磷酸二酯酶-5抑制劑通過(guò)抗氧化作用抑制大鼠肝細(xì)胞癌進(jìn)展

周 楊,東 麗,劉佳佳,劉 偉*

(1內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院放療科,呼和浩特 010010;2內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:18047192753@163.com)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的腫瘤之一。目前用于治療HCC的抗癌藥物毒性大,生存率低,療效不理想。這主要是由于缺乏對(duì)HCC發(fā)生和發(fā)展的生化和分子機(jī)制了解。有研究觀察到,與正?；蛑?chē)悄[瘤組織相比,5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase-5 inhibitors,PDE5)在癌癥中表達(dá)明顯增加[1]。由此表明PDE5可能對(duì)某些類(lèi)型腫瘤具有抗癌活性,并可能增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療藥物的敏感性。最近有文獻(xiàn)表明,在體外,2 μmol/L西地那非、索拉非尼和雷戈拉非尼增強(qiáng)了HepG2、HEP3B和HuH7細(xì)胞凋亡,而他達(dá)拉非(100 μmol/L)抑制了人肝癌細(xì)胞系HEP3B和PLC/PRF/F中髓源性抑制細(xì)胞,并增加了細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞活性[2]。已有研究表明,西地那非通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡,從而抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)[3]。因而,本研究旨在評(píng)估PDE5抑制劑西地那非在二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)誘導(dǎo)大鼠HCC中的抗癌作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DEN和PDE5(美國(guó)Sigma公司);谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性(glutathione S-transferase,GST)和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)(美國(guó)Sigma公司);HE染料(美國(guó)Sigma公司);氧化應(yīng)激標(biāo)記物檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

雄性Wistar大鼠(150-180 g),購(gòu)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蒙)2015-0001)。將Wistar大鼠隨機(jī)分成3組:對(duì)照組、DEN組和PDE5+DEN組,每組均10只。對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間(1-18周),每周腹腔注射0.2 ml生理鹽水;DEN組大鼠在18周內(nèi),每周腹腔注射0.2 ml DEN溶液(50 mg/kg)。PDE5+DEN組大鼠在18周內(nèi),每周腹腔注射0.2 ml DEN溶液(50 mg/kg),同時(shí)腹腔注射PDE溶液(10 mg/kg)。18周時(shí),通過(guò)頸椎脫臼處死動(dòng)物,分離肝臟,制備20%的組織勻漿,收集上清液并儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中,以評(píng)估氧化應(yīng)激標(biāo)記物。此外,將一部分肝組織保存在-80 ℃冰箱中,用于免疫印跡分析及HE染色。

1.3 免疫印跡分析GST和AFP

將保存在-80 ℃冰箱中肝組織取出,加入全細(xì)胞裂解液提取蛋白,用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。電泳樣品制備后,取30 g進(jìn)行SDS-PAGE電泳,后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%牛奶孵育1 h后,并用磷酸鹽緩沖液洗膜。用兔抗GST和AFP多克隆抗體(1 ∶500)和鼠抗β-actin多克隆抗體(1 ∶1 000)孵育2 h。GST和AFP是可靠的HCC標(biāo)志物。用山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(1 ∶10 000)孵育1 h。洗膜后用化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測(cè)并攝片,以β-actin為內(nèi)參,應(yīng)用圖像分析軟件Quantity one進(jìn)行吸光度積分值分析。

1.4 組織病理學(xué)分析

取出肝臟,用PBS沖洗,用4%福爾馬林固定24 h,然后梯度酒精脫水。組織被轉(zhuǎn)移并嵌入蠟中,在切片機(jī)幫助下,從塊體上切下5 μm厚切片。將組織切片固定在涂有新鮮白蛋白干凈載玻片上,然后梯度酒精脫水。將切片通過(guò)二甲苯除去蠟,采用HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)分析。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)分析

采用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)肝組織勻漿中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析及Tukey’s檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDE5對(duì)HCC標(biāo)志物的影響

與對(duì)照組相比,DEN組GST和AFP表達(dá)顯著增加(P<0.05);PDE5+DEN組PDE5治療HCC大鼠后,GST和AFP表達(dá)顯著降低(P<0.05見(jiàn)圖1,表1)。

圖1 Western blot檢測(cè)PDE5對(duì)HCC標(biāo)志物的影響Figure 1 Effect of PDE5 on HCC markers by Western blot

表1 不同組大鼠肝臟GST和AFP相對(duì)表達(dá)比較(n=10)Table 1 Relative expression of GST and AFP in liver of rats in different groups (n=10)

2.2 PDE5對(duì)組織病理學(xué)的影響

在HE染色切片的組織學(xué)檢查中,對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常;DEN組大鼠中,肝臟表現(xiàn)為大量細(xì)胞增生、多形性、異型性,以及核質(zhì)比和有絲分裂增加;PDE5+DEN組大鼠肝臟細(xì)胞增生、多形性和異型性明顯改善,同時(shí)核質(zhì)比和有絲分裂降低(見(jiàn)圖2)。

圖2 不同組大鼠肝臟HE染色 (×100)Figure 2 HE staining of liver in different groups (×100)

2.3 PDE5對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響

與對(duì)照組相比,DEN組大鼠肝臟中SOD、CAT和GPx活性明顯下降(均P<0.05);MDA水平升高(P<0.05)。與DEN組相比,PDE5+DEN組PDE5抑制劑治療后SOD、CAT和GPx活性升高(均P<0.05);MDA水平降低(P<0.05,見(jiàn)表2)。

表2 PDE5對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物活性影響 (n=10)Table 2 Effects of PDE5 on the activities of oxidative stress markers (n=10)

3 討論

在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,腫瘤部位存在著生化變化,可以作為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志物。在這方面,GST已被用作HCC標(biāo)記物。GST對(duì)肝臟中DEN代謝后產(chǎn)生的毒性物質(zhì)具有重要的解毒作用。在本研究中,我們觀察到在DEN誘導(dǎo)HCC大鼠中GST蛋白表達(dá)增加。GST表達(dá)水平增加證實(shí)了基因毒性誘導(dǎo)的大鼠肝癌的發(fā)生。有研究通過(guò)監(jiān)測(cè)HCC治療大鼠肝臟中GST表達(dá)的下降,成功地證實(shí)了化合物的抗癌特性,例如白藜蘆醇[4]。使用類(lèi)似的方法,我們發(fā)現(xiàn)用PDE5抑制劑西地那非治療HCC大鼠導(dǎo)致GST表達(dá)顯著下降。其他研究組也報(bào)道了PDE5抑制劑西地那非在不同癌癥中的抗癌活性,例如,在體外,西地那非可直接觸發(fā)B-慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中的半胱氨酸蛋白酶依賴(lài)性凋亡[5]。肝腫瘤組織分泌多種腫瘤相關(guān)蛋白作為診斷、預(yù)后的標(biāo)志物,其中AFP目前用于DEN誘導(dǎo)的HCC診斷。AFP是HCC診斷的主要標(biāo)志物,約半數(shù)HCC腫瘤分泌AFP[6]。因此,在本研究中,AFP表達(dá)增加進(jìn)一步證實(shí)了DEN誘導(dǎo)HCC的發(fā)生。然而,用PDE5治療肝癌大鼠后,導(dǎo)致AFP顯著下降。上述結(jié)果通過(guò)觀察正常大鼠、HCC大鼠和PDE5治療的HCC大鼠的肝細(xì)胞組織學(xué)變化得到證實(shí)。本研究肝組織病理學(xué)顯示,在DEN誘導(dǎo)的HCC大鼠中,表現(xiàn)為大量細(xì)胞增生、多形性、異型性,以及核質(zhì)比和有絲分裂增加。與我們的研究一致,其他研究也報(bào)道了DEN誘導(dǎo)肝組織毒性是導(dǎo)致癌前病灶的原因,DEN誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌中,肝細(xì)胞損傷表現(xiàn)為核染色質(zhì)濃縮,邊緣與核膜相連,形成半月形或圓形致密的核殘余,肝細(xì)胞收縮,胞漿濃縮[7]。用PDE5治療HCC大鼠后,HCC大鼠肝臟組織學(xué)顯著恢復(fù)。

氧化應(yīng)激通常與過(guò)多的ROS產(chǎn)生有關(guān),表現(xiàn)為生物體正常氧化還原狀態(tài)的破壞。關(guān)于腫瘤的發(fā)展,氧化應(yīng)激是一把雙刃劍,一定程度的氧化應(yīng)可刺激腫瘤生長(zhǎng),然而持續(xù)增強(qiáng)的氧化應(yīng)激在體內(nèi)外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。在本研究中,在DEN誘導(dǎo)的HCC中觀察到所有抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)水平降低,我們的發(fā)現(xiàn)與其他文獻(xiàn)研究一致[9],DEN誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生也與抗氧化酶水平降低而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激有關(guān)。氧化應(yīng)激最重要的后果是脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞膜通透性改變。我們也可以觀察到DEN誘導(dǎo)的HCC大鼠MDA水平顯著增加,這與其他早期報(bào)道一致[10]。在本研究中,MDA評(píng)估可作為DEN誘導(dǎo)的肝癌脂質(zhì)氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高是由于活性氧的過(guò)量產(chǎn)生和SOD、過(guò)氧化氫酶和GPx等抗氧化劑減少,最終導(dǎo)致膜脂的損傷。在用PDE5治療HCC大鼠后,抗氧化酶如SOD、CAT和GPx顯著增加,同時(shí)DEN誘導(dǎo)HCC大鼠的MDA水平下降。與我們的工作類(lèi)似,在另一項(xiàng)研究中,PDE5抑制劑他達(dá)拉非在大鼠脊髓損傷后增加抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)活性,并降低MDA水平[11]。以往也有報(bào)道,PDE抑制劑西地那非治療可降低健康男性血液中MDA水平[12]。此外,西地那非可提高大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)扭轉(zhuǎn)損傷時(shí)SOD、GPx和CAT活性,降低MDA水平[12]。MDA減少可能是由于PDE5治療大鼠后,誘導(dǎo)了超氧化物歧化酶和CAT,因?yàn)檫@些酶在清除自由基方面起著重要作用。

本研究結(jié)果顯示,在DEN誘導(dǎo)的HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,腫瘤標(biāo)志物GST和AFP表達(dá)顯著增加。深入研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn),在DEN誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,SOD、CAT和GPx等抗氧化酶活性降低,MDA水平升高。用PDE5抑制劑西地那非治療后,上述指標(biāo)均顯著改善。上述研究結(jié)果提示PDE5抑制劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化途徑關(guān)鍵參數(shù)來(lái)阻止HCC進(jìn)展,從而發(fā)揮抗癌作用。