達(dá)顯著增加[12]。有研究顯示,在LIF單倍體缺陷小鼠中,LIF缺陷小鼠有更嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)和感覺缺陷,伴隨著細(xì)胞死亡和軸突變性增加[12]。Gresle等[13]發(fā)現(xiàn)LIF基因缺失的小鼠更容易患實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎。然而,LIF在HIE中的作用仍不明確,本研究顯示,LIF在HIE新生大鼠模型腦內(nèi)上調(diào)。為了進(jìn)一步揭示LIF在HIE中的作用機(jī)制,本研究對(duì)HIE新生大鼠腦內(nèi)注射了過表達(dá)LIF的慢病毒。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LIF改善了HIE新生大鼠的神經(jīng)行為并減少了腦梗死體積,說明LIF密切參與HIE的發(fā)病過程。

缺氧減少了葡萄糖和氧氣的輸送,從而引起細(xì)胞呼吸紊亂和代謝異常并導(dǎo)致氧化應(yīng)激和自由基的產(chǎn)生,進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放,導(dǎo)致血腦屏障的破壞和繼發(fā)性腦損傷[14]。繼發(fā)性神經(jīng)元損傷與以小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的神經(jīng)炎性反應(yīng)有關(guān),而過度的神經(jīng)炎癥也是神經(jīng)元凋亡的主要原因。因此,抑制HIE中的神經(jīng)炎癥是減少神經(jīng)元死亡及疾病進(jìn)展的關(guān)鍵。本研究表明,過表達(dá)LIF可有效抑制神經(jīng)炎癥及神經(jīng)元凋亡。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)腦缺血后神經(jīng)炎癥的主要免疫細(xì)胞[15],負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境[16]。當(dāng)腦內(nèi)缺氧缺血后,小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷一系列的表型變化轉(zhuǎn)變成具有較少和較厚突起或變形蟲形狀的活化細(xì)胞形態(tài)[17]。一方面,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移到缺血區(qū),清除有害物質(zhì)并維持組織穩(wěn)態(tài)。另一方面,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生過量的炎性細(xì)胞因子、趨化因子和氧/氮自由基加劇組織損傷和神經(jīng)元死亡[18]。因此,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活可以抑制神經(jīng)炎癥并預(yù)防腦損傷。本研究顯示,過表達(dá)LIF可明顯抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1的表達(dá)。因此,上述結(jié)果提示LIF可能通過抑制HIE引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化來減輕神經(jīng)炎癥。

NLRP3炎癥體主要包括NLRP3、ASC和Caspase-1[19]。NLRP3激活后通過與NEK7相互作用,并與ASC和Caspase-1形成復(fù)合物(NLRP3炎癥體),然后將非活性炎性細(xì)胞因子如IL-1β轉(zhuǎn)化為成熟的炎性細(xì)胞因子,進(jìn)而促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[20]。NF-κB途徑是腦梗死所致神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄途徑[21]。NF-κB主要以p65和p50組成的異源二聚體存在。在靜息細(xì)胞中,NF-κB存在于細(xì)胞質(zhì)中,并與NF-κB抑制蛋白α(inhibitor a of NF-κB,IκBα)結(jié)合。在各種刺激下,IκBα被IκB激酶磷酸化并降解,這種降解導(dǎo)致p65/p50 NF-κB的核轉(zhuǎn)位,并促進(jìn)許多促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄[22,23]。抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位可以有效抑制缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)炎癥[7,24]。本研究結(jié)果表明,過表達(dá)LIF抑制了HIE新生大鼠腦缺血半影區(qū)中NLRP3炎癥體和NF-κB信號(hào)通路,從而抑制了神經(jīng)炎癥。

總之,LIF可通過抑制NLRP3炎癥體和NF-κB信號(hào)通路的激活來有效抑制HIE后的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥。因此,LIF與NLRP3炎癥體和NF-κB信號(hào)通路的相互作用可能是預(yù)防和治療HIE的一種策略。