忍冬藤提取物誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究

嚴(yán)寶飛，段金廒，張景正，劉圣金，劉 嘉*，毛藝蓓，曾慶琪, 3

忍冬藤提取物誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究

嚴(yán)寶飛1, 2，段金廒2，張景正1，劉圣金2，劉 嘉1*，毛藝蓓1，曾慶琪1, 3

1. 江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 211800 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210023 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029

研究忍冬藤提取物對骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用及機(jī)制。采用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF/MS）表征忍冬藤提取物的化學(xué)成分；采用MTT法檢測忍冬藤提取物對人骨肉瘤細(xì)胞HOS、143B以及人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2存活率的影響；采用熒光顯微鏡觀察忍冬藤提取物對HOS、143B細(xì)胞凋亡的影響；采用Annexin V/PI雙染法檢測忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞凋亡的影響；采用JC-1染色法檢測忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞線粒體膜電位的影響；采用Western blotting法檢測忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白（bcl-2 associated X，Bax）、B細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、活化的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved poly ADP-ribose polymerases，cleaved PARP）、cleaved Caspase-9和細(xì)胞色素C（cytochrome-c，Cyt-C）蛋白表達(dá)的影響。忍冬藤提取物中鑒定出有機(jī)酸類、三萜皂苷類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類和氨基酸類5種類型的36種化學(xué)成分。忍冬藤提取物抑制HOS和143B細(xì)胞存活率，顯著誘導(dǎo)HOS細(xì)胞凋亡（＜0.01），Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK顯著抑制忍冬藤提取物誘導(dǎo)的HOS細(xì)胞凋亡（＜0.05、0.01）；忍冬藤提取物顯著提高HOS細(xì)胞Caspase-3活性（＜0.01），顯著改變HOS細(xì)胞線粒體膜電位（＜0.05、0.01），顯著上調(diào)HOS細(xì)胞Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9、Cyt-C和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）。忍冬藤提取物能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，并通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達(dá)，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

忍冬藤；骨肉瘤；凋亡；作用機(jī)制；UPLC-Q-TOF/MS

骨肉瘤又名成骨肉瘤，是一種可以直接產(chǎn)生骨樣組織的原發(fā)性惡性腫瘤，多發(fā)于青少年，發(fā)病率位居原發(fā)性惡性骨腫瘤第1位；其初期癥狀為間斷性的疼痛和腫脹，隨后發(fā)展為無法緩解的持續(xù)性疼痛，并伴有局部炎性反應(yīng)、病理性骨折等表現(xiàn)[1]。中醫(yī)學(xué)雖無“骨肉瘤”病名記載，但早有關(guān)于其癥狀及臨床表現(xiàn)的描述，如《靈柩·癰疽》載“發(fā)于膝，狀大癰，色不變，如堅石”，并將其歸屬為“下石疽”“骨疽”“骨瘤”“骨蝕”等范疇，體虛外感結(jié)里、邪氣博結(jié)于骨為其病因病機(jī)。中醫(yī)對骨肉瘤的病因、病位和病機(jī)的認(rèn)識與辨證論治的實(shí)踐充分，中醫(yī)辨證論治和整體觀念的治療原則在骨肉瘤治療過程中具有獨(dú)特的優(yōu)勢[2]。

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Thunb.的干燥莖枝，始載于魏晉時期的《名醫(yī)別錄》，自1963年被《中國藥典》收載，其性甘、味寒，具有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)之功效，用于治療溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰腫瘡瘍等癥，《本草綱目》稱其“莖葉及花，功用皆同，治一切濕氣及諸腫痛”[3]。忍冬藤主要含黃酮類、有機(jī)酸類、三萜類等成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、解熱等藥理活性。忍冬藤及其有效成分具有顯著的抗腫瘤作用，但尚未有研究報道其對骨肉瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制。因此，本研究考察忍冬藤提取物對人骨肉瘤細(xì)胞HOS和143B增殖和凋亡的影響，并初步探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，以期為忍冬藤的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

HOS、143B細(xì)胞及人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2購自美國ATCC。

1.2 藥材

忍冬藤（批號20200613）購自江蘇省中醫(yī)院，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為忍冬科植物忍冬Thunb.的干燥莖枝，憑證標(biāo)本存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心。

1.3 藥品與試劑

甲醇（批號20200814）購自南京化學(xué)試劑公司；乙腈購自德國Merck公司；對照品新綠原酸（批號XLYS20190413）、綠原酸（批號LYS20190306）、隱綠原酸（批號YLYS20190316）、異綠原酸B（批號YLYS220181107）、異綠原酸A（批號YLYS120190104）、異綠原酸C（批號YLYS320190203）購自南京春秋生物工程有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；胎牛血清（批號FSS500）購自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基（批號1776550）購自美國Gibco公司；MTT（批號M-2253）購自美國Spectrum Chemical公司；二甲基亞砜（DMSO，批號276855）購自美國Sigma公司；AnnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）雙染試劑盒（批號20200306）、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（批號KG-A306）購自上海李記生物科技公司；B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白（bcl-2 associated X，Bax）抗體（批號5023T）、B細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號15071T）、活化的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）抗體（批號9661T）、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved poly ADP-ribose polymerases，cleaved PARP）抗體（批號5625T）、cleaved Caspase-9抗體（批號7237T）、細(xì)胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）抗體（批號4280T）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號5174T）、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號32935S）購自美國CST公司；Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK（批號sc6753）購自美國Santa cruz公司；Hochest 33258染色試劑盒（批號H4046）、Caspase-3活性檢測試劑盒（批號C1115）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號23246）、PVDF膜（批號LC2002）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 儀器

EPED型超純水系統(tǒng)（南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司）；KQ250E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；ML204/MS105型電子天平（美國托利多公司）；Rotavapor R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；30A型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Triple TOF 5600＋型質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；TS2R型浮雕反差倒置熒光顯微鏡、TS100型倒置顯微鏡（日本尼康公司）；MINI-4小型垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Multiskan MK3型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 方法

2.1 忍冬藤提取物的制備

忍冬藤粉碎，過40目篩，稱取25 g粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，靜置1 h，室溫超聲50 min后濾過；濾渣中加入50%甲醇50 mL，室溫超聲50 min，合并濾液，濃縮至25 mL即得忍冬藤提取物（以生藥量計1 g/mL），于4 ℃保存，臨用前用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

2.2 忍冬藤提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析

2.2.1 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下忍冬藤提取物，13 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，得到供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定對照品，加入50%甲醇溶液，配制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C質(zhì)量濃度分別為0.213、0.243、0.530、0.174、0.306、0.204 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 色譜條件[4]Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～5.0 min，5%～27% B；5.0～10.0 min，27%～95% B；10.0～15.0 min，95% B；15.0～15.2 min，95%～5% B；15.2～20.0 min，5% B；柱溫為25 ℃；體積流量為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為3 μL。

2.2.4 質(zhì)譜條件 正、負(fù)離子模式；霧化氣壓力為379.225 kPa；輔助氣壓力為379.225 kPa；氣簾氣壓力為241.325 kPa；離子源溫度為550 ℃；離子噴霧電壓為4500 V/?4500 V；去簇電壓為60 V/?60 V；碰撞能量為60 eV/?60 eV；TOF-MS掃描范圍為/100～2000；子離子掃描范圍為/50～1500。

2.3 忍冬藤提取物對HK-2細(xì)胞存活率的影響

取處于對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組和忍冬藤提取物（5、10、25、50、75、100 mg/mL）組，棄去培養(yǎng)基，各給藥組加入100 μL藥物，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基（含0.1% DMSO），培養(yǎng)24 h。加入MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入DMSO，室溫振蕩，使結(jié)晶充分溶解，采用酶標(biāo)儀測定492 nm處的吸光度（）值，計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝給藥/對照

2.4 忍冬藤提取物對骨肉瘤細(xì)胞存活率的影響

取處于對數(shù)生長期的HOS和143B細(xì)胞，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，給藥后分別培養(yǎng)24、48、72 h，測定細(xì)胞存活率。

2.5 Hochest染色法檢測細(xì)胞凋亡

取處于對數(shù)生長期的HOS和143B細(xì)胞，以2.5×104/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組和忍冬藤提取物（25、50、75 mg/mL）組，各給藥組加入500 μL藥物，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基（含0.1% DMSO），培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌2次，于4%多聚甲醛溶液中固定30 min；棄上清，PBS洗滌3次，加入300 μL Hochest 33258工作液，室溫避光孵育10 min；棄上清，PBS洗滌3次，加入300 μL PBS，于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.6 Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

取處于對數(shù)生長期的HOS細(xì)胞，以4×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。按“2.5”項(xiàng)下方法處理，用不含EDTA的胰酶收集各組細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，PBS洗滌2次，加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V/FITC混勻，再加入PI染液，室溫混合后避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.7 Caspase-3試劑盒檢測Caspase-3活性

取處于對數(shù)生長期的HOS細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組和忍冬藤提取物（25、50、75 mg/mL）組，各給藥組加入500 μL藥物，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基（含0.1% DMSO），培養(yǎng)24 h。加入PBS洗滌2次，棄上清，每2×106個細(xì)胞加入100 μL裂解液，重懸細(xì)胞，裂解15 min，期間振蕩3～4次；4 ℃、8000 r/min離心15 min，吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，調(diào)整至每10微升待測樣品中含10～30 μg蛋白。取10 μL待測樣品，加入80 μL檢測緩沖液和10 μL Caspase-3底物Ac-DEVD-pDNA（2 mmol/L），混勻，37 ℃避光孵育2～4 h，采用酶標(biāo)儀測定405 nm處的值，計算Caspase-3活性。

2.8 Z-VAD-FMK對HOS細(xì)胞存活率的影響

取處于對數(shù)生長期的HOS細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組、Z-VAD-FMK（10 μmol/L）組、忍冬藤提取物（25、50、75 mg/mL）組、忍冬藤提取物聯(lián)用Z-VAD-FMK組。Z-VAD-FMK預(yù)處理30 min后，各給藥組再加入100 μL藥物，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基（含0.1% DMSO），培養(yǎng)24 h，按“2.3”項(xiàng)下方法測定細(xì)胞存活率。

2.9 JC-1染色法檢測線粒體膜電位變化

取處于對數(shù)生長期的HOS細(xì)胞，按“2.7”項(xiàng)下方法處理，用不含EDTA的胰酶收集各組細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，加入500 μL JC-1工作液，培養(yǎng)15 min，2000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用1×Incubation Buffer洗滌2次，采用流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位的變化。

2.10 Western blotting法檢測Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達(dá)情況

取處于對數(shù)生長期HOS細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，收集各組細(xì)胞，采用總蛋白分離提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h，分別加入Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌4次，5 min/次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶1000），孵育2 h；TBST洗滌4次，5 min/次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，采用ChemiScope 3300 mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，ClinxChemi圖像軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 忍冬藤提取物成分鑒定

忍冬藤提取物正、負(fù)離子模式下總離子流圖見圖1。在色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化后，基于Triple TOF 5600+工作站PeakView工作站、對照品和相關(guān)文獻(xiàn)，在忍冬藤提取物中共鑒定出36種化學(xué)成分，見表1。

圖1 正 (A)、負(fù)離子模式(B) 忍冬藤提取物的總離子流圖

表1 忍冬藤提取物的UPLC/Q-TOF-MS分析

3.2 忍冬藤提取物對HK-2、HOS和143B細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示，忍冬藤提取物最大給藥濃度仍然沒有達(dá)到HK-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（50% maximal inhibitory concentrations，IC50）值；如圖3所示，忍冬藤提取物抑制HOS和143B細(xì)胞存活率，呈劑量和時間相關(guān)性；忍冬藤提取物作用于HOS細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為37.15、24.07、12.93 mg/mL，作用于143B細(xì)胞24、48、72 h的IC50值分別為39.88、25.95、18.34 mg/mL。

圖2 忍冬藤提取物對HK-2細(xì)胞存活率的影響()

3.3 忍冬藤提取物對HOS和143B細(xì)胞凋亡的影響

如圖4所示，對照組HOS和143B細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散均勻藍(lán)色熒光；忍冬藤提取物組HOS和143B細(xì)胞均出現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀藍(lán)色熒光等明顯的細(xì)胞凋亡特征，表明忍冬藤提取物能夠促進(jìn)HOS和143B細(xì)胞凋亡。

3.4 忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞凋亡的影響

如圖5所示，與對照組比較，各給藥組HOS細(xì)胞凋亡率明顯升高（＜0.01），呈劑量相關(guān)性，表明忍冬藤提取物能夠誘導(dǎo)HOS細(xì)胞凋亡。

3.5 忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞Caspase-3活性的影響

如圖6所示，與對照組比較，忍冬藤提取物（50、75 mg/mL）組Caspase-3活性顯著升高（＜0.01）。

圖3 忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞 (A) 和143B細(xì)胞 (B) 存活率的影響()

圖4 忍冬藤提取物對HOS和143B細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖6 忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞Caspase-3活性的影響()

3.6 Z-VAD-FMK對HOS細(xì)胞存活率的影響

如圖7所示，與單獨(dú)給予忍冬藤提取物相比，聯(lián)用Z-VAD-FMK能夠顯著提高細(xì)胞存活率（＜0.05、0.01），表明忍冬藤提取物誘導(dǎo)HOS細(xì)胞凋亡具有Caspase-3相關(guān)性。

3.7 忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞線粒體膜電位的影響

如圖8所示，與對照組比較，各給藥組HOS細(xì)胞綠色熒光（JC-1 monomer）顯著增強(qiáng)（＜0.01），忍冬藤提取物（50、75 mg/mL）組細(xì)胞紅色熒光（JC-1 aggregate）顯著減弱（＜0.05、0.01），表明忍冬藤提取物能夠降低HOS細(xì)胞線粒體膜電位，呈劑量相關(guān)性。

與忍冬藤提取物（25 mg/mL）組比較：#P＜0.05；與忍冬藤提取物（50 mg/mL）組比較：**P＜0.01；與忍冬藤提取物（75 mg/mL）組比較：$$P＜0.01

3.8 忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達(dá)的影響

如圖9所示，與對照組比較，各給藥組HOS細(xì)胞Bax、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01）；忍冬藤提取物（50、75 mg/mL）組細(xì)胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3、Cyt-C、cleaved PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖8 忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞線粒體膜電位的影響()

圖9 忍冬藤提取物對HOS細(xì)胞Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達(dá)的影響()

4 討論

目前臨床常用放療結(jié)合外科技術(shù)治療骨肉瘤，但易產(chǎn)生耐藥性和嚴(yán)重的不良反應(yīng)，術(shù)后骨肉瘤患者5年生存率為70%，肺轉(zhuǎn)移患者5年生存率僅為20%，因此開發(fā)抑制骨肉瘤的新藥尤其重要[1,4]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種程序化形式，是細(xì)胞在生理或病理調(diào)節(jié)下啟動自身內(nèi)部機(jī)制，經(jīng)過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，結(jié)束自身生命的過程[5]。細(xì)胞凋亡因其不引起周圍組織炎性損傷而被認(rèn)為是殺死腫瘤細(xì)胞的最佳方式，是許多化療藥物清除腫瘤細(xì)胞的重要途徑[6]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是中藥發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制[7]。本研究采用忍冬藤提取物干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞，觀察其對骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為忍冬藤及其組方防治骨肉瘤提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本課題組前期分別以水、不同比例乙醇和甲醇提取忍冬藤，系統(tǒng)考察了不同提取物對骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)50%甲醇提取物的抑制作用最強(qiáng)，因此基于忍冬藤50%甲醇提取物開展后續(xù)研究。本研究結(jié)果顯示，忍冬藤提取物顯著抑制HOS和143B細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，提示忍冬藤提取物具有顯著的抗骨肉瘤作用；相同劑量下，忍冬藤提取物對HK-2細(xì)胞的抑制作用低于HOS和143B細(xì)胞，提示忍冬藤提取物在殺傷骨肉瘤細(xì)胞的同時，對正常人體細(xì)胞具有一定安全性；相同劑量下，HOS細(xì)胞對忍冬藤提取物更為敏感，故選取HOS細(xì)胞進(jìn)行凋亡機(jī)制的探究。

凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax和凋亡抑制蛋白Bcl-2同屬Bcl-2家族成員，在凋亡過程中起到重要作用[8]，Bax/Bcl-2比值的變化調(diào)控線粒體途徑細(xì)胞凋亡進(jìn)程[9]。Cyt-C存在于線粒體中，具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用[10]。Cyt-C自線粒體釋放至胞質(zhì)進(jìn)而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，Cyt-C的釋放受Bcl-2家族蛋白控制[11]。凋亡的發(fā)生是由Caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程，其中Caspase-3是最下游的凋亡最終執(zhí)行蛋白[12]。內(nèi)源性線粒體凋亡途徑中上游分子Caspase-9激活Caspase-3，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，切割DNA修復(fù)因子PARP等Caspase底物，從而使細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段[13-14]。本研究結(jié)果顯示，忍冬藤提取物能夠促使HOS細(xì)胞Caspase-3活化，Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK可以有效抑制忍冬藤提取物誘導(dǎo)的HOS細(xì)胞凋亡，表明忍冬藤提取物誘導(dǎo)HOS細(xì)胞凋亡具有Caspase-3相關(guān)性，提示Caspase-3的活化可能是忍冬藤提取物誘導(dǎo)HOS細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子機(jī)制。忍冬藤提取物能夠顯著降低HOS細(xì)胞線粒體膜電位，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9、Cyt-C和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平，表明忍冬藤提取物能夠通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)HOS細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為忍冬藤提取物上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)；增加線粒體膜的通透性，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，促使線粒體內(nèi)Cyt-C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，與銜接蛋白凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）相互作用，在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和dATP的協(xié)助下形成凋亡復(fù)合體，激活Caspase-9，進(jìn)一步激活Caspase-3，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

中藥的藥效是其復(fù)雜化學(xué)成分作用于機(jī)體生理病理過程的整體調(diào)節(jié)效應(yīng)，體現(xiàn)在多種化學(xué)成分通過多途徑、多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)部的動態(tài)平衡[15]。目前，主要基于金銀花對忍冬藤化學(xué)成分進(jìn)行研究，但二者來源于藥用植物忍冬的不同器官，植物不同器官生長發(fā)育節(jié)律不一，產(chǎn)生的初生與次生代謝產(chǎn)物的種類與含量也因此產(chǎn)生差異，故本研究基于UPLC-Q-TOF/MS對忍冬藤的化學(xué)成分進(jìn)行全面快速地定性分析[16-17]，鑒定出忍冬藤中有機(jī)酸類、三萜皂苷類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類和氨基酸類5種類型的36種化學(xué)成分，其中()-aldosecolo-ganin、金圣草素-7--新橙皮糖苷、cauloside A、精氨酸、酪氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸等成分為忍冬藤中首次報道，可能是忍冬藤誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)基礎(chǔ)，后續(xù)可以基于忍冬藤單體成分或成分群開展實(shí)驗(yàn)，探討各成分間的協(xié)同、加和甚至拮抗作用，進(jìn)一步闡明忍冬藤抗腫瘤的作用機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of apoptosis induced byextract on osteosarcoma cells

YAN Bao-fei1, 2, DUAN Jin-ao2, ZHANG Jing-zheng1, LIU Sheng-jin2, LIU Jia1, MAO Yi-bei1, ZENG Qing-qi1, 3

1. Jiangsu Health Vocational College, Nanjing 211800, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources Recycling Utilization, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. The First Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, China

To investigate the proliferation and apoptosis effects and mechanism ofextract on human osteosarcoma cells.Chemical constituents ofextract were characterized by UPLC-Q-TOF/MS. MTT method was used to detect the effect ofextract on survival rate of human osteosarcoma cells HOS and 143B and human renal cortex proximal tubule epithelial cells HK-2; Fluorescence microscope was used to observe the effect ofextract on apoptosis of HOS and 143B cells; Annexin V/PI double staining method was used to detect the effect ofextract on apoptosis of HOS cells; JC-1 staining method was used to detect the effect ofextract on mitochondrial membrane potential of HOS cells; Western blotting method was used to detect the effect ofextract on expressions of B cell lymphoma 2 associated X protein (Bax), B cell lymphoma 2 (b-cell lymphoma-2, Bcl-2), activated cysteine protease-3 (cleaved Caspase-3), cleaved poly ADP-ribose polymerase (cleaved PARP), cleaved Caspase-9 and cytochrome-c (Cyt-C) in HOS cells.A total of 36 chemical components of five types, including organic acids, triterpene saponins, flavonoids, iridoids and amino acids, were identified inextract.extract inhibited the survival rate of HOS and 143B cells, and significantly induced HOS cells apoptosis (< 0.01). Caspase-3 inhibitor Z-VAD-FMK significantly inhibited HOS cells apoptosis induced byextract (< 0.05, 0.01);extract significantly increased Caspase-3 activity in HOS cells (< 0.01), changed mitochondrial membrane potential of HOS cells (< 0.05, 0.01), increased expressions of Bax, cleaved Caspase-3, cleaved PARP, cleaved Caspase-9, Cyt-C and Bax/Bcl-2 in HOS cells (< 0.05, 0.01), down-regulated Bcl-2 expression (< 0.05, 0.01).extract can inhibit the proliferation of osteosarcoma cells and induce apoptosis through mitochondrial apoptosis. The mechanism may be related to down-regulation of Bcl-2 expression, up-regulation of Bax, cleaved Caspase-3, cleaved PARP, cleaved Caspase-9 and Cyt-C expression, and activation of Caspase cascade reaction.

Thunb.; osteosarcoma; apoptosis; mechanism; UPLC-Q-TOF/MS

R285.5

A

0253 - 2670(2021)13 - 3923 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.016

2021-01-14

國家中醫(yī)管理局名醫(yī)驗(yàn)方評價與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)研究室開放課題（NZYJDMF-2020001）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK20191498）；江蘇省衛(wèi)生健康委醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目（ZDB2020020）；浦口區(qū)科技發(fā)展社會事業(yè)項(xiàng)目（S2020-14）；江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院校級課題重點(diǎn)項(xiàng)目（JKA201916）

嚴(yán)寶飛，男，碩士，助教，主要從事中藥資源學(xué)研究。Tel: (025)68172750 E-mail: baofeiy@163.com

劉 嘉，男，碩士，副教授，主要從事中藥資源學(xué)研究。Tel: (025)68172750 E-mail: liujia402@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]