琥珀蠶孵化酶基因AaHE的克隆及啟動(dòng)子活性分析

陳安利, 董占鵬, 唐順明, 劉增虎, 李 濤, 廖鵬飛, 李瓊艷,*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所, 云南蒙自 661101; 2. 安康學(xué)院陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西安康 725000;3. 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院, 江蘇鎮(zhèn)江 212003)

大多數(shù)昆蟲在胚胎發(fā)育完成后，利用特殊的破卵構(gòu)造，如刺、骨化板、能翻縮的囊等破壞卵殼后孵化而出，這類構(gòu)造常被稱為破卵器。一般半翅目(Hemiptera)、脈翅目(Neuroptera)和虱目(Anoplura)昆蟲在孵化前不久，胚胎外面產(chǎn)生一層暫時(shí)性的表皮質(zhì)被膜，包裹著整個(gè)蟲體，破卵器就發(fā)生在這層被膜上。沒有這種被膜的昆蟲，如雙翅目(Diptera)的線角類、蚤目(Siphonaptera)和鞘翅目(Coleoptera)的葉甲等，它們的破卵器直接發(fā)生在幼蟲的表皮上，特別是頭部，一直保留到第一次蛻皮前(彩萬志等, 2001)。鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲與以上昆蟲存在較大差異，大多以上顎直接咬破卵殼，在此過程中孵化酶(hatching enzyme, HE)發(fā)揮了重要的作用。

1937年，Slifer研究發(fā)現(xiàn)蝗蟲卵孵化時(shí)需要一種幾丁質(zhì)酶參與降解蝗蟲卵白殼區(qū)域(Slifer, 1937)，這是有資料可查的最早的關(guān)于昆蟲卵孵化的分子生物學(xué)的研究。直到1999年，澳大利亞科學(xué)家Bowles課題組對(duì)寄生綿羊銅綠蠅Luciliacuprina卵的孵化相關(guān)的蛋白酶進(jìn)行了探索研究，認(rèn)為絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶參與了其孵化過程；2007年該課題組對(duì)人類害蟲虱子卵孵化過程研究發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶扮演了重要角色(Youngetal., 2000; Bowlesetal., 2008)。孵化酶在絹絲鱗翅目昆蟲卵孵化過程中同樣發(fā)揮了重要作用，在幼蟲咬破卵殼之前，孵化酶先軟化卵殼，以保護(hù)蟻蠶脆嫩的口器。唐順明小組先后對(duì)絹絲鱗翅目昆蟲家蠶Bombyxmori(Luetal., 2010; 唐順明等, 2010; Tangetal., 2012)、野桑蠶Bombyxmandarina(唐順明等, 2011)、柞蠶Antheraeapernyi(唐順明等, 2011)和桑樹主要害蟲之一桑蟥Rondotiamenciana(王煥英, 2014)的卵孵化分子機(jī)理進(jìn)行了較為系統(tǒng)地研究，克隆獲得的孵化酶基因編碼的氨基酸序列具有孵化酶特有的功能域，在進(jìn)化上比較保守。該基因在體外表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得的蛋白對(duì)家蠶卵殼底物有一定的活性(唐順明等, 2010)，孵化酶的酶學(xué)特征調(diào)查表明，一些金屬螯合劑對(duì)其有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)以孵化酶基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用RNAi技術(shù)有效抑制了蠶卵的孵化。

琥珀蠶Antheraeaassama屬鱗翅目大蠶蛾科(Saturniidae)柞蠶屬Antheraea的絹絲昆蟲(Arunkumaretal., 2012; Singhetal., 2012)，琥珀蠶絲與桑蠶絲相比，具有更好的強(qiáng)伸力、更強(qiáng)的吸濕性、呈金黃色金屬光澤且不易褪色，經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值較高(Freddietal., 1994; Ahmadetal., 2004; Unnietal., 2008)。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所于2010年在云南地區(qū)收集到琥珀蠶，經(jīng)過幾年的探索，成功實(shí)現(xiàn)了琥珀蠶的室內(nèi)飼養(yǎng)。但由于琥珀蠶馴化程度不高，蠶卵孵化不齊，成為制約琥珀蠶大規(guī)模室內(nèi)飼養(yǎng)的關(guān)鍵因素。本研究以琥珀蠶為研究對(duì)象，克隆獲得琥珀蠶卵孵化酶基因cDNA全長和啟動(dòng)子序列，并分析其序列組成、表達(dá)特征和啟動(dòng)子活性，為選擇合適的抑制劑或促進(jìn)劑調(diào)節(jié)琥珀蠶卵的孵化率提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試琥珀蠶由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所于2010年從野外收集并馴養(yǎng)保存。蠶卵在室溫下催青孵化，幼蟲置于室內(nèi)用天竺桂Cinnamomumpedunculatum新鮮葉片飼養(yǎng)，自然溫度和光照，相對(duì)濕度在75%～80%之間。取5齡第3和4天幼蟲的絲腺、馬氏管、頭、中腸、脂肪體、表皮、血液、精巢和卵巢組織，同時(shí)從母蛾產(chǎn)下受精卵開始每天收集卵，置于液氮中速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

取1.1節(jié)中的各組織(每個(gè)組織為2頭蠶的混合物，3次生物學(xué)重復(fù))和卵(多個(gè)母蛾同一天產(chǎn)下的卵混收，每天取30粒卵，分3組，每組10粒卵)加液氮研磨成粉末，加入1 mL TRIzol (Life Technologies公司)，按照RNA提取操作手冊(cè)提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，并用BIOMATE 3S微量分光光度計(jì)(Thermo)測定濃度后取各組織的500 ng總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)合成cDNA，cDNA用BIOMATE 3S微量分光光度計(jì)檢測其濃度和質(zhì)量，稀釋5倍后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因全長cDNA的克隆和生物信息學(xué)分析

參照鱗翅目昆蟲孵化酶基因的保守序列HEWMHILGFLHMHATYNR和Met-轉(zhuǎn)角基序SCLHY，合成簡并引物(F: 5′-GCCSAACRACACCG TYGTYTGGGA-3′; R: 5′-ACWCCYTCGTGYTCCYK CAGAGC-3′)，以琥珀蠶中腸cDNA為模板PCR擴(kuò)增目的基因CDS的部分序列。PCR體系: ddH2O 13.8 μL, 10×Ex Taq Buffer (20 mmol/L Mg2+plus) 2 μL, dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, TaKaRa Ex Taq (5 U/μL) 0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。以測序鑒定后的序列為參考，設(shè)計(jì)目的基因5′-RACE和3′-RACE特異性引物(表1)。

以琥珀蠶中腸總RNA為模板，參照SMARTer? RACE 5′/3′ Kit (TaKaRa)說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以合成的cDNA第1鏈為模板，用含有部分接頭序列的通用引物UPM (表1)為上游引物，以目的基因的5′-RACE特異性引物為下游引物，PCR擴(kuò)增獲得目的基因cDNA的5′末端序列。以合成的cDNA第1鏈為模板，用目的基因的3′-RACE特異引物為上游引物，以含有部分接頭序列的通用引物UPM為下游引物，PCR擴(kuò)增獲得目的基因cDNA的3′末端序列。PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pMD19-T載體(TaKaRa)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliTOP10感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素(Amp)的LB平板篩選陽性克隆。用M13引物(表1)進(jìn)行菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒，鑒定后的質(zhì)粒委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序正確的序列拼接后獲得目的基因完整的cDNA序列。

利用Compute pI/Mw Tool (http:∥web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測目的基因編碼的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量與等電點(diǎn)；采用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白的信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域；目的蛋白的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blast。選擇Blast結(jié)果中的前25個(gè)序列，用MEGA 6.0 軟件(Tamuraetal., 2013)的最大似然(maximum likelihood)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)運(yùn)行1 000次判斷是否屬于直系同源序列。

1.4 qRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)

參照目的基因的CDS序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物SYBR-F/SYBR-R(表1)。以1.2節(jié)中各組織和不同發(fā)育時(shí)期的卵的cDNA為模板，以β-actin(表1)為內(nèi)參基因(陳安利等, 2018)，在熒光定量PCR儀StepOnePlus Realtime PCR System (Applied Biosystems)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)(每個(gè)重復(fù)的幼蟲各組織來自2頭蟲體、不同發(fā)育時(shí)期的卵10粒)。反應(yīng)體系: 2×SYBR Premix ExTaq(Roche) 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 7.4 μL。PCR擴(kuò)增程序: 95℃ 1 min; 95℃ 30 s, 58℃ 1 min, 共40個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCt計(jì)算目的基因在各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 目的基因啟動(dòng)子序列的克隆

以琥珀蠶5齡第4天幼蟲的中腸組織為材料，參照動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]的說明書提取基因組DNA。以1.3節(jié)獲得的目的基因CDS序列為參考設(shè)計(jì)引物CDS-F/CDS-R (表1)，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取第一內(nèi)含子序列。PCR體系: ddH2O 13.3 μL, 10×Ex Taq Buffer (20 mmol/L Mg2+plus) 2 μL, dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 1.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, TaKaRa Ex Taq (5 U/μL) 0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 80 s, 共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。以第1外顯子和第1內(nèi)含子序列為參考設(shè)計(jì)3條同向且退火溫度較高的特異性引物SP1, SP2和SP3(表1)，參照Genome Walking Kit (TaKaRa)說明書，與試劑盒中提供的4種經(jīng)過特別設(shè)計(jì)的退火溫度較低的簡并引物AP1, AP2, AP3和AP4進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)，通過3次巢式PCR反應(yīng)獲取上述已獲得序列的側(cè)翼序列。使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0 (TaKaRa)切膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。用SP3引物對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測序，鑒定純化產(chǎn)物與上述已獲得序列的同源性。使用DNA Ligation Kit (TaKaRa)將與上述已獲得序列有同源性的純化產(chǎn)物與pMD19-T連接，熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 (TaKaRa)中，涂布平板37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌后提取質(zhì)粒，使用M13F, M13R, P1和P2引物對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測序。以測序結(jié)果兩端的序列為參考，設(shè)計(jì)引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。用啟動(dòng)子在線分析軟件(https:∥www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)分析獲得的側(cè)翼序列，預(yù)測啟動(dòng)子的核心區(qū)。設(shè)計(jì)特異性引物-727～-1F/-727～-1R (表1)擴(kuò)增5′-UTR上游包含啟動(dòng)子核心區(qū)的序列。

1.6 目的基因啟動(dòng)子的活性檢測

用SalⅠ和HindⅢ對(duì)1.5節(jié)中啟動(dòng)子擴(kuò)增序列和pIZ-EGFP載體進(jìn)行雙酶切，將啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物連接到昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pIZ-EGFP的EGFP基因上游，替換pIZ-EGFP載體上的OpIE-2啟動(dòng)子序列，構(gòu)建昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)載體。對(duì)pIZ-EGFP載體酶切位點(diǎn)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在切除OpIE-2啟動(dòng)子序列的同時(shí)，也切除了OpIE-2啟動(dòng)子上游的SV40 poly (A) signal序列。為了排除SV40 poly (A) signal序列的切除對(duì)基因表達(dá)的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)了一對(duì)引物PIZ-F/PIZ-R (表1)，以pIZ-EGFP載體序列為模板，擴(kuò)增了SV40 poly (A) signal序列。擴(kuò)增獲得的SV40 poly (A) signal序列與啟動(dòng)子擴(kuò)增序列一起通過無縫克隆構(gòu)建了重組昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pIZ-AaHE-EGFP。無縫克隆參照In-Fusion? HD Cloning Kit試劑盒(TaKaRa)的說明書進(jìn)行。構(gòu)建后的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，用博來霉素(zeocin)的LB平板篩選陽性克隆。挑選陽性菌落植菌后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒(1 μg)經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞株BmN，72 h后將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察。脂質(zhì)體介導(dǎo)參照Cellfectin Reagent試劑盒(Invitrogen)說明書進(jìn)行。通過觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)情況，確定獲得的啟動(dòng)子序列是否具有活性。

2 結(jié)果

2.1 琥珀蠶孵化酶基因的cDNA全長

PCR擴(kuò)增獲得一條長度為516 bp的目的片段。去除兩端簡并引物后，最終獲得的序列片段大小為469 bp。以獲得的序列為參考設(shè)計(jì)目的基因的特異性RACE引物，與通用接頭引物UPM一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因5′和3′末端的cDNA序列。利用BioEdit軟件對(duì)測序片段進(jìn)行拼接，獲得目的基因的全長cDNA序列，長993 bp(GenBank登錄號(hào): KT336227.1)，其中5′UTR長15 bp，3′UTR長65 bp，poly(A)尾巴長28 bp，CDS長885 bp，編碼294個(gè)氨基酸(圖1)。3′UTR含有典型的低G+C區(qū)域，并在距離poly(A)尾巴上游的13 bp處有典型的多聚腺苷酸化信號(hào)(圖1)。

2.2 琥珀蠶孵化酶的氨基酸序列特征

目的蛋白的分子質(zhì)量為33.7 kD，理論等電點(diǎn)為5.17，含有1個(gè)信號(hào)肽(1-16 aa)和1個(gè)ZnMc結(jié)構(gòu)域(92-242 aa)，ZnMc結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有1個(gè)HExxH鋅結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。將目的基因編碼的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示目的蛋白的氨基酸序列與柞蠶Antheraeapernyi類孵化酶蛋白(hatching enzyme like) ApHEL的氨基酸序列一致性最高，達(dá)到93.17%，其次是樗蠶Samiacynthiacynthia孵化酶蛋白SccHE，氨基酸序列一致性為89.80%，這與柞蠶、樗蠶和琥珀蠶同為大蠶蛾科絹絲昆蟲相符。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，目的蛋白與蛾類親緣關(guān)系明顯高于與蝶類的(圖2)，這與琥珀蠶為大蠶蛾科昆蟲相符，另外與目的蛋白親緣關(guān)系最近的9個(gè)蛋白中有8個(gè)為孵化酶蛋白(圖2)，因此將其命名為琥珀蠶孵化酶蛋白AaHE(GenBank登錄號(hào): AKS39779.1)。

圖2 最大似然法構(gòu)建的基于氨基酸序列的琥珀蠶AaHE和其他同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 AaHE的表達(dá)譜

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，AaHE在琥珀蠶5齡第4天幼蟲的中腸組織中表達(dá)量明顯高于其他組織(圖3)，這可能與該基因參與調(diào)控中腸組織的消化吸收有關(guān)(Rawlings and Barrett, 1995)。另外，在胚胎發(fā)育過程中，AaHE表達(dá)量在胚胎發(fā)育前中期維持在很低的水平，在胚胎發(fā)育后期特別是卵孵化前(卵產(chǎn)下后第9天)，AaHE基因的表達(dá)量迅速升高(圖4)，這可能與孵化過程中需要大量的孵化酶軟化卵殼有關(guān)。

圖3 AaHE在琥珀蠶5齡幼蟲各組織中的相對(duì)表達(dá)量

圖4 AaHE在琥珀蠶胚胎不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

2.4 AaHE基因啟動(dòng)子

克隆獲得了大小為1 419 bp的第1內(nèi)含子序列，以此為參考進(jìn)行染色體步移，最終獲得5′UTR上游共2 792 bp的序列(圖5)。用在線啟動(dòng)子分析軟件(https:∥www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)對(duì)獲得的2 792 bp序列進(jìn)行分析，預(yù)測了兩個(gè)啟動(dòng)子核心區(qū)(5′UTR的起始?jí)A基記作+1，與之相鄰的側(cè)翼序列堿基記作-1；核心區(qū)1：-727～-477 bp；核心區(qū)2：-2 337～-2 086 bp)，兩個(gè)核心區(qū)均存在啟動(dòng)子的核心序列TATA盒和其共有序列TATAAAA(圖5)。根據(jù)預(yù)測的核心區(qū)的位置，我們選擇距離起始密碼子較近的核心區(qū)1作進(jìn)一步分析。核心區(qū)1內(nèi)存在8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中6個(gè)為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TFIID的結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)為轉(zhuǎn)錄因子EivF/CREB結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)為轉(zhuǎn)錄因子CP1結(jié)合位點(diǎn)。

2.5 AaHE基因啟動(dòng)子的活性

重組昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pIZ-AaHE-EGFP經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞株BmN，72 h后，將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下可以觀察到明顯的綠色熒光(圖6)，說明AaHE5′UTR上游-727～-1的序列具有啟動(dòng)子活性，能夠啟動(dòng)EGFP基因的表達(dá)。

3 討論

本研究對(duì)琥珀蠶孵化酶基因AaHE的cDNA序列分析表明，AaHE是一種含有HExxH鋅結(jié)合基序的鋅依賴性金屬蛋白酶基因，與柞蠶、家蠶、野蠶的孵化酶基因?qū)儆谕活?，該類蛋白酶既是肽酶，同時(shí)又是一種消化酶(Rawlings and Barrett, 1995)。琥珀蠶卵殼相較于家蠶，硬度更高，卵殼不經(jīng)過軟化，幼蟲無法直接咬破卵殼。AaHE在琥珀蠶卵孵化過程中特異性高表達(dá)，可能是利用其裂解肽作用軟化卵殼，起到保護(hù)幼蟲口器的作用，而AaHE在中腸中特異性高表達(dá)(圖3)，可能與其具有的消化酶屬性有關(guān)。研究者(唐順明等, 2010)對(duì)柞蠶孵化酶的酶學(xué)特征調(diào)查表明，一些金屬螯合劑對(duì)其有較強(qiáng)的抑制作用，而琥珀蠶孵化酶蛋白AaHE與柞蠶、蓖麻蠶Philosamiacynthiaricini、家蠶等孵化酶蛋白相似，均含有ZnMc結(jié)構(gòu)域，通過分析琥珀蠶孵化酶蛋白的氨基酸序列，可為下一步選擇合適的抑制劑或促進(jìn)劑調(diào)節(jié)琥珀蠶卵的孵化率提供幫助。

本研究對(duì)AaHE基因啟動(dòng)子核心區(qū)的序列分析顯示，核心區(qū)存在8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中6個(gè)為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TFIID的結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)為轉(zhuǎn)錄因子EivF/CREB結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)為轉(zhuǎn)錄因子CP1結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。TFIID是寡聚蛋白，由TATA結(jié)合蛋白(TATA binding protein, TBP)和13個(gè)TBP相關(guān)因子(TBP associated factors, TAFs)組成(Goodrich and Tjian, 2010; Mulleretal., 2010)。當(dāng)TFIID與啟動(dòng)子結(jié)合后，TAFs可以與轉(zhuǎn)錄激活因子、共激活因子、染色質(zhì)修飾因子、轉(zhuǎn)錄延伸因子等發(fā)生相互作用，使TFIID接受來自不同方面的調(diào)控信號(hào)，從而調(diào)控基因的表達(dá)(Aaslandetal., 1995; Bell and Tora, 1999; Garbettetal., 2007; Lauberthetal., 2013)。研究表明，TFIID在配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用(郝國禮和于海泉, 2014)，但其是否會(huì)影響昆蟲卵的孵化，目前尚未見報(bào)道。轉(zhuǎn)錄因子EivF和CREB具有相同的識(shí)別位點(diǎn)，二者均是從HeLa細(xì)胞中分離而來，通過結(jié)合腺病毒早期III區(qū)(EIII)和早期IV區(qū)(EIV)啟動(dòng)子中的CRE(cAMP response element)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄(Cortesetal., 1988)。EivF與腺病毒EIV啟動(dòng)子特異性結(jié)合，CREB能夠與腺病毒EIV啟動(dòng)子中的CRE以及腺病毒EIII啟動(dòng)子中的兩個(gè)DNA元件(ATF和AP1)結(jié)合(Merinoetal., 1989; Mirallesetal., 1989)，兩者之間的相互作用關(guān)系目前還不清楚。轉(zhuǎn)錄因子CP1的報(bào)道較少，研究表明CP1對(duì)釀酒酵母甲硫氨酸生物合成 (methionine biosynthesis, MET)基因的轉(zhuǎn)錄起到促進(jìn)作用(O'Connelletal., 1995)。本研究為進(jìn)一步采用凝膠電泳阻滯法確定特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子或蛋白，通過調(diào)控特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)AaHE表達(dá)的目的提供了參考。