解淀粉芽孢桿菌對(duì)植物土傳病害的作用機(jī)制

陸景倩，郎劍鋒，楊秋俠，石明旺

（河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

土傳病害是指病原體如真菌、細(xì)菌、線蟲(chóng)等隨病殘?bào)w生活在土壤中，條件適宜時(shí)從作物根部或莖部侵害作物而引起的病害，包括根腐病、青枯病、根結(jié)線蟲(chóng)病等［1］。這些病害在中國(guó)頻繁發(fā)生，危害近0.33億hm2的經(jīng)濟(jì)作物，造成的損失達(dá)數(shù)百億元［2］，嚴(yán)重制約著中國(guó)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

根據(jù)土傳病害的發(fā)生特點(diǎn)，可以采用農(nóng)作防治、物理防治、品種選用、化學(xué)藥劑防治、生物防治和多措施的協(xié)調(diào)使用等來(lái)防治土傳病害的發(fā)生［3］。生物防治具有安全、有效、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)田中使用生防菌不但可以制約土傳病害的初侵染源、保護(hù)其侵染點(diǎn)，還能夠調(diào)控土壤環(huán)境、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)寄主抗性，同時(shí)還能降低化學(xué)農(nóng)藥使用量，是保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效措施［4］。解淀粉芽孢桿菌（Ba?cillus amyloliquefaciens）屬于芽孢桿菌屬，為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈桿狀，兩端鈍圓，有運(yùn)動(dòng)性，在NA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)粗糙的表面和不規(guī)則的邊緣［5］，是一種與枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）親緣度很高的細(xì)菌［6］。解淀粉芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細(xì)菌的活性代謝物質(zhì)，具有廣譜的抗真菌、細(xì)菌活性［7］；所產(chǎn)生的活性代謝物質(zhì)，可作為激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗性［8］；同時(shí)又是一種植物根際促生菌，將解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行拌種、噴施、灌根等方法使用，均可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)［9］；且解淀粉芽孢桿菌能與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，間接抑制植物病害［10］，因而備受學(xué)者的青睞。本研究主要從拮抗作用、促生作用、競(jìng)爭(zhēng)作用和誘導(dǎo)抗性4個(gè)方面對(duì)解淀粉芽孢桿菌的生防機(jī)制加以闡述，并對(duì)其今后發(fā)展進(jìn)行展望。

1 解淀粉芽孢桿菌的生防機(jī)制

1.1 拮抗作用

解淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)生豐富的活性代謝產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)解淀粉芽孢桿菌FZB42基因分析表明，總共有11個(gè)基因簇用于合成抗菌代謝物質(zhì)，占總基因組8.5%以上［11］，主要包括非核糖體合成的脂肽類化合物、聚酮類化合物和核糖體合成的細(xì)菌素，這些活性代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原菌生長(zhǎng)有直接抑制作用。

1.1.1 脂肽類化合物 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物具有抗真菌活性，可以明顯地抑制多種病原菌的生長(zhǎng)，破壞細(xì)胞壁的完整性，抑制菌絲生長(zhǎng)和分生孢子的萌發(fā)。脂肽是由肽合成酶（NPRS）非核糖體合成的小分子抗生素，這種生物合成系統(tǒng)導(dǎo)致了環(huán)狀脂肽產(chǎn)物之間顯著的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，這些產(chǎn)物在氨基酸殘基的類型、數(shù)量和序列以及肽環(huán)化的性質(zhì)上各不相同，在每個(gè)家族中，脂肪酸鏈的性質(zhì)、長(zhǎng)度和分支都存在一定的差異，從而導(dǎo)致同一品系同時(shí)產(chǎn)生多種相似的Surfactin、Iturin、Fengycin和Bac?illomycin D［12］。Surfactin是生物表面活性劑，具有強(qiáng)大的乳化、發(fā)泡等作用，Surfactin能夠與細(xì)胞膜磷脂層聯(lián)合，帶負(fù)電的支鏈伸入到水中，而非極性的部分則進(jìn)入到膜上疏水孔中，通過(guò)破壞細(xì)胞膜影響膜的穩(wěn)定性，從而達(dá)到抑菌的目的［13］；Fengycin抑菌機(jī)制是影響真菌細(xì)胞膜的表面張力，導(dǎo)致微孔的形成，造成了K＋及其他重要離子從細(xì)胞內(nèi)滲漏，最后引起細(xì)胞死亡［14］；Iturin以及Fengycin是抑制病原真菌的重要因素，能夠干擾植物真菌病原體的胞內(nèi)過(guò)程，特別是抑制毒素的形成［15］；Bacillomycin D會(huì)導(dǎo)致病原菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜遭受嚴(yán)重的破壞，菌絲與孢子都出現(xiàn)嚴(yán)重的質(zhì)壁分離以及細(xì)胞質(zhì)外滲現(xiàn)象［16］。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，Surfactin在解淀粉芽孢桿菌對(duì)核盤(pán)菌、山藥腐皮鐮刀菌和立枯絲核菌的平板拮抗過(guò)程中是主要的參與物質(zhì)［16］；Iturin可以導(dǎo)致大麗輪枝菌的細(xì)胞溶解和細(xì)胞質(zhì)外泄［17］；Fengycin參與了解淀粉芽孢桿菌對(duì)尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、大麗輪枝菌、疫霉和山藥腐皮鐮刀菌的拮抗過(guò)程［16，18］；Bacillo?mycin D是解淀粉芽孢桿菌抑制病原菌禾谷鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的主要脂肽類物質(zhì)［16，19］。

1.1.2 聚酮類化合物 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的聚酮類化合物具有抗細(xì)菌活性，能夠抑制植物病原細(xì)菌的生長(zhǎng)。聚酮化合物是由聚酮合成酶（PKS）催化合成的，PKS是一類復(fù)雜的多酶體系，大部分以脂酰為底物，通過(guò)重復(fù)的脫羧縮合過(guò)程產(chǎn)生線性聚酮化合物或環(huán)狀的酮內(nèi)酯，產(chǎn)生過(guò)程類似于脂肪酸合酶催化的脂肪酸生物合成的過(guò)程［20］。產(chǎn)生的聚酮類化合物有Difficidin、Bacilysin、MacrolactinA和Bacillaene。

Difficidin為一種高度不飽和22元大環(huán)多烯內(nèi)酯，能夠抑制蛋白質(zhì)的合成和破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)［21］，李冰［16］研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌SQR9對(duì)茄科勞爾氏菌72.8%的拮抗活性是因?yàn)镾urfactin與Diffici?din的參與。Bacilysin由1個(gè)非蛋白胺基酸L-anti?capsin和1個(gè)L型丙氨酸縮合形成，Bacilysin的抗菌活性依賴于被肽酶水解而成的anticapsin，干擾細(xì)菌肽聚糖和真菌甘露糖蛋白的合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁裂解和細(xì)胞溶解［22］。

Macrolactin是由1個(gè)包含3個(gè)獨(dú)立的二烯結(jié)構(gòu)的24元環(huán)內(nèi)酯構(gòu)成，其中MacrolactinA最具抑菌活性［23］。Bacillaene是1種22元不飽和的大環(huán)多烯內(nèi)酯磷酸酯，具有線性結(jié)構(gòu)，與若干順式雙鍵結(jié)合，并具有1個(gè)β-分枝，能夠抑制原核生物蛋白質(zhì)的合成，具有廣譜抗菌性［24，25］。董月［26］從解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液中分離純化出2種對(duì)青枯病菌茄科勞爾氏菌有抑制作用的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)鑒定，確定這兩種物質(zhì)為MacrolactinA和Bacillaene。

1.1.3 細(xì)菌素 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素是通過(guò)核糖體合成的一類小分子蛋白類抗菌物質(zhì)，抗逆性較強(qiáng)，多為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能夠在靶細(xì)胞膜上形成孔道，造成內(nèi)容物外泄或各種平衡機(jī)制失調(diào)，從而發(fā)揮其殺菌作用［27、28］。核糖體合成的細(xì)菌素可按照是否含有羊毛硫氨酸分為兩類：一種是羊毛硫細(xì)菌素，又稱硫醚抗生素，是一類在自身核糖體合成，經(jīng)翻譯后修飾形成具有羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸等特殊氨基酸的環(huán)狀多肽［28］，抑菌時(shí)不需要特定的膜受體，而是破壞細(xì)胞膜的完整性達(dá)到抑菌目的［29］。另一種是非羊毛硫氨酸細(xì)菌素，殺菌機(jī)制是在形成膜孔道之前，與膜交連的受體蛋白產(chǎn)生相互作用，使細(xì)胞膜失去穩(wěn)定性從而產(chǎn)生抑菌作用［30］。Chen等［31］發(fā)現(xiàn)與不產(chǎn)生細(xì)菌素的無(wú)毒菌株相比，浸泡在無(wú)毒細(xì)菌素懸液中的煙草幼苗根系更能有效地抵御由青枯病菌引起的枯萎病，推測(cè)是產(chǎn)生的細(xì)菌素抑制病原菌的生長(zhǎng)。

1.2 促進(jìn)植物生長(zhǎng)

植物根際是一個(gè)非常活躍并且復(fù)雜的區(qū)域，根系分泌的復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)可以作為微生物的營(yíng)養(yǎng)源，供給植物根際促生細(xì)菌生長(zhǎng)以及發(fā)揮其對(duì)植物有益的功能。為了在競(jìng)爭(zhēng)根系分泌物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，生防菌首先要在根際穩(wěn)定存活，而后發(fā)揮其益生功能［7］。解淀粉芽孢桿菌作為一種生防菌，能夠在植物根部定殖［32］，通過(guò)調(diào)控根際微生物群落多樣性，產(chǎn)生赤霉素、吲哚乙酸等物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

1.2.1 定殖 生防菌的趨化運(yùn)動(dòng)性對(duì)于根際定殖的起始階段非常重要，生防菌通過(guò)感受根系分泌物中特定的信號(hào)物質(zhì)向根表移動(dòng)，在抵達(dá)根際或根表后，通過(guò)感受外界環(huán)境信號(hào)變化調(diào)控生物膜相關(guān)基因的激活，聚集在一起開(kāi)始形成生物膜，進(jìn)而完成根部定殖［33］。劉云鵬［8］研究發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖對(duì)解淀粉芽孢桿菌SQR9具有很強(qiáng)的吸引作用，外源添加D-半乳糖能夠促進(jìn)SQR9根際定殖，通過(guò)對(duì)甲基化趨化受體蛋白（MCP）的敲除和進(jìn)一步的趨化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)McpA是負(fù)責(zé)感受D-半乳糖的惟一受體，D-半乳糖不僅能夠吸引SQR9，而且能夠以McpA依賴型的方式促進(jìn)SQR9生物膜的形成。對(duì)玉米幼苗進(jìn)行的離體研究表明，離主根基部2～8 cm的片段是解淀粉芽孢桿菌FZB42定殖最多的區(qū)域，而在萵苣幼苗中，細(xì)菌定殖主要發(fā)生在原根和根毛上，以及根尖和鄰近的邊緣細(xì)胞上，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌能夠很好地在植物體內(nèi)定殖［34］。

1.2.2 促進(jìn)生長(zhǎng) 解淀粉芽孢桿菌能夠調(diào)控根際微生物群落多樣性，通過(guò)產(chǎn)生吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素等物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。黎妍妍等［9］施用解淀粉芽孢桿菌對(duì)煙草根際進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大田中使用解淀粉芽孢桿菌能夠使土壤中的有益微生物（如木霉菌、赤霉菌）比例上升。已有研究表明，較高的子囊菌門和擔(dān)子菌門有利于分泌消化酶將土壤中的有機(jī)物質(zhì)（如纖維素、木質(zhì)素等）分解為小分子，促進(jìn)土壤C循環(huán)［35］。木霉菌（Trichoderma）可直接與根系相互作用，通過(guò)產(chǎn)生生物活性物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，進(jìn)而抵抗生物侵染和非生物脅迫［36］。赤霉菌（Gib?berella）可分泌赤霉素，促進(jìn)植物生長(zhǎng)［37］。李晴晴等［38］在水稻大田種植中施加解淀粉芽孢桿菌菌劑FH-1，分析顯示菌劑FH-1處理土壤中富集的微生物有19個(gè)，主要包括綠彎菌門、芽孢桿菌綱、芽孢桿菌目、浮霉菌綱、紅螺菌目、生絲微菌科、紅螺菌科等，因此推測(cè)解淀粉芽孢桿菌是通過(guò)調(diào)控根際微生物群落結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育。

1.3 競(jìng)爭(zhēng)作用

解淀粉芽孢桿菌能夠分泌嗜鐵素，嗜鐵素通過(guò)配基的螯合使環(huán)境中的鐵濃度降低，使病原菌缺鐵而不能生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而達(dá)到控制植物病害的目的。鐵元素在植物生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，鐵可以合成多種氧化物酶和過(guò)氧化物酶的輔基，同時(shí)也是葉綠素和各種細(xì)胞色素的主要成分，植物缺鐵易導(dǎo)致失綠癥發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)造成植株白化［39］。土壤中可供植物直接利用的鐵元素有限，已有學(xué)者證明，在缺鐵條件下，解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生嗜鐵素吸附土壤中的Fe3+，通過(guò)螯合作用運(yùn)至植物體內(nèi)，供給宿主植物的生長(zhǎng)所需，甚至可以與植物病原微生物競(jìng)爭(zhēng)生物體直接可利用的Fe3+，間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制病原物對(duì)其的侵害［10、40］。

1.4 誘導(dǎo)植物抗性

解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)可作為激發(fā)子誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性，從而降低土傳病害的發(fā)生。誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Induced Systemic Resistance，ISR）途徑，主要是指非病原物作用于宿主植物后，激活了該植物自身的物理或化學(xué)屏障，從而產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的過(guò)程［41］。研究發(fā)現(xiàn)，在解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)生的根系分泌物中檢測(cè)到的抗真菌脂肽物質(zhì)有90%是Surfactin，在定殖7 d后檢測(cè)到少量的Iturins和fengycin。此外，在解淀粉芽孢桿菌定殖的植物根附近，未檢測(cè)到抗菌聚酮等生物活性化合物［42-44］。因此，推測(cè)解淀粉芽孢桿菌可能是激發(fā)了ISR，增強(qiáng)了植物對(duì)病原的防御能力。劉云鵬［8］在解淀粉芽孢桿菌SQR9基礎(chǔ)上，構(gòu)建了若干個(gè)突變體菌株，分別缺失了Feng?cycin、Surfactin、Bacillomycin D、Bacillaene、Difficidin、Macrolactin、Bacilysin，測(cè)試這些突變體在誘導(dǎo)植物抗性中對(duì)抗病原菌時(shí)的差異，結(jié)果顯示，缺失任一物質(zhì)均導(dǎo)致SQR9對(duì)植物的抗性誘導(dǎo)能力顯著降低，由此可見(jiàn)，解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)生的激發(fā)子能夠通過(guò)不同防御信號(hào)途徑協(xié)同誘導(dǎo)植物對(duì)抗不同植物病原菌的能力，而產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)在該過(guò)程中起主要作用。在大豆和番茄中，Surfactin和少量的Fengycin可作為誘導(dǎo)宿主植物免疫的誘導(dǎo)因子，有助于增強(qiáng)大豆和番茄植株對(duì)病原微生物的抗性［11］。王雪等［45］研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌FS6菌株能夠在人參植株內(nèi)定殖傳導(dǎo)，且能在一定程度上誘導(dǎo)人參產(chǎn)生抗病性。

2 解淀粉芽孢桿菌的生防應(yīng)用

解淀粉芽孢桿菌作為生防菌，在農(nóng)業(yè)上用于處理土壤和種子，防治植物土傳病害，除此之外，解淀粉芽孢桿菌還能與其他的生防菌混合使用，且不受殺蟲(chóng)劑、殺菌劑的影響。

2.1 土壤處理

解淀粉芽孢桿菌可作為殺菌劑處理土壤，不僅對(duì)土傳病害病原菌有較好的抑制作用，還可促進(jìn)植物生長(zhǎng)。目前，國(guó)內(nèi)登記的解淀粉芽孢桿菌殺菌劑劑型較少，主要有以下幾種（表1）。

表1 部分國(guó)內(nèi)登記的解淀粉芽孢桿菌殺菌劑制劑

國(guó)內(nèi)對(duì)解淀粉芽孢桿菌的研究報(bào)道比較多，但是對(duì)于其劑型的研究卻是近幾年開(kāi)始的，李西會(huì)等［46］將解淀粉芽孢桿菌Q426研發(fā)成可濕性粉劑，對(duì)尖孢鐮刀菌有較好的抑制活性；魏嬌洋等［47］將解淀粉芽孢桿菌X-278研發(fā)成片劑，該片劑不僅對(duì)棉花黃萎病有較好的防治效果，還可提高棉花產(chǎn)量；張俊祥等［48］將解淀粉芽孢桿菌GB1發(fā)酵菌液制成水懸浮劑，發(fā)現(xiàn)其有較好的穩(wěn)定性。實(shí)踐證明，在土壤中引進(jìn)生防菌劑能夠有效地防治作物土傳病害，并且能促進(jìn)作物的生長(zhǎng)。

2.2 種子處理

種子包衣是防治土傳病害的有效手段，目前的種子處理劑多為化學(xué)農(nóng)藥，而微生物的種子處理劑非常少。在國(guó)內(nèi)，尚未發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌種子處理劑的登記，而國(guó)外已經(jīng)取得若干種子處理劑的登記如表2所示［49］。

表2 部分國(guó)外登記的解淀粉芽孢桿菌種子處理劑

目前，在國(guó)內(nèi)，已有學(xué)者利用解淀粉芽孢桿菌開(kāi)發(fā)成種衣劑的研究，如董麗萍等［50］將解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2與吡蟲(chóng)啉、多菌靈復(fù)配在一起，制成丸化種衣劑，用于油菜種子包衣，該種衣劑可以防治蚜蟲(chóng)和土傳病害。

2.3 與其他生防菌混合使用

將不同的菌株混合使用，不僅能夠通過(guò)不同機(jī)制抑制病原菌，增加其抑菌廣譜性，同時(shí)也可以減少菌株的選擇變異性，提高防治效果。楊定祥［51］將木霉菌菌株與解淀粉芽孢桿菌菌株的固體發(fā)酵物混合，發(fā)現(xiàn)混合后的發(fā)酵物對(duì)辣椒疫病有一定的田間防病效果，并對(duì)辣椒生長(zhǎng)具有較好的促進(jìn)作用。

3 問(wèn)題與展望

近年來(lái)，解淀粉芽孢桿菌己經(jīng)成為菌劑研制開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，該生防菌不僅具有產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等特性，還能有效地抑制病原菌的入侵，提高植物的抗性，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。雖然解淀粉芽孢桿菌己經(jīng)被大量的研究報(bào)道，但其在田間的生物防治作用仍存在很多問(wèn)題，主要表現(xiàn)在：①用解淀粉芽孢桿菌對(duì)土壤進(jìn)行處理時(shí)，受土壤溫濕度、酸堿度等外界因素的影響，導(dǎo)致其防病促生效果不穩(wěn)定。②在使用解淀粉芽孢桿菌防治植物土傳病害時(shí)，不同的植物，不同的病害，所使用的劑量也不相同，劑量的過(guò)高過(guò)低對(duì)植物有不同的影響［52］。③對(duì)于解淀粉芽孢桿菌防治植物病害，大部分抑菌試驗(yàn)是在室內(nèi)進(jìn)行，與田間試驗(yàn)的防治效果差異較大。

為了解決這些問(wèn)題，未來(lái)應(yīng)該在以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：①對(duì)解淀粉芽孢桿菌菌株進(jìn)行改良，提高菌株的生防活性，開(kāi)發(fā)新型的解淀粉芽孢桿菌菌株。②加強(qiáng)解淀粉芽孢桿菌與其他生防菌劑聯(lián)合使用的研究，使多種生防菌劑協(xié)同增效，增加其抑菌廣譜性，最大化利用土壤中的養(yǎng)分，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，從根本上解決土壤障礙問(wèn)題。③提高解淀粉芽孢桿菌生物農(nóng)藥的質(zhì)量，增強(qiáng)解淀粉芽孢桿菌適應(yīng)環(huán)境脅迫的能力，同時(shí)加強(qiáng)新型劑型的開(kāi)發(fā)，以減少外界環(huán)境對(duì)解淀粉芽孢桿菌活性的影響。