肌少-骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型及評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展

鄭浩 姚嘯生 路翀 杜一峰 葉嘉杰 于紅衛(wèi)

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032

肌少-骨質(zhì)疏松癥(osteo-sarcopenia，OS)是肌少癥(sarcopenia，SP)與骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)協(xié)同致病的結(jié)果[1]。隨著社會(huì)人口老齡化的程度日益加劇，OS的發(fā)病率也在逐年上漲[2]。一項(xiàng)研究征集了2 353名社區(qū)老年人，發(fā)現(xiàn)60～64歲的男性O(shè)S發(fā)病率為14.3%，而女性O(shè)S的發(fā)病率高達(dá)20.3%[3]。其中SP是以年齡相關(guān)的肌肉質(zhì)量損失、肌肉力量降低和(或)機(jī)體活動(dòng)性功能減退為主要特征的退行性疾病[4]；OP屬于全身性骨病范疇，以骨量降低、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化以及骨的脆性增加為主要特征[5]。當(dāng)兩者協(xié)同致病時(shí)，一定程度上增加了老年人跌倒的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致脆性骨折的發(fā)病率大幅上升[6]，嚴(yán)重影響了老年人的健康并給社會(huì)醫(yī)療帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)[7-8]。

為了深入研究OS的病理機(jī)制并研制有效的臨床藥物，構(gòu)建切實(shí)有效的OS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型至關(guān)重要。本文以鼠為主要模型動(dòng)物，介紹衰老OS模型、去勢(shì)OS模型、化學(xué)誘導(dǎo)OS模型、廢用OS模型以及基因OS模型的研究進(jìn)展，對(duì)不同造模方式的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍進(jìn)行綜述，并簡(jiǎn)述OS模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1 動(dòng)物模型

1.1 衰老OS模型

衰老是大多數(shù)肌骨疾病的主要危險(xiǎn)因素，因此衰老模型被廣泛應(yīng)用于OS的研究中[9]。大鼠的預(yù)期壽命約為24個(gè)月，對(duì)比大鼠與人腦衰老過(guò)程中銅通量的改變，推算出18～24月齡的大鼠相當(dāng)于56～69歲的人類(lèi)[10]。Kim等[11]研究發(fā)現(xiàn)18月齡C57BL/6J鼠的骨骼肌質(zhì)量、骨骼肌力量以及運(yùn)動(dòng)能力均明顯低于10周齡的鼠，提示18月齡的C57BL/6J鼠可能存在SP。在Zhu等[12]的研究中，15月齡雌性SD大鼠的腰椎和雙側(cè)股骨骨密度(bone mineral density，BMD)以及骨礦含量明顯低于3月齡大鼠，提示15月齡的大鼠符合OP自然衰老模型。因此推測(cè)構(gòu)建OS自然衰老模型可以選用18月齡鼠。除了月齡，大鼠的性別對(duì)衰老模型也有一定的影響，由于雄鼠比雌鼠壽命更長(zhǎng)，且雌鼠會(huì)分泌大量雌激素，不利于模型的建構(gòu)，因此大多數(shù)研究?jī)A向于選擇雄鼠進(jìn)行造模[13]。

由于自然衰老模型建模周期較長(zhǎng)，為了縮短衰老OS的建模時(shí)間，研究人員給予大鼠高脂飲食，因?yàn)楦咧嬍呈且环N公認(rèn)的衰老加速器[14]。Hu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食模型鼠肌細(xì)胞的再生能力和分化能力嚴(yán)重受損。不僅如此，高脂飲食帶來(lái)的肥胖還會(huì)增加炎癥細(xì)胞因子[16]以及降低脂聯(lián)素的表達(dá)水平[17]，從而導(dǎo)致BMD下降[16-17]，因此高脂飲食能加速構(gòu)建衰老OS模型的。除外高脂飲食還可以選用衰老加速易感鼠(senescence accelerated mouse/ prone，SAMP)進(jìn)行造模，Azuma等[18]研究發(fā)現(xiàn)SAMP6鼠骨小梁形成明顯減少，而骨髓中脂肪含量明顯增多，是理想的加速衰老OP模型。Guo等[19]深入研究還發(fā)現(xiàn)8月齡的SAMP8鼠處于SP早期，而10月齡的SAMP8鼠則已經(jīng)處于SP階段。因此可以配合高脂飲食或選用SAMP鼠建構(gòu)加速衰老的OS模型。

1.2 去勢(shì)OS模型

去勢(shì)作為目前較為公認(rèn)的OP造模方式，其起源可追溯到1969年，Saville等[20]通過(guò)手術(shù)摘除大鼠雙側(cè)卵巢(OVX)，隨后發(fā)現(xiàn)大鼠表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松癥狀。深入研究發(fā)現(xiàn)雌性SD大鼠去勢(shì)后，體內(nèi)雌二醇(E2)水平明顯下降，導(dǎo)致促卵泡素以及促黃體生成素的分泌量上升，從而影響骨代謝，破骨大于成骨，骨量下降最終發(fā)展為OP[21]。Wang等[22]以及Wen等[23]的研究也解釋了其中的原理，研究發(fā)現(xiàn)去勢(shì)大鼠體內(nèi)miR125b水平上升，過(guò)表達(dá)的miR125b能通過(guò)miR-125b-TRAF6通路促進(jìn)骨質(zhì)疏松[22]。除此之外去勢(shì)還會(huì)影響腸道菌群，并通過(guò)“菌群-腸道-代謝-骨”影響骨代謝，導(dǎo)致OP[23]。

去勢(shì)導(dǎo)致的低E2狀態(tài)還在一定程度上降低鼠骨骼肌的質(zhì)量和力量，Karvinen等[24]在OVX術(shù)后6周處死模型鼠，從腓腸肌中分離出RNA，分析發(fā)現(xiàn)E2的下降影響了凋亡相關(guān)的microRNAs，導(dǎo)致肌細(xì)胞凋亡增加，骨骼肌質(zhì)量下降，最終模型鼠出現(xiàn)SP。Ezzat-Zadeh等[25]將10月齡的SD雌性大鼠去勢(shì)后繼續(xù)飼養(yǎng)5個(gè)月，隨后進(jìn)行大鼠的運(yùn)動(dòng)能力、肌骨形態(tài)學(xué)以及血清檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)模型鼠活動(dòng)量顯著減少、骨量下降9.6%，骨骼肌質(zhì)量與體重比下降10.5%，結(jié)合血清指標(biāo)提示OVX術(shù)后6周的SD雌性鼠同時(shí)存在骨質(zhì)疏松和骨骼肌萎縮，即成功構(gòu)建了OS模型。

1.3 化學(xué)誘導(dǎo)OS模型

化學(xué)誘導(dǎo)法是通過(guò)將誘導(dǎo)肌骨退變的物質(zhì)直接注射或灌入模型體內(nèi)從而誘發(fā)OS。構(gòu)建化學(xué)誘導(dǎo)模型最常用化學(xué)物質(zhì)的是糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)，研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期應(yīng)用GC會(huì)帶來(lái)肌肉萎縮[26]、皮質(zhì)骨和小梁骨強(qiáng)度降低等副作用[27-28]。深入研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期應(yīng)用GC能通過(guò)影響腸道菌群[29]以及氧化應(yīng)激反應(yīng)[30]導(dǎo)致骨丟失。同時(shí)Massaccesi等[31]以及Nakashima等[32]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用地塞米松(DXM)會(huì)上調(diào)O-GlcNAcylation[31]以及atrogin-1/MAFbx[32]的表達(dá)水平，導(dǎo)致肌肉萎縮。

在Aru等[334]的研究中，雌性Wistar大鼠在連續(xù)注射DXM后，出現(xiàn)大鼠體重和瘦體重下降，同時(shí)后肢抓力下降了25%，認(rèn)為成功構(gòu)建了SP模型。Yang等[34]給8周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠以1 mg/kg的劑量注射DXM每周2次。12周后進(jìn)行雙側(cè)股骨和第5腰椎BMD、micro-CT以及骨生物力學(xué)檢查，同時(shí)檢測(cè)骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)DXM化學(xué)誘導(dǎo)后大鼠的BMD、骨微觀結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)指標(biāo)均顯著下降，提示OP模型構(gòu)建成功。而在Pal等[35]的研究中，大鼠連續(xù)4周每天皮下注射5 mg/kg的甲基強(qiáng)的松龍(MP)，通過(guò)micro-CT、骨強(qiáng)度以及肌骨形態(tài)學(xué)等檢測(cè)結(jié)果判定OS模型構(gòu)建成功。

1.4 廢用OS模型

廢用模型有多種不同的構(gòu)建方式，例如后肢懸吊/卸載(HLS/HLU)、脊髓損傷(SCI)、注射肉毒桿菌毒素(BTX)以及石膏繃帶固定等[36]。Mankhong等[37]的研究表明HLS能通過(guò)破壞誘導(dǎo)氧化失衡、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)以及蛋白平衡失衡等多種方式誘導(dǎo)肌肉萎縮，并且HLS已被證實(shí)可以模擬臨床SP患者[38]。研究發(fā)現(xiàn)，在廢用模型中骨骼受到的機(jī)械負(fù)荷明顯減少，導(dǎo)致骨量迅速喪失[39]。Peres-Ueno等[40]的研究結(jié)果證明了這一觀點(diǎn)，將26月齡的雌性Wistar大鼠實(shí)施HLU，3周后發(fā)現(xiàn)HLU大鼠股骨BMD明顯下降，骨微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重惡化。因此，HLS/HLU能成功構(gòu)建OS模型。

Brent等[41]將4 IU的BTX注射到12～14周齡雌性Wistar大鼠右后肢骨骼肌中，6周后通過(guò)雙能X線吸收法(DXA)、μCT、力學(xué)測(cè)試以及肌骨形態(tài)學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)廢用模型的肌肉質(zhì)量下降63%，骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)下降28%，骨小梁厚度(Tb.Th)減小11%，骨干皮質(zhì)厚度降低10%，股骨遠(yuǎn)端干骺端骨強(qiáng)度降低27%，提示BTX成功構(gòu)建了OS模型。在Yarrow等[42]的研究中，使用14周齡的雄性大鼠制造SCI模型，在損傷后21 d，發(fā)現(xiàn)SCI大鼠的骨小梁數(shù)量減少70%，Tb.Th減少13%～27%，小梁分離增加，除此之外還發(fā)現(xiàn)SCI大鼠小腿三頭肌肌量減少35%，提示SCI能成功構(gòu)建OS模型。

1.5 基因OS模型

基因模型的造模方式主要有轉(zhuǎn)基因造模法和基因突變?cè)炷７?，其中轉(zhuǎn)基因造模法多是指采用基因敲除的方式來(lái)構(gòu)建動(dòng)物模型。研究表明慢性炎癥是導(dǎo)致SP重要病機(jī)之一，Ko等[43]研究現(xiàn)IL-10缺失模型鼠骨骼肌中的三磷酸腺苷合成率下降，線粒體功能明顯受損，除此之外，IL-10基因的純合子缺失在一定程度上會(huì)促進(jìn)NF-κB炎癥介質(zhì)的表達(dá)。因此該模型可以模擬人身體炎癥、肌肉無(wú)力以及整體活動(dòng)降低的狀態(tài)[43]。另一種常用的基因敲除模型是銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)敲除鼠，Sataranatarajan等[44]研究發(fā)現(xiàn)SOD1缺失的模型鼠在5月齡時(shí)就表現(xiàn)出多種SP的典型表型。而在使用基因敲出制造OP模型時(shí)多選擇敲除雌激素受體α/β或芳香酶，研究表明這種模型具有全身骨質(zhì)疏松且不受外界因素干預(yù)等特性[45]。除此之外，研究表明目前至少有100多種目的基因與OP存在密切聯(lián)系，例如OPG、RANKL、RUNX2以及VEGF等[46]。

2 不同造模方式的特點(diǎn)及應(yīng)用范圍

5種造模方式均可以成功構(gòu)建OS動(dòng)物模型，不同的建模方法均有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的、方向、設(shè)備以及時(shí)間等因素選用最佳的造模方式[47]。

(1)自然衰老模型能最大程度地反映衰老的過(guò)程，該模型適用于正常衰老相關(guān)OS的研究，但該模型需要花費(fèi)大量時(shí)間構(gòu)建，花費(fèi)大量人力及時(shí)間成本。為了解決自然衰老模型建模時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，研究人員使用高脂飲食加速模型衰老，但是該模型伴隨體脂增高，是老年肥胖OS的理想模型，但不適用于瘦體質(zhì)老年OS。另一種加速衰老的SAMP模型無(wú)法體現(xiàn)衰老引起的OS，但因其建模周期短，可用于研究各種干預(yù)措施對(duì)OS的影響。(2)去勢(shì)模型的特征是能模擬雌激素缺失引起的肌骨退變，因此是女性絕經(jīng)后OS的理想模型，無(wú)法模擬老年男性O(shè)S，除此之外，去勢(shì)手術(shù)需要操作人員具備一定的外科手術(shù)技術(shù)，且麻醉及手術(shù)過(guò)程對(duì)動(dòng)物都是不可忽視的損傷。(3)臨床上存在一部分人群需要長(zhǎng)期大量應(yīng)用激素等化學(xué)物質(zhì)，其患OS的概率高于正常人，研究這類(lèi)人群的OS需要應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)模型?；瘜W(xué)誘導(dǎo)模型的缺點(diǎn)在于化學(xué)藥物的種類(lèi)多，且用法用量缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。(4)在廢用模型中，HLS構(gòu)建的模型是一種與運(yùn)動(dòng)無(wú)關(guān)的OS模型，能模擬術(shù)后長(zhǎng)期臥床引起OS，但是HLS操作較為復(fù)雜，并且需要定期檢驗(yàn)制動(dòng)是否失效；使用BTX構(gòu)建模型，造模時(shí)間短，但存在模型致死的風(fēng)險(xiǎn)；SCI建構(gòu)的OS模型能很好地模擬脊髓損傷患者的OS，其缺點(diǎn)在于應(yīng)用范圍有限。(5)基因模型能較快地建立OS模型，并且其靶向性明確，其缺點(diǎn)是沒(méi)有正常衰老的特征，除此之外，基因模型一次只能有一兩個(gè)基因被敲除，難以探究基因之間的相互作用。

除此之外，還有研究人員將兩種造模方式結(jié)合使用，例如去勢(shì)結(jié)合糖皮質(zhì)激素構(gòu)建OS模型[48]，這種模型肌肉萎縮以及骨質(zhì)疏松的程度更高，雖然對(duì)應(yīng)臨床上這樣的患者數(shù)量較少，但是可以應(yīng)用于嚴(yán)重OS的研究。

3 OS模型的評(píng)價(jià)方法

3.1 骨骼肌相關(guān)評(píng)價(jià)方法

骨骼肌相關(guān)指標(biāo)主要圍繞著骨骼肌的力量、骨骼肌的質(zhì)量以及骨骼肌的功能3個(gè)方面展開(kāi)。其中骨骼肌力量可應(yīng)用抓力測(cè)定儀通過(guò)測(cè)量鼠前肢或四肢抓力判斷[49]；骨骼肌質(zhì)量則可以通過(guò)CT、MRI、DXA或生物電阻抗分析，其中CT和MRI可以最直接、最準(zhǔn)確地測(cè)量肌肉質(zhì)量[50]；骨骼肌功能則可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)器試驗(yàn)[51]或水迷宮實(shí)驗(yàn)[52]反應(yīng)。除此之外，骨骼肌的微觀形態(tài)也是重要觀測(cè)指標(biāo)。

3.2 骨相關(guān)評(píng)價(jià)方法

骨相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有BMD、骨生物力學(xué)、骨形態(tài)和骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)。其中BMD是診斷OP的關(guān)鍵指標(biāo)，測(cè)量BMD的最常用方法是DXA[53]，而micro-CT也是常用的BMD測(cè)量方法，并且micro-CT還能觀察骨的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)[54]；骨生物力學(xué)可以判斷骨的強(qiáng)度、硬度和韌性，多通過(guò)三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)以及疲勞實(shí)驗(yàn)等方法測(cè)量；骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)則是通過(guò)測(cè)量血鈣、血磷、成骨指標(biāo)以及破骨標(biāo)志來(lái)判斷骨代謝水平。

4 小結(jié)

OS病理機(jī)制的核心是骨骼肌與骨的退變，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌與骨組織在生物力學(xué)以及內(nèi)分泌等多個(gè)方面存在密切聯(lián)系，例如骨骼肌分泌的肌抑素、鳶尾素等肌動(dòng)因子，不僅能調(diào)節(jié)骨骼肌生長(zhǎng)，還在一定程度上影響骨代謝[55]。而中醫(yī)學(xué)“骨肉不相親”理論中也有“故骨髓不濡，即肉不著骨，骨肉不相親，即肉濡而卻，肉濡而卻……骨先死”的論述，深刻地闡釋了肌骨退變之間的聯(lián)系。提示骨骼肌與骨的退變多協(xié)同發(fā)生，這是文中5種造模方式能成功構(gòu)建OS模型的理論基礎(chǔ)。但OS屬于進(jìn)展性的長(zhǎng)病程疾病，現(xiàn)階段的動(dòng)物模型多側(cè)重于表現(xiàn)OS的某種病因或某一階段的病理改變，不能完全體現(xiàn)人類(lèi)患OS的病理變化過(guò)程。并且不同的造模方式都有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需對(duì)應(yīng)OS的不同病因以及病理階段，選擇最適合的造模方式。今后的研究將著眼于如何攻克各造模方式的缺點(diǎn)，使OS模型的設(shè)計(jì)更佳符合相似性、可靠性、重復(fù)性、適用性、可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性的造模原則，為深入探究OS并研制有效臨床藥物做出貢獻(xiàn)。