基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討四物湯抗乳腺癌的作用機(jī)制

單麗芳，康國(guó)嬌，張 超，繆 瑋，宋曉坤*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討四物湯抗乳腺癌的作用機(jī)制

單麗芳1，康國(guó)嬌1，張 超2，繆 瑋2，宋曉坤2*

1. 普洱市中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，云南 普洱 665000 2. 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，天津 300060

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)分析四物湯抗乳腺癌的作用機(jī)制。通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP）獲取熟地黃、白芍、川芎、當(dāng)歸的主要活性成分及其靶點(diǎn)，根據(jù)吸收、分布、代謝和排泄（absorption、distribution、metabolism and excretion，ADME）篩選中藥活性組分；通過(guò)在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD）、Genecards和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取乳腺癌主要作用靶點(diǎn)；通過(guò)Venn Diagram得到四物湯與乳腺癌的共同靶點(diǎn)；利用BiosoGenet進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction network，PPI）分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；采用Metascape平臺(tái)分析“藥物-成分-靶點(diǎn)”及其參與的生物過(guò)程及通路，采用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“活性成分-疾病-通路”網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用AutoDock及Pymol對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)與相應(yīng)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。從四物湯中篩選得到40種活性成分及147個(gè)作用靶點(diǎn)，與1505個(gè)乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到61個(gè)共同靶點(diǎn)；四物湯抗乳腺癌的核心活性成分為山柰酚、β-谷甾醇、沒(méi)食子酸、豆甾醇等，關(guān)鍵靶點(diǎn)為前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、雌激素受體（estrogen receptor1，ESR1）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）等；四物湯抗乳腺癌的生物學(xué)通路眾多，主要功能為調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、血管生成、激素水平等。分子對(duì)接結(jié)果顯示，篩選的主要活性成分與其對(duì)應(yīng)靶蛋白均具有較好的結(jié)合活性。四物湯抗乳腺癌具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接；四物湯；乳腺癌；山柰酚；β-谷甾醇；豆甾醇；沒(méi)食子酸

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2019年乳腺癌的新發(fā)病例在美國(guó)女性十大主要癌癥類型中位居首位[1]。我國(guó)國(guó)家癌癥中心《2018年全國(guó)最新癌癥報(bào)告（上）》指出，乳腺癌為當(dāng)前中國(guó)女性發(fā)病率最高的腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，且越來(lái)越年輕化[2]。隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，中藥在治療乳腺癌中發(fā)揮著重要作用，尤其在改善癥狀方面具有極大潛力。中醫(yī)將乳腺癌歸于“乳巖”“乳石癰”“奶巖”范疇，其病位在肝、脾、腎。中醫(yī)認(rèn)為，氣滯血瘀痰凝是乳腺癌的主要病機(jī)，血液運(yùn)行不暢，血流瘀滯最終成為“瘤”[3-4]。四物湯源自《仙授理傷續(xù)斷秘方》，為補(bǔ)血活血的經(jīng)典方劑，由熟地黃、白芍、川芎、當(dāng)歸組成，具有補(bǔ)血和血、調(diào)經(jīng)化瘀的功效[5]，臨床上被廣泛用于促進(jìn)骨髓造血、改善外周血象及修復(fù)受損紅細(xì)胞、治療骨科類疾病、婦科類疾病、惡性腫瘤放化療后血虛及血液高凝癥等[6]。四物湯能夠防治乳腺癌[7]，但由于其多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，四物湯治療乳腺癌的作用機(jī)制較為復(fù)雜，確定其活性成分群及作用機(jī)制成為亟需解決的問(wèn)題。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥組方應(yīng)用于多種疾病的機(jī)制研究提供了科學(xué)通道[8]，其所運(yùn)用的系統(tǒng)生物學(xué)研究思路與復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑相互作用的特點(diǎn)高度一致，而整體性、系統(tǒng)性與中醫(yī)藥研究的整體觀、辨證論治相契合。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，根據(jù)四物湯中主要活性成分的分子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，對(duì)乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，從整體角度系統(tǒng)分析二者在網(wǎng)絡(luò)中特定節(jié)點(diǎn)的相互作用關(guān)系，從而探索藥物與機(jī)體的相互關(guān)聯(lián)，揭示可能潛在的作用機(jī)制，并采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)篩選出的主要活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合活性驗(yàn)證，為四物湯的臨床應(yīng)用及深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 四物湯相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過(guò)中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP）[9]檢索熟地黃、白芍、川芎、當(dāng)歸的活性成分，由于中藥進(jìn)入體內(nèi)后多通過(guò)有效成分入血發(fā)揮作用，故根據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18[10]對(duì)活性成分信息進(jìn)行初步篩選，以獲得活性成分及其作用靶點(diǎn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性成分的已知靶點(diǎn)。將活性成分作用靶點(diǎn)統(tǒng)一在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）進(jìn)行規(guī)范。

1.2 四物湯活性成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將四物湯的活性成分與對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?。?jié)點(diǎn)代表活性成分，邊代表活性成分與靶點(diǎn)的相互作用。

1.3 乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“breast cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omim.org）、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd）、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://go.drugbank.com）[11]中乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中，分值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切，若靶點(diǎn)過(guò)多則設(shè)定分值大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。合并4個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，得到疾病相關(guān)的靶點(diǎn)名稱。將活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行去重，利用Venn Diagram得到“活性成分-疾病”共同靶點(diǎn)。

1.4 “活性成分-疾病”靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction network，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析

為系統(tǒng)地探討四物湯活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與乳腺癌靶點(diǎn)間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用，使用Cytoscape3.8.0軟件中的BiosoGenet插件分別構(gòu)建四物湯活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)和乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建2個(gè)網(wǎng)絡(luò)的重疊部分，得到新的交集網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)度值、介度、緊密度、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊緣通性對(duì)交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。篩選大于度值的2倍中位數(shù)節(jié)點(diǎn)構(gòu)成顯著交集PPI網(wǎng)絡(luò)，再進(jìn)一步篩選出同時(shí)滿足分別大于上述5個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)中位數(shù)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)構(gòu)成核心PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 “活性成分-疾病”靶點(diǎn)基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將四物湯治療乳腺癌的靶點(diǎn)錄入Metascape平臺(tái)（http://metascape.org/gp/index.html）[12]，進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要包括生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成（cellular component，CC），物種設(shè)置“sapiens”，選擇Custom Analysis，設(shè)置＜0.01，分析其主要的生物學(xué)過(guò)程與代謝通路并進(jìn)行富集分析，將結(jié)果繪制成氣泡圖進(jìn)行可視化。

1.6 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用CytoScape 3.8.0軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，利用CytoScape 3.8.0軟件內(nèi)置工具Network Analyzer進(jìn)行分析，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)如度值、介度、緊密度等，分析核心靶點(diǎn)及主要活性成分。

1.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

為更好地闡述四物湯治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的活性成分之間的結(jié)合活性，根據(jù)上述篩選出的活性成分和核心靶點(diǎn)，分別選取“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點(diǎn)與差異活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，以臨床常用藥物雷洛昔芬、多西他賽作為對(duì)照。分別從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）下載核心靶蛋白受體的晶體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用PyMoL軟件刪除靶蛋白受體無(wú)關(guān)配體和非蛋白分子（如水分子）；從ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)（http://zinc.docking.org/）下載配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)；采用AutoDock Tools工具對(duì)上述靶蛋白受體和配體小分子進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，以配體為中心設(shè)置Grid Box，再用Autogrid模塊得到對(duì)接活性位點(diǎn)，進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能。選取與靶蛋白對(duì)接結(jié)合能最高的成分，采用PyMoL軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 四物湯活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)初步獲得活性成分熟地黃76個(gè)、白芍85個(gè)、川芎189個(gè)、當(dāng)歸125個(gè)。經(jīng)吸收、分布、代謝和排泄（absorption、distribution、metabolism and excretion，ADME）篩選以及文獻(xiàn)補(bǔ)充，共獲得活性成分熟地黃5個(gè)、白芍19個(gè)、川芎14個(gè)、當(dāng)歸7個(gè)，見(jiàn)表1。將活性成分在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲取對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，并將其導(dǎo)入U(xiǎn)nitprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名標(biāo)準(zhǔn)化處理，獲得活性成分作用靶點(diǎn)熟地黃48個(gè)、川芎52個(gè)、白芍157個(gè)、當(dāng)歸103個(gè)，合并后刪除重復(fù)值共得到作用靶點(diǎn)147個(gè)。

表1 四物湯的活性成分

2.2 四物湯“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將四物湯的活性成分及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。網(wǎng)絡(luò)由184個(gè)節(jié)點(diǎn)和396條邊組成，六邊形代表4味中藥篩選出的活性成分，六邊形越大表示活性成分越重要，其中SD為來(lái)源于熟地黃的成分，DG為來(lái)源于當(dāng)歸的成分，BS為來(lái)源于白芍的成分，CX為來(lái)源于川芎的成分，A1表示熟地黃、川芎共有成分，B1表示熟地黃、當(dāng)歸共有成分，C1表示白芍、當(dāng)歸共有成分，D1、D2表示川芎、當(dāng)歸共有成分。矩形代表活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的邊表示活性成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

圖1 四物湯“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.3 乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

從Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)時(shí)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定分值大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為乳腺癌的潛在靶點(diǎn)，分值最大值為440.05、最小值為0.08、中位數(shù)為21.22，故設(shè)定分值＞21.22的靶點(diǎn)為乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。合并OMIM、TTD、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)刪除重復(fù)值，最終得到1505個(gè)乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)。采用Venn Diagram將篩選的四物湯活性成分靶點(diǎn)與乳腺癌疾病靶點(diǎn)取交集，得到四物湯成分-乳腺癌共同靶點(diǎn)61個(gè)，見(jiàn)圖2。表明四物湯中活性成分配伍使用既能夠增加治療靶點(diǎn)數(shù)量、擴(kuò)大治療范圍，又能協(xié)同作用于共同靶點(diǎn)、提高療效。其中共同靶點(diǎn)主要包括多種激素受體，如孕激素受體（progesterone receptor，PGR）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、雌激素受體（estrogen receptor，ESR1/ ESR2）、糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，NR3C1）、前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、核受體輔激活蛋白1（nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）等。

圖2 四物湯活性成分靶點(diǎn)與乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 “活性成分-疾病”靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析

將上述得到的數(shù)據(jù)分別構(gòu)建四物湯活性成分作用靶點(diǎn)PPI和乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系。四物湯活性成分作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)有4893個(gè)節(jié)點(diǎn)和121 902條邊，乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)共有11 540個(gè)節(jié)點(diǎn)和231 226條邊。“活性成分-疾病”的PPI網(wǎng)絡(luò)有4748個(gè)節(jié)點(diǎn)和117 568條邊。度值大于2倍中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)有1223個(gè)節(jié)點(diǎn)和53 223條邊。同時(shí)滿足大于度值、介度、緊密度、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊緣通性5個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)中位數(shù)的核心PPI網(wǎng)絡(luò)共有232個(gè)節(jié)點(diǎn)和4233條邊，其中度值、介度、緊密度、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊緣通性的中位數(shù)分別為98、480.083、0.433、139.200、15.690。表明四物湯的活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，且各靶點(diǎn)之間具有相互協(xié)同作用。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析與核心靶點(diǎn)篩選

2.5 “活性成分-疾病”靶點(diǎn)GO功能與KEGG通路富集分析

共得到KEGG富集結(jié)果263條，根據(jù)值選取排名前20的結(jié)果繪制高級(jí)氣泡圖，見(jiàn)圖4，四物湯治療乳腺癌主要涉及癌癥的途徑、鉑類藥物耐藥、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路、化學(xué)致癌作用、內(nèi)分泌抵抗、卵巢類固醇生成、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等通路。

GO富集分析共得到MF富集結(jié)果46個(gè)、BP富集結(jié)果1340個(gè)、CC富集結(jié)果41個(gè)。如圖5所示，MF主要涉及核受體活性、蛋白質(zhì)均二聚活性、過(guò)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、氧化還原酶活性、蛋白激酶結(jié)合、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等；如圖6所示，BP主要涉及活性氧代謝程、對(duì)類固醇激素的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、腺體發(fā)育、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、對(duì)異源生物刺激的反應(yīng)、對(duì)雌二醇的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖、RNA聚合酶II對(duì)pri-miRNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、肽絲氨酸磷酸化等；如圖7所示，CC主要涉及膜筏、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、受體復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、軸突、胞質(zhì)部分、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)、過(guò)氧化物酶體、黏附連接等。

圖4 “活性成分-疾病”靶點(diǎn)KEGG通路富集分析(前20)

圖6 “活性成分-疾病”靶點(diǎn)GO通路MF富集分析(前20)

圖7 “活性成分-疾病”靶點(diǎn)GO通路CC富集分析(前12)

2.6 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖8，包括98個(gè)節(jié)點(diǎn)和298條邊。如表2所示，山柰酚度值為31、介度為0.069 9、緊密度為0.516 0；β-谷甾醇度值為12、介度為0.049 4、緊密度為0.414 5，預(yù)測(cè)山柰酚、β-谷甾醇為四物湯治療乳腺癌的主要活性成分。其次為沒(méi)食子酸、豆甾醇、齊墩果酸、(＋)-兒茶素、楊梅酮、阿魏酸、蔗糖、α-姜黃素、川芎嗪、(＋)-檸檬烯和芍藥苷。如表3所示，PTGS2在網(wǎng)絡(luò)中的度值為27、介度為0.337 3、緊密度為0.510 5；ESR1度值為26、介度為0.313 8、緊密度為0.482 5，預(yù)測(cè)PTGS2、ESR1為四物湯治療乳腺癌的主要靶點(diǎn)。此外，AKT1、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）、JUN原癌基因、腫瘤抗原p53（tumor antigen p53，TP53）、B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，BCL2）、FOS原癌基因、BCL2相關(guān)X蛋白（BCL2 associated X protein，BAX）、RELA原癌基因、白細(xì)胞介素 6（interleukin 6，IL6）、CASP8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、NCOA1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等也為重要靶點(diǎn)。

圓形節(jié)點(diǎn)為活性成分；矩形為靶點(diǎn)；倒三角為通路

表2 四物湯主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表3 四物湯主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.7 主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

通常配體與受體結(jié)合能越低，結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能＜0表明配體分子能夠與受體蛋白自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤?17.78 kJ/mol表明配體與受體有一定的結(jié)合活性，結(jié)合能≤?20.92 kJ/mol表明配體與受體有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能≤?29.29 kJ/mol表明配體與受體有強(qiáng)的結(jié)合活性[13-14]。分別選取“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值較大的靶點(diǎn)PTGS2（PDB-ID 5KIR）、ESR1（PDB-ID 1GWQ）、AKT1（PDB-ID 3OS5），分別以4個(gè)度值較大的核心成分山柰酚、β-谷甾醇、沒(méi)食子酸、豆甾醇為對(duì)象，以多西他賽、雷洛昔芬為陽(yáng)性對(duì)照藥物，采用AutoDock進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。如表4和圖9所示，山柰酚、β-谷甾醇、沒(méi)食子酸、豆甾醇與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能均＜?20.92 kJ/mol，其中山柰酚與PTGS2、ESR1的結(jié)合能均＜?29.29 kJ/mol，且強(qiáng)于多西他賽、雷洛昔芬，β-谷甾醇與AKT1的結(jié)合能＜?29.29 kJ/mol，強(qiáng)于多西他賽、雷洛昔芬，表明活性成分與對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

3 討論

由于致病因素的復(fù)雜性，乳腺癌病因尚未完全明確。既往研究認(rèn)為乳腺癌是由乳腺上皮細(xì)胞不典型的增生向原位癌轉(zhuǎn)化，最終進(jìn)展為浸潤(rùn)性癌[15]。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展是多種因素、多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。除癌細(xì)胞本身外，炎性因素、血管微環(huán)境、成纖維細(xì)胞等腫瘤微環(huán)境也起著重要作用，其產(chǎn)物與乳腺癌上皮細(xì)胞聯(lián)系密切[16]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等手段，提高患者的生存周期，但同時(shí)也帶來(lái)很多嚴(yán)重的不良反應(yīng)。相較于西醫(yī)療法，中藥能夠通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑抑制腫瘤，在緩解不良反應(yīng)、提高腫瘤患者生活質(zhì)量等方面發(fā)揮著重要作用。

表4 核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

圖9 四物湯抗乳腺癌的關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接模式

3.1 四物湯活性成分分析

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，四物湯共有40種活性成分、147個(gè)潛在靶點(diǎn)與乳腺癌相關(guān)，初步篩選出山柰酚、β-谷甾醇、沒(méi)食子酸、豆甾醇、齊墩果酸、阿魏酸等為四物湯治療乳腺癌的活性成分。山柰酚為白芍的主要成分，能夠抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。β-谷甾醇為白芍和當(dāng)歸的共同成分，能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移[18]。沒(méi)食子酸為白芍主要成分，可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并發(fā)生形態(tài)學(xué)改變[19]。豆甾醇為熟地、當(dāng)歸的共有成分，能夠有效預(yù)防或治療乳腺癌、卵巢癌等癌癥[20]。阿魏酸為當(dāng)歸、川芎的共有成分，阿魏酸能夠通過(guò)雌激素受體α調(diào)控肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1 （metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[21]。

3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，四物湯各活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，且各靶點(diǎn)之間相互協(xié)同，經(jīng)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)為PTGS2、ESR1、AKT1，CASP3、JUN、TP53、BCL2、FOS、BAX、RELA、IL6、CASP8、VEGFA、NCOA1、TNF等。研究表明，四物湯表現(xiàn)出雌激素作用，而雌激素主要通過(guò)雌激素受體α促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖。ESR1編碼雌激素受體α，主要參與乳腺癌等婦科腫瘤細(xì)胞的增殖[22]。PTGS2能夠?qū)⒒ㄉ南┧岽x成各種前列腺素產(chǎn)物，是前列腺素合成的重要限速酶。PTGS2通過(guò)在乳腺癌中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)血管再生、腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。因此，PTGS2在診斷和治療乳腺癌中具有重要意義[16]。AKT1是PI3K-Akt信號(hào)通路中重要的下游靶點(diǎn)，被磷酸化激活后主要參與細(xì)胞進(jìn)程[23]。AKT1過(guò)表達(dá)可以激活激素依賴性的內(nèi)分泌受體，還可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[24]。

3.3 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)作用的分析

KEGG通路富集結(jié)果主要涉及了PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、癌癥的途徑、藥物耐藥等方面。PI3K-Akt信號(hào)通路主要調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝等，PI3K的異常激活可以繼發(fā)下游靶點(diǎn)Akt磷酸化的持續(xù)激活，繼而引起正常乳腺細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制其凋亡，并使VEGF的合成增加，為乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件[25]。PI3K信號(hào)通路的異常激活還可以進(jìn)一步影響p53、NF-κB等與乳腺癌密切相關(guān)的下游通路[26-27]。

山柰酚能夠通過(guò)下調(diào)PI3K、Akt、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）蛋白磷酸化水平，促進(jìn)人炎性乳腺癌細(xì)胞SUM190凋亡[28]；山柰酚能夠通過(guò)作用于與胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）相關(guān)的雌激素受體α信號(hào)通路，抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)[29]；山柰酚能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，并下調(diào)BCL2蛋白表達(dá)水平[30]。β-谷甾醇可以抑制PI3K-Akt信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移[18]。四物湯能夠通過(guò)調(diào)控PTGS2治療多種疾病[31]。NF-κB通路的激活可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展[32]。Akt可以通過(guò)NF-κB/NF-κB抑制蛋白（NF-κB inhibitor protein，IκB）信號(hào)通路誘導(dǎo)環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[33]。齊墩果酸通過(guò)作用于雌激素受體，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[34]。沒(méi)食子酸聯(lián)合順鉑主要通過(guò)激活內(nèi)源性和外源性凋亡通路，并抑制p65蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[35]。文獻(xiàn)報(bào)道與本研究結(jié)果一致，分子對(duì)接結(jié)果也佐證了主要活性成分（山柰酚、β-谷甾醇、沒(méi)食子酸、豆甾醇）與關(guān)鍵靶點(diǎn)均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。表明四物湯可能通過(guò)山柰酚、β-谷甾醇、沒(méi)食子酸、豆甾醇等主要活性成分，作用于PTGS2、ESR1、AKT1等相關(guān)靶點(diǎn)，干預(yù)PI3K-Akt、NF-κB等信號(hào)通路，從調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、血管生成、激素水平等方面發(fā)揮治療乳腺癌作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)四物湯治療乳腺癌的活性成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)四物湯防治乳腺癌具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Siwu Decoction on breast cancer based onnetwork pharmacology and molecular docking

SHAN Li-fang1, KANG Guo-jiao1, ZHANG Chao2, MIAO Wei2, SONG Xiao-kun2

1. Department of Pharmacy, Puer Hospital of Traditional Chinese Medicine, Puer 665000, China 2. Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, Tianjin 300060, China

To reveal the mechanism of Siwu Decoction (四物湯) on breast cancer based on network pharmacology and molecular docking.Main chemical components and targets of,,andwere obtained from TCMSP database, and active components of Siwu Decoction were screened according to absorption, metabolism, distribution and excretion (ADME). Main targets of breast cancer were obtained from databases of Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), Therapeutic Target Database (TTD), Genecards and Drugbank. Common targets of Siwu Decoction and breast cancer were obtained by Venn Diagram, and BiosoGenet was used to analyze protein-protein interaction (PPI) and construct PPI network. Metascape platform was used to analyze “drug-component-target” and its involved biological processes and pathways, and then Cytoscape 3.8.0 software was used to construct a network of “active component-disease-pathway”. AutoDock and PyMol were used to conduct molecular docking verification of key targets and corresponding active ingredients.A total of 40 active ingredients were screened from Siwu Decoction, and 147 predicted targets were obtained; 1505 main targets for breast cancer were obtained, 61 common targets for active ingredients of Siwu Decoction and breast cancer were obtained. Core active ingredients from Siwu Decoction on breast cancer were kaempferol, β-sitosterol, gallic acid, stigmasterol and etc. Core targets were prostaglandin G/H synthase 2 (PTGS2), estrogen receptor 1 (ESR1), RAC-alpha serine/threonine-protein kinase (AKT1) and etc. Many biological pathways were involved in anti-breast cancer effect of Siwu Decoction with mainly function of regulating cell cycle process, angiogenesis and hormone levels. Molecular docking results showed that main active components had good binding activity with their corresponding target proteins.Siwu Decoction has characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway on anti-breast cancer, which provides the basis for its clinical application.

network pharmacology; molecular docking; Siwu Decoction; breast cancer; kaempferol; β-sitosterol; stigmasterol; gallic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2021)13 - 3943 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.018

2020-12-21

單麗芳（1989—），女，碩士，主管中藥師，從事腫瘤臨床藥學(xué)及中藥理論與應(yīng)用研究。Tel: 18387723782 E-mail: 465352726@qq.com

宋曉坤，女，碩士，主任藥師，從事醫(yī)院藥學(xué)質(zhì)控及臨床藥學(xué)研究。E-mail: xiaokun18@hotmail.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]