低壓貯藏對楊梅果實抗氧化及其細胞膜透性的影響

鄭俊峰，謝建華*，龐杰

（1.漳州職業(yè)技術學院食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2.農產品深加工及安全福建省高校應用技術工程中心，福建 漳州 363000；3.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

低壓（low-pressure，LP）貯藏屬不凍結真空保鮮技術[1]，因其低能耗、無污染等特點[2-3]，廣泛應用于番木瓜[4]、鴨梨[5]、桃[6]、芒果[7]、藍莓[8]等采后貯藏，具有良好的保鮮效果。 成熟水果采后其抗氧化酶活性易下降，非酶類抗氧化物質易流失，機體內產生的活性氧自由基不斷增多。 低壓貯藏可為鮮果提供持續(xù)不間斷的“低壓、低溫、高濕、換氣”的貯藏環(huán)境，誘導其內源非酶類抗氧化物質[如抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）等]和酶類抗氧化物質[如過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等]產生抗氧化，延緩膜脂過氧化，保護細胞膜結構，降低生理障礙或病害風險，延長貯藏壽命[1，9]。

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc）原產于我國，福建、浙江、廣東、江西等長江以南地區(qū)為主產區(qū)，其果實色澤鮮艷、酸甜可口、風味獨特、營養(yǎng)豐富，深受消費者喜歡[10]。 但楊梅成熟期、采收期集中在高溫梅雨季節(jié)，果肉鮮嫩且無外果皮包裹，采后極不耐貯藏保鮮，易發(fā)生組織衰老、腐爛劣變等問題，貨架期短、損耗率大，已嚴重制約鮮楊梅產業(yè)的發(fā)展。研究表明，楊梅果實采后組織衰老、腐爛劣變與活性氧代謝有關，其代謝失調可誘導膜脂過氧化作用加強，細胞膜透性增加，加速組織衰老腐爛進程[11-12]。 目前，對楊梅果實采后貯藏保鮮技術的研究主要集中在貯前減壓預處理[4]、1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）和熱處理[13]、NO 處理[14]和低溫貯藏[15]、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）[16]單獨或復合使用等方法，而研究低壓貯藏對楊梅果實細胞膜透性與抗氧化關系，探討其影響衰老腐爛機制尚較少見報道。 本試驗以“安海變”楊梅果實為試驗材料，2 ℃～4 ℃溫度條件下，設置常壓貯藏為對照（control check，CK），研究低壓（LP，0.05 MPa）貯藏對楊梅果實的細胞膜透性及其抗氧化性的影響，并監(jiān)測貯藏期間細胞膜透性（cell membrane permeability，CMP）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和內源抗氧化物質AsA、脯氨酸（proline，Pro），以及SOD、CAT、POD、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）等抗氧化酶有關生理生化指標變化，旨在進一步闡明低壓貯藏對楊梅果實抗氧化機制及其對細胞膜透性的影響，以期為調控楊梅果實采后衰老生理、延長保鮮期提供理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

以漳州浮宮鎮(zhèn)果園“安海變”楊梅品種為試材，挑選成熟度一致、大小均一、無碰傷、無病蟲害的果實，用厚為0.05 mm 的塑料袋分裝，每袋為500 g 左右，膠帶封口，分兩組進行處理：CK 為常壓貯藏于2 ℃～4 ℃條件下；LP 為0.05 MPa 壓力貯藏于2 ℃～4 ℃的溫度條件下。 貯藏期為16 d，每隔4 d 取樣1 次，測定各項理化指標，每項指標重復3 次。

1.2 設備與試劑

1.2.1 主要設備

721 型分光光度計：上海第三分析儀器廠；80-2 型離心機： 上海浦東物理光學儀器廠；PHS-25 型電位計：上海精科雷磁公司。

1.2.2 主要試劑

2，6-二氯靛酚鈉：生工生物工程（上海）股份有限公司；茚三酮：沈陽先創(chuàng)化工有限公司；過氧化氫、乙二胺四乙酸二鈉、曲拉通（TritonX-100）、三氯乙酸：西隴化工股份有限公司；氮藍四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）、甲硫氨酸、核黃素、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）：北京索萊寶科技有限公司。 以上試劑均為分析純。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 AsA 含量測定

參考GB 5009.86—2016《食品安全國家標準食品中抗壞血酸的測定》[17]方法，從10 個果實中取果肉5 g，研磨均漿離心，提取上清液定容至10 mL，采用2，6-二氯靛酚滴定法測定楊梅果實中AsA 含量， 結果以mg/100 g 表示。

1.3.2 Pro 含量測定

參考丁改秀等[18]的方法，隨機取10 個楊梅果實，取果肉5 g，研磨勻漿離心，提取上清液定容至10 mL，采用酸性茚三酮法測定楊梅果實中Pro 含量， 結果以mg/100 g 表示。

1.3.3 SOD 活性測定

參考曹建康等[19]的方法，從10 個楊梅果實取果肉5 g，研磨勻漿離心，提取上清液定容至20 mL 得到酶液， 采用NBT 光還原法測定SOD 活性， 結果以U/g FW 表示。

1.3.4 CAT 活性測定

參考SI 等[20]的方法，酶液提取同SOD，采用紫外吸收法測定CAT 活性，結果以U/g FW 表示。

1.3.5 POD 活性測定參考曹建康等[21]的方法，酶液提取同SOD，采用愈創(chuàng)木酚比色法測定POD 活性，結果以U/g FW 表示。

1.3.6 PPO 活性測定參考田世平等[22]的方法，酶液提取同SOD，采用鄰苯二酚比色法測定PPO 活性，結果以U/g FW 表示。

1.3.7 MDA 含量測定

參考李合生[23]的方法加以改進，從10 個楊梅果實中取果肉2 g，研磨勻漿離心，提取上清液定容至20 mL，采用硫代巴比妥酸法測定MDA 含量，結果以mmol/g表示。

1.3.8 CMP 測定

參考高俊鳳[24]的方法，取5 個楊梅果實放入燒杯，加入400 mL 蒸餾水，采用電導率方法測定CMP，結果以%表示。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2017 軟件進行數據統計和制圖，采用SPSS22.0 統計軟件對數據進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 楊梅果實低壓貯藏過程中AsA 含量的變化

AsA 是果蔬內源抗氧化物質， 可清除活性氧（reactive oxygen species，ROS），抑制膜脂過氧化[25]。 楊梅果實低壓貯藏過程中ASA 含量的變化見圖1。

圖1 楊梅果實低壓貯藏過程中ASA 含量的變化Fig.1 Changes of AsA content in bayberry fruit during low pressure storage

如圖1 所示，楊梅果實AsA 含量變化呈先升后降趨勢，這可能是由于其貯藏前期進一步成熟使AsA 含量出現上升，而在后期衰老消耗導致其逐漸下降。 CK在0～4 d 出現上升，第4 天之后快速下降，LP 在0～8 d出現上升，第8 天之后較緩下降，且在8 d～16 d 其AsA含量顯著高于CK（P＜0.05），說明低壓貯藏延緩了楊梅果實AsA 含量峰值的出現，且明顯抑制貯藏后期AsA含量的下降，可有效保持抗氧化能力，抑制楊梅果實組織膜脂過氧化。

2.2 楊梅果實低壓貯藏過程中Pro 含量的變化

Pro 既是果蔬組織細胞質內滲透調節(jié)物質， 也是內源抗氧化劑，可參與清除超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH）[26]。楊梅果實低壓貯藏過程中Pro含量的變化見圖2。

圖2 楊梅果實低壓貯藏過程中Pro 含量的變化Fig.2 Changes of Pro content in bayberry fruit during low pressure storage

如圖2 所示， 楊梅果實Pro 含量在貯藏期間呈上升趨勢，0～8 d，LP 與CK 的楊梅果實Pro 含量變化均不明顯，CK 的Pro 含量第8 天快速上升，而LP 在8 d～12 d 保持穩(wěn)定，在第12 天后較快上升，且在12 d～16 d顯著低于CK（P＜0.05），說明低壓貯藏可明顯延緩楊梅果實貯藏后期Pro 含量上升，提高其貯藏后期抗氧化能力，減輕氧化傷害。

2.3 楊梅果實低壓貯藏過程中SOD 活性的變化

SOD 可將采后果蔬組織中積累的O2-·歧化為過氧化氫（H2O2）和O2。楊梅果實低壓貯藏過程中SOD 活性的變化見圖3。

圖3 楊梅果實低壓貯藏過程中SOD 活性的變化Fig.3 Changes of SOD activity in bayberry fruit during low pressure storage

如圖3 所示，CK 的SOD 活性在0～12 d 逐漸上升且高于LP，第12 天達到峰值后再迅速下降；LP 的SOD活性在0～4 d 出現下降，之后緩慢上升，第16 天高于CK，說明低壓可較穩(wěn)定保持楊梅果實貯藏前中期較低水平SOD 活性， 并使其在貯藏后期保持較高SOD 活性，進而減少細胞內O2-·累積，這與王曉丹等[4]、王友升等[27]研究結果類似。SOD 活性受到O2-·產生速率誘導，研究發(fā)現，LP 的SOD 活性在4 d～12 d 顯著低于CK（P<0.05），這可能是由于低壓貯藏環(huán)境抑制O2-·產生速率，減少O2-·積累，使其SOD 活性保持較低水平[28]。

2.4 楊梅果實低壓貯藏過程中CAT 活性的變化

CAT 以H2O2為底物，可將其分解為H2O 和O2。 楊梅果實低壓貯藏過程中CAT 活性的變化見圖4。

圖4 楊梅果實低壓貯藏過程中CAT 活性的變化Fig.4 Changes of CAT activity in bayberry fruit during low pressure storage

如圖4 所示，楊梅果實CAT 活性變化呈前降中升后降趨勢。 冷藏0～12 d 期間，CK 的CAT 活性均高于LP，其中，8 d～12 d，LP 顯著低于CK（P<0.05），這可能是由于低壓貯藏抑制楊梅果實H2O2生成速率， 減少H2O2積累，使其CAT 活性保持較低水平，這與黃海英等[29]研究結果一致。CK 和LP 分別于第8、12 天達到峰值，12 d～16 d，CK 快速下降， 而LP 緩慢下降， 第16天，LP 的CAT 活性高于CK。 說明低壓可較穩(wěn)定維持楊梅果實貯藏前中期較低水平CAT 活性，延遲貯藏中期CAT 活性峰值出現， 抑制貯藏后期CAT 活性快速下降，對保持CAT 活性具有一定作用。

2.5 楊梅果實低壓貯藏過程中POD 活性的變化

POD 是清除自由基的保護酶[30]。 楊梅果實低壓貯藏過程中POD 活性的變化見圖5。

圖5 楊梅果實低壓貯藏過程中POD 活性的變化Fig.5 Changes of POD activity in bayberry fruit during low pressure storage

如圖5 所示，CK 和LP 在0～4 d 均緩慢下降，CK在4 d～12 d 較快上升，隨后降低；而LP 在4 d～16 d 緩慢上升，整個貯藏過程，LP 的POD 活性均低于CK，且12 d～16 d 差異顯著（P<0.05），這可能與LP 導致楊梅果實組織內自由基積累較少有關。 說明低壓貯藏能較明顯抑制楊梅果實POD 活性，減輕楊梅果實膜脂過氧化程度。

2.6 楊梅果實低壓貯藏過程中多酚氧化酶（PPO）活性的變化

PPO 是參與酶促褐變的關鍵酶。 楊梅果實低壓貯藏過程中PPO 活性的變化見圖6。

圖6 楊梅果實低壓貯藏過程中PPO 活性的變化Fig.6 Changes of PPO activity in bayberry fruit during low pressure storage

如圖6 所示，CK 的PPO 活性先升后降，第8 天達到峰值；而整個貯藏過程中，LP 在0～12 d 保持較穩(wěn)定水平，隨后逐漸上升，第16 天高于CK，且在4 d～12 d的PPO 活性極顯著低于CK（P<0.01），這可能是由于低壓貯藏環(huán)境有效保持楊梅果實組織細胞膜系統的穩(wěn)定，減少其與底物酚類物質接觸，且與低壓導致O2的分壓較低有關。 這說明低壓貯藏可明顯抑制楊梅果實的PPO 活性，延緩采后褐變，減慢生理老化過程。

2.7 楊梅果實低壓貯藏過程中MDA 含量的變化

MDA 是膜脂過氧化作用的產物，也是評價膜脂過氧化程度的重要指標[31]。 楊梅果實低壓貯藏過程中MDA 含量的變化見圖7。

圖7 楊梅果實低壓貯藏過程中MDA 含量的變化Fig.7 Changes of MDA content in bayberry fruits during low pressure storage

如圖7 所示，MDA 含量呈上升趨勢，LP 的MDA含量始終低于CK。CK 在0～4 d 上升較慢，之后加快上升，而LP 在0～12 d，上升較慢，第12 天后迅速上升，且在8 d～16 d 顯著低于CK（P<0.05）。 說明低壓貯藏明顯延緩MDA 含量上升，減輕楊梅果實膜脂過氧化。

2.8 楊梅果實低壓貯藏過程中CMP 的變化

果蔬采后貯藏過程中， 隨后熟衰老進程不斷推進，其細胞結構會受到破壞，從而使CMP 增加。楊梅果實低壓貯藏過程中CMP 的變化見圖8。

圖8 楊梅果實低壓貯藏過程中CMP 的變化Fig.8 Changes of CMP during low pressure storage of bayberry fruit

如圖8 所示，楊梅果實的CMP 呈上升趨勢，但LP的CMP 在整個貯藏過程中低于CK， 且在8 d～16 d 顯著低于CK（P<0.05），說明低壓貯藏可明顯延緩楊梅果實CMP 上升，較好維持楊梅果實細胞膜結構。

2.9 楊梅果實低壓貯藏過程中細胞膜透性（CMP）和抗氧化各指標之間的相關性分析

楊梅果實低壓貯藏過程中CMP 和抗氧化各指標之間的相關性分析結果見表1。

如表1 所示，在低壓貯藏過程中，楊梅果實CMP與不同抗氧化指標的相關性不太一致，各抗氧化指標之間的相關性也不太一致。 CMP 與MDA 之間呈顯著正相關（R=0.902，P<0.05），與POD 之間呈極顯著正相關（R=1.000，P<0.01）；而MDA 與Pro、PPO 呈極顯著正相關（P<0.01），R 值分別為0.990、0.962，與POD呈顯著正相關（R=0.902，P<0.05），PPO 與SOD、Pro 之間呈顯著正相關（P<0.05），R 值分別為0.950、0.944，其他指標與上述指標之間相關性不顯著。 以上結果表明， 楊梅果實CMP 越高， 其MDA、Pro 含量和POD、PPO、SOD 活性就越高。 綜上所述，低壓貯藏誘導楊梅果實組織降低MDA 積累，延緩細胞膜透性上升，主要是抗氧化物質Pro 和抗氧化相關酶POD、PPO、SOD 等關鍵指標發(fā)揮主導作用，而AsA、CAT 作用較不明顯。

3 結論

低壓貯藏可有效抑制引起生鮮園藝產品成熟衰老有關酶的活性，降低生鮮園藝產品的生理障礙或病害的風險，延長保鮮期[9]。 本研究結果表明，采用低壓（LP，0.05 MPa） 貯藏可誘導楊梅果實啟動抗氧化保護機制，延緩了其內源抗氧化物質AsA 高峰出現、限制AsA 含量下降和Pro 含量上升； 延遲Pro 含量急劇上升，有效維持SOD、CAT 活性在貯藏中期逐步上升；在貯藏后期保持較高活性； 可明顯抑制POD 和PPO 活性，提高楊梅果實低溫逆境抗氧化能力；減輕MDA 積累和膜脂過氧化程度；明顯延緩CMP 上升，使其在貯藏第16 天時CMP 仍保持在10%以下。 這說明LP 貯藏可較好地保護楊梅果實組織細胞膜結構，有效維持楊梅果實冷藏期間的正常生理代謝，進一步延緩其衰老劣變進程。 進一步分析楊梅果實低壓貯藏過程中CMP 與抗氧化各指標之間的相關性發(fā)現，LP 貯藏楊梅果實CMP 與MDA 之間呈顯著正相關（R=0.902，P<0.05），與POD 之間呈極顯著正相關（R=1.000，P<0.01）；而MDA 與Pro、PPO 極顯著正相關（P<0.01），R 值分別為0.990、0.962，與POD 呈顯著正相關（R=0.902，P<0.05），PPO 與SOD、Pro 之間呈顯著正相關（P<0.05），R 值為0.950、0.944，其他指標與上述指標之間相關性不顯著。這說明低壓貯藏楊梅果實抗氧化機理主要是通過調節(jié)內源抗氧化物質Pro 和抗氧化相關酶POD、PPO、SOD 等關鍵指標，從而降低果實MDA 積累，延緩CMP上升， 而AsA、CAT 在楊梅果實低壓貯藏過程中的作用較不明顯。 其研究結果可為后續(xù)開發(fā)楊梅果實低壓貯藏保鮮技術提供理論參考和實踐指導。

低壓貯藏保鮮技術是一項復雜的系統工程，涉及持續(xù)低分壓O2、CO2、NH3、C2H4等氣體環(huán)境和低溫、高濕、換氣等技術因素，其誘導活性氧代謝的應激反應、能量代謝的響應以及延緩后熟衰老進程等更深層次機制有待深入探討研究，同時還要解決好減壓、冷藏、加濕換氣等設施的技術工藝及參數匹配問題，在研究和實踐中不斷完善，以期獲得更加廣闊的市場應用。