NIH 法與改良NIH 法測(cè)定人用狂犬病疫苗效價(jià)的合格率比較

魏翠芬，李 明，吳志鵬，肖 堯，駱禹辰，趙紅梅，山 峰

（中科生物制藥股份有限公司 河北 三河 065201）

狂犬病是由狂犬病病毒感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的一種古老的人獸共患傳染病[1]，臨床大多表現(xiàn)為特異性恐風(fēng)、恐水、咽肌痙攣、進(jìn)行性癱瘓等[2]。它是嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，缺乏有效治療方法，全球每年約有59 000 人死于狂犬病[3]。安全有效的人用和獸用狂犬疫苗是預(yù)防狂犬病的最重要手段[4]?？袢∫呙缱鳛槟壳拔ㄒ荒茴A(yù)防和控制狂犬病的制劑，其研發(fā)和生產(chǎn)日益成為熱點(diǎn)[5]。自1885 年法國(guó)巴斯德研究院第1 支人用狂犬病疫苗誕生以來(lái)，人用狂犬病疫苗經(jīng)歷了從神經(jīng)組織疫苗到以細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病疫苗以及從非純化、含佐劑和防腐劑疫苗到純化、不含佐劑和防腐劑疫苗的歷程[6]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，制備工藝的逐漸提高，狂犬病疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量明顯提升[7]。作為狂犬病疫苗有效性的關(guān)鍵指標(biāo)，效價(jià)檢測(cè)方法及準(zhǔn)確性至關(guān)重要。目前人用狂犬疫苗的效價(jià)檢測(cè)方法主要有NIH 法和改良NIH 法，也有文獻(xiàn)記載建立人狂犬病病毒抗體ELISA 定量檢測(cè)方法，用于評(píng)價(jià)人用狂犬病疫苗的免疫效果[8]。NIH 法為WHO 推薦的狂犬病疫苗效價(jià)測(cè)定方法，也是歷版《中國(guó)藥典》規(guī)定的法定檢查法，在《中國(guó)藥典》2020 版中增加了人用狂犬病疫苗效價(jià)測(cè)定法第二法，即改良NIH 法。本文用NIH 法和改良NIH 法同時(shí)測(cè)定人用狂犬疫苗的效價(jià)，對(duì)兩種方法檢測(cè)能力進(jìn)行比較。

1.資料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢驗(yàn)樣品：人用狂犬病疫苗（某公司），共計(jì)20 個(gè)樣品，合格標(biāo)準(zhǔn)為不低于4.0 IU/劑。

1.1.2 參考疫苗：狂犬病疫苗（效力檢定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院。批號(hào)：250009-201108，效價(jià)：6.6 IU/mL）。

1.1.3 CVS：狂犬病疫苗效價(jià)測(cè)定用攻擊毒CVS（簡(jiǎn)稱CVS，中國(guó)食品藥品檢定研究院，傳代至使用代次）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠（簡(jiǎn)稱KM 小鼠，某公司，SPF 級(jí)）。

1.1.5 試劑：磷酸二氫鉀（分析純，Merck 公司）、磷酸氫二鈉（分析純，成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司）、氯化鈉（分析純，河北華晨藥業(yè)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 效價(jià)測(cè)定用PBS（pH7.2 ～8.0）配制

1.2.1.1 甲液：稱取2.4 g 磷酸氫二鈉于燒杯中加適量水溶解，倒入量筒中加水稀釋至l00 mL。

1.2.1.2 乙液：稱取0.9 g 磷酸二氫鉀于燒杯中加適量水溶解，倒入量筒中加水稀釋至l00 mL。

1.2.1.3取甲液17 mL，乙液3 mL于燒杯中，加入1.7 g氯化鈉使其溶解后，倒入量筒中加水至200 mL，搖勻。測(cè)溶液pH 值在7.2 ～8.0 的范圍內(nèi)，高壓滅菌（121℃，20 min），即得效價(jià)測(cè)定用PBS（pH7.2 ～8.0）。

1.2.2 NIH 法：用PBS 對(duì)樣品及復(fù)溶后的參考疫苗進(jìn)行5 倍系列稀釋，取1:25、1:125、1:625 稀釋度，每個(gè)樣品每個(gè)稀釋度免疫12 ～14 gKM 小鼠16 只，每只KM小鼠腹腔注射0.5 mL，間隔一周后再免疫一次。第一次免疫后14 d，用含20 ～60 個(gè)LD50病毒量的CVS 進(jìn)行攻擊，每只腦內(nèi)注射0.03 mL；同時(shí)將攻擊毒稀釋到100、10-1、10-2、10-3，進(jìn)行毒力滴定，每個(gè)稀釋度不少于8 只KM 小鼠。自攻擊后逐日觀察14 d，記錄死亡情況，統(tǒng)計(jì)第5 d后死亡以及呈典型狂犬病腦癥狀的小鼠數(shù)量。通過(guò)計(jì)算樣品和參考疫苗ED50值，最終計(jì)算樣品的相對(duì)效力，效力≥4.0 IU/劑為合格。

1.2.3 改良NIH 法：用PBS 對(duì)復(fù)溶后的參考疫苗進(jìn)行288 倍稀釋；對(duì)樣品進(jìn)行174 倍稀釋，取以上稀釋度的參考疫苗及樣品分別免疫12 ～14 gKM 小鼠10 只，每只KM 小鼠腹腔注射0.5 mL，間隔一周后再免疫一次，其余同NIH 法。當(dāng)樣品的小鼠保護(hù)率大于參考疫苗時(shí)，樣品的效價(jià)判為合格。

1.2.4 每個(gè)樣品檢驗(yàn)時(shí)，同一天用同一廠家同批次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，NIH 法與改良NIH 法同時(shí)進(jìn)行。

1.2.5 將兩種方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行整理匯總，計(jì)算合格率。使用χ2檢驗(yàn)對(duì)兩種方法的合格率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果與分析

2.1 共計(jì)使用人用狂犬病疫苗樣品20 個(gè)。檢驗(yàn)結(jié)果如“NIH 法與改良NIH 法測(cè)定人用狂犬病疫苗效價(jià)結(jié)果對(duì)比表”所示，使用NIH 法檢測(cè)均為合格，合格率100%；用改良NIH 法檢測(cè)，19 個(gè)樣品合格（其中2 個(gè)樣品檢驗(yàn)結(jié)果為4.0 IU/劑），1 個(gè)樣品結(jié)論為不合格，合格率為95%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩種方法的合格率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），改良NIH 法測(cè)定人用狂犬病疫苗效價(jià)與NIH 法相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

表1 NIH 法與改良NIH 法測(cè)定人用狂犬病疫苗效價(jià)結(jié)果對(duì)比

2.2 NIH 法每個(gè)樣品使用48 只小鼠，同時(shí)每次實(shí)驗(yàn)時(shí)參考疫苗組使用48 只小鼠，另外需要CVS 對(duì)照40 只小鼠，共計(jì)136 只。改良NIH 法每個(gè)樣品使用10 只小鼠，同時(shí)每次實(shí)驗(yàn)時(shí)參考疫苗組使用10 只小鼠，另外需要CVS 對(duì)照40 只小鼠，共計(jì)60 只。

3.討論

目前檢測(cè)狂犬疫苗效力的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一法是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）建立的小鼠體內(nèi)方法，此法操作復(fù)雜，因而在2020 年出版的《中國(guó)藥典》中又提出了改良NIH法，改良NIH 法稀釋過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，使用的動(dòng)物數(shù)量明顯減少?！吨袊?guó)藥典》也規(guī)定了使用改良NIH 法檢測(cè)效價(jià)的一些前提條件，如：采用該方法的實(shí)驗(yàn)室已建立穩(wěn)定的NIH 法且檢定結(jié)果一致性好，對(duì)NIH 法變異控制在較好范圍的實(shí)驗(yàn)室；采用改良NIH 法測(cè)定效價(jià)不合格時(shí)，應(yīng)以NIH 法測(cè)定，并作為最終判定結(jié)果[9]。

醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和醫(yī)學(xué)研究離不開(kāi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)該得到基本的尊重與關(guān)愛(ài)[10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是人類直接認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象的重要媒介，生物醫(yī)學(xué)界中很多里程碑的科研成果都是通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得的，它們對(duì)于促進(jìn)生命科學(xué)的發(fā)展起著極其重要的作用[11]。伴隨著人們新的善待動(dòng)物的觀念的興起，19 世紀(jì)科學(xué)界以及社會(huì)公眾圍繞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)問(wèn)題展開(kāi)了激烈爭(zhēng)論。最終，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3 R”原則得到了確立。3 R 原則，系指在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用替代（Replacement）、減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）的方法，它是維護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的重要原則?！? R”原則既滿足了人們對(duì)動(dòng)物的道德關(guān)切，又保障了科學(xué)的發(fā)展[12]。隨著社會(huì)的進(jìn)步和科技的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利得到越來(lái)越多的重視。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生命科學(xué)及生物醫(yī)藥等多行業(yè)多領(lǐng)域的研發(fā)和實(shí)驗(yàn)起著越來(lái)越重要的基礎(chǔ)性支撐作用，其巨大貢獻(xiàn)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身心遭受各類傷害為痛苦代價(jià)的[13]。支撐“動(dòng)物福利論”的“3 R 原則”是中國(guó)福利倫理學(xué)界的共識(shí)，隨著GLP 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的建立與發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的要求將越來(lái)越高[14]。如何在保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果科學(xué)可靠的前提下來(lái)提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利是每一個(gè)醫(yī)學(xué)科研工作者要考慮的問(wèn)題[15]。尋找并發(fā)展有效替代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有效方法已經(jīng)成為研究焦點(diǎn)[16]。本次試驗(yàn)中，與NIH法相比，改良NIH 法使用動(dòng)物數(shù)量明顯減少，更加符合3 R 中的“減少”、“優(yōu)化”原則。

綜上所述，改良NIH 法在測(cè)定疫苗效價(jià)上與NIH 法相比沒(méi)有顯著差異。改良NIH 法更符合3 R 中的“減少”、“優(yōu)化”原則。但由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較少，所得結(jié)果尚不能說(shuō)明兩種方法在檢測(cè)能力上沒(méi)有差別，疫苗檢測(cè)時(shí)，是否可以采用改良NIH 法，還需要更多的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)支持。