染色體核型分析聯(lián)合BACs-on-Beads技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

趙淑慧,高云鴿,錢羅蒙,翟梁好,董 健,李春艷#,陳必良*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710032;2白銀市中心醫(yī)院產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:cblxjh@fmmu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:lichunyanangel@163.com)

出生缺陷是指嬰兒出生前發(fā)生的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常。隨著我國二孩政策的開放，高齡孕產(chǎn)婦的數(shù)量不斷增加，出生缺陷的生育風(fēng)險也在不斷增加。在我國每年約有90萬例新生兒發(fā)生出生缺陷，已成為重要的公共衛(wèi)生問題。產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷技術(shù)是預(yù)防出生缺陷的主要措施。產(chǎn)前超聲能夠及時有效地發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常[1]。染色體異常的篩查方法主要包括血清學(xué)篩查和無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(noninvasive prenatal test,NIPT)，產(chǎn)前診斷方法主要包括染色體核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis,CMA)和細(xì)菌人工染色體標(biāo)記-微球鑒別/分離法(BACs-on-Beads，BoBs)檢測等[2]。染色體核型分析是產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。產(chǎn)前BACs-on-Beads是專門針對人類最常見的染色體疾病進(jìn)行靶向檢測的最新技術(shù)，除了能檢測13，18，21，X和Y 5種主要的染色體變化外，還可以檢測9種常見微缺失綜合征(Wolf-Hirschhorn綜合征、Cri du Chat綜合征、Miller-Dieker綜合征、Smith-Magenis綜合征、DiGeorge綜合征、Angelman綜合征、Prader-Willi綜合征、Williams-Beuren綜合征、Langer-Giedion綜合征)。本文對2 115份胎兒羊水進(jìn)行BoBs檢測和染色體核型分析，評估染色體核型分析聯(lián)合BoBs技術(shù)在產(chǎn)前對胎兒染色體異常診斷的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2018年1月至2020年7月在西京醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心接受遺傳咨詢并進(jìn)行羊水穿刺的2 115例孕婦,年齡(30.32±5.07)歲,孕周(21.34±3.46)周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具備產(chǎn)前診斷的指征；②同時接受染色體核型分析和BoBs檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：染色體核型分析和BoBs檢測二者僅進(jìn)行其一或其中一項(xiàng)檢測失敗。孕婦的產(chǎn)前診斷指征包括：年齡≥35歲；血清學(xué)篩查高風(fēng)險；胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常；無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(NIPT)高風(fēng)險；不良孕產(chǎn)史；其他(家族遺傳病史夫妻一方染色體異常不良接觸史等)。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書。本研究已通過倫理委員會審批(S2016-120-02)。

1.2 研究方法

1.2.1 羊膜腔穿刺 囑孕婦排空膀胱，仰臥位，腹部穿刺部位常規(guī)消毒，超聲持續(xù)引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水30 ml，20 ml用于G顯帶核型分析，10 ml用于BoBs檢測。

1.2.2 染色體核型分析 將20 ml羊水在無菌操作下進(jìn)行培養(yǎng)、消化、離心，常規(guī)染色體制片、G顯帶，每例樣本分析30個分裂相，采集3-5個核型圖。發(fā)現(xiàn)染色體異?；蚨鄳B(tài)性時,增加分析的核型數(shù)。

1.2.3 胎兒羊水BoBs檢測 取10 ml羊水，根據(jù)DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen,USA)說明書方法提取樣本DNA。利用Prenatal BoBsTM試劑盒(PerkinElmer,USA)進(jìn)行樣本檢測，luminex200TM讀取信號強(qiáng)度，BoBsoft2.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 胎兒染色體核型分析與產(chǎn)前BoBs檢測結(jié)果

BoBs和核型分析均對胎兒樣本檢測成功。2 115例羊水樣本中，核型分析檢測出49例染色體異常，檢出率2.32%,包括13-三體綜合征1例、18-三體綜合征4例、21-三體綜合征20例、超雌綜合征2例、特納綜合征2例、染色體微缺失/微重復(fù)4例、性染色體嵌合體2例、易位5例、倒位7例以及Rob易位2例；BoBs檢測出31例染色體非整倍體和19例染色體微缺失/微重復(fù)綜合征(見表1),檢出率2.36%。染色體核型分析檢出2例性染色體嵌合體，BoBs檢出2例性染色體嵌合體，但其中1例嵌合體兩種方法均檢測出，故兩種方法共檢測出3例染色體嵌合體病例。

表1 2 115例胎兒染色體核型分析與產(chǎn)前BoBs檢測結(jié)果對比Table 1 Comparison of chromosome karyotype analysis and prenatal BoBs test results in 2 115 fetuses

2.2 微缺失/微重復(fù)綜合征19例染色體核型對比

BoBs技術(shù)檢測出19例染色體微缺失/微重復(fù)綜合征，包括FMR1(Xq27.3缺失)1例、Williams-Beuren綜合征(7q11.2擴(kuò)增)1例、Digeorge綜合征Ⅰ型(22q11.2缺失)1例、Larger-Giedion綜合征(8q23.3缺失)1例、Kallmann綜合征(XP22.31缺失)3例、Wolf-Hirschhorn綜合征(4p16.3缺失)1例、AZFb+c微缺失(yq11.223q11.23缺失)11例，而染色體核型分析僅檢測出1例Williams-Beuren綜合征、1例FMR1和1例Larger-Giedion綜合征(見表2)。其中Williams-Beuren綜合征、Digeorge綜合征Ⅰ型、Larger-Giedion綜合征、Wolf-Hirschhorn綜合征為常見的微缺失綜合征。

表2 微缺失/微重復(fù)綜合征19例染色體核型對比Table 2 Comparison of karyotype in 19 cases of microdeletion/microduplication syndrome

3 討論

產(chǎn)前診斷是降低出生缺陷的有效辦法，對優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。染色體核型分析能夠發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常及大于5-10 Mb的結(jié)構(gòu)異常，是產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法存在細(xì)胞培養(yǎng)耗時長、分辨率低、耗費(fèi)大量人力等缺點(diǎn)，且對大部分與畸形或智力發(fā)育相關(guān)的微缺失、微重復(fù)的檢測能力有限[4]，因此存在漏診風(fēng)險。CMA技術(shù)包括分析單核苷酸多態(tài)性并比較基因組雜交的微陣列，不僅能檢測到染色體非整倍體異常，還能檢測到微缺失/微重復(fù)片段[5]。目前，國內(nèi)外指南推薦當(dāng)產(chǎn)前超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常時，首先選擇CMA進(jìn)行遺傳學(xué)檢測[6,7]。有研究表明[8]，染色體核型分析聯(lián)合CMA技術(shù)檢測嵌合體對產(chǎn)前診斷和適當(dāng)?shù)倪z傳咨詢提供更全面、更準(zhǔn)確的篩查具有重要意義。但該技術(shù)在檢測致病性的染色體拷貝數(shù)異常的同時，也能檢測到一些意義不明的染色體拷貝數(shù)異常(VOUS)，對結(jié)果判讀及遺傳咨詢增加難度[9]，且費(fèi)用較高，對孕產(chǎn)婦的經(jīng)濟(jì)壓力較大。產(chǎn)前BoBs技術(shù)的應(yīng)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)染色體核型分析的不足之處，并具有以下優(yōu)勢：無需細(xì)胞培養(yǎng)、只需低劑量的DNA就能完成檢測、通量高可以實(shí)現(xiàn)多個樣本同時檢測，而且報告周期短、結(jié)果明確易解讀[10]。與其他方法相比，BoBs技術(shù)在快速產(chǎn)前診斷中具有明顯優(yōu)勢。推薦染色體微陣列分析為產(chǎn)前超聲異常胎兒遺傳學(xué)檢測的首選診斷方法。

本研究應(yīng)用“核型分析+BoBs檢測”產(chǎn)前診斷模式對2 115例羊水樣本進(jìn)行核型分析及BoBs檢測，2 066例羊水樣本染色體核型分析結(jié)果顯示為正常，2 065例羊水樣本BoBs檢測結(jié)果顯示正常。BoBs在檢測染色體數(shù)目異常時與傳統(tǒng)的核型分析結(jié)果一致，均能檢出29例胎兒染色體數(shù)目異常，符合率為100%，與其他報道相同[11]。在本研究中，產(chǎn)前BoBs檢測出50例染色體異常，檢出率為2.36%；染色體核型分析檢測出染色體異常49例，檢出率為2.31%；兩種方法聯(lián)合檢出65例染色體異常，檢出率為3.07%。由此可見，“核型分析+BoBs檢測”產(chǎn)前診斷模式檢出率均高于兩種方法單獨(dú)應(yīng)用，降低了漏診風(fēng)險。

本研究結(jié)果顯示，在19例染色體微缺失/微重復(fù)病例中，核型分析僅檢測出4例，而BoBs均檢測成功，兩者檢測符合率為15.8%。BoBs不僅檢測出常見的9例微缺失/微重復(fù)綜合征，此次研究還檢測到3例Kallmann綜合征以及11例AZFb+c微缺失。據(jù)文獻(xiàn)報道[12]，Kallmann綜合征是一種伴有嗅覺缺失或減退的低促性腺激素型遺傳性疾病，可伴有唇裂、腭裂、掌骨短及腎臟發(fā)育異常。AZFb+c微缺失臨床表現(xiàn)為精子生成障礙、少精癥，可能導(dǎo)致生育性下降或不育[13]。雖然這兩種微缺失綜合征不會引起致命性缺陷，但對新生兒出生后的診療具有指導(dǎo)作用。以上結(jié)果體現(xiàn)了BoBs檢測技術(shù)在微缺失/微重復(fù)綜合征產(chǎn)前診斷中的獨(dú)特優(yōu)勢，彌補(bǔ)了染色體核型分析的局限性，拓寬了產(chǎn)前診斷技術(shù)對染色體異常的檢測范圍，避免了常見的微缺失綜合征患兒的出生，降低了出生缺陷。

回顧類似研究的相關(guān)文獻(xiàn)，王穎等[14]采用BoBs與常規(guī)核型分析對190例孕婦羊水樣本進(jìn)行檢測，評估兩種方法單獨(dú)和聯(lián)合使用在高危孕婦產(chǎn)前診斷的臨床價值。結(jié)果顯示，BoBs及核型分析染色體異常檢出率分別為7.37%和6.84%，兩種方法聯(lián)合使用后染色體異常檢查率為9.47%。另一項(xiàng)研究[15]對1 409例染色體異常高危因素孕婦進(jìn)行BoBs檢測和核型分析，并對染色體異常結(jié)果通過CMA或FISH驗(yàn)證。結(jié)果表明，BoBs能夠快速檢測到染色體非整倍性。此外，能夠檢測核型分析漏診的微缺失/微重復(fù)病例。雖然以上研究的染色體異常檢出率比本研究染色體異常的檢出率高，這可能是本研究樣本量較大造成，但是兩個研究得到的結(jié)論相同，即兩種方法聯(lián)合使用比單獨(dú)使用檢測到更多的胎兒染色體異常。

BoBs檢測技術(shù)也存在一定的局限性，例如無法檢測出易位、倒位及低比例的嵌合體等。在本研究中，3例染色體嵌合樣本中，傳統(tǒng)染色體核型分析和BoBs分別檢測出2例嵌合，其中1例為共同檢出。核型分析額外檢測出被BoBs漏檢的15例染色體異常，分別為平衡易位5例、倒位7例、羅伯遜易位2例，導(dǎo)致BoBs漏檢的原因可能是探針未覆蓋到發(fā)生易位和倒位的染色體區(qū)域。另外，BoBs因嵌合體比例較低而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此產(chǎn)前BoBs技術(shù)與核型分析聯(lián)合應(yīng)用能夠有效避免單一技術(shù)造成的染色體病的漏診。

綜上所述，核型分析與BoBs檢測均能檢出染色體數(shù)目異常，BoBs在檢測染色體微缺失和微重復(fù)方面具有更明顯的優(yōu)勢，同時縮短了報告周期，有利于減輕孕婦及其家屬的焦慮情緒。我們認(rèn)為，傳統(tǒng)染色體核型分析聯(lián)合BoBs技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，可以提高胎兒染色體異常的檢出率，降低染色體異常的漏診，為出生缺陷的預(yù)防起到關(guān)鍵作用。