墓頭回藥材中總黃酮和總皂苷測定方法研究

王嘉琛,張莉丹,王伊楠,郭宇航,董征艷,姚隆丹,段秀俊*

(1山西藥科職業(yè)學院中藥檢定教研室,太原 030001;2山西中醫(yī)藥大學中藥教研室;*通訊作者,E-mail:dxjzhyxy@163.com)

據(jù)《山西省中藥材標準》記載,墓頭回為敗醬科植物糙葉敗醬(Patrinia scabra Bunge)的干燥根[1],別名九頭鳥、腳汗草[2]。除西藏、青海外,在我國大部分地區(qū)均有分布。具有清熱燥濕、止血、止帶、截瘧的功效。現(xiàn)代研究表明墓頭回中含有的黃酮、皂苷等成分,具有抗菌消炎、抑制腫瘤細胞生長、提高機體免疫力等多種藥理作用[3-6]。但暫無文獻對其中黃酮、皂苷等有效成分的測定方法進行研究。本試驗采用紫外-可見分光光度法,建立了測定墓頭回中總皂苷及總黃酮含量的方法,為墓頭回的質(zhì)量控制提供有價值的試驗依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 儀器

UV-610S紫外-可見分光光度計(上海元析儀器責任有限公司)、ATY224分析天平(萬分之一,日本島津公司)、UW120D分析天平(十萬分之一,日本島津公司)、KQ5200V超聲清洗機(昆山市超聲儀器有限公司),HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司),SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)等。

1.2 藥材與試劑

墓頭回經(jīng)山西中醫(yī)藥大學段秀俊副教授鑒定為敗醬科植物糙葉敗醬(Patrinia scabra Bunge)的干燥根。蘆丁對照品(批號100080-200707)、齊墩果酸對照品(批號110709-201206)均購于中國食品藥品檢定研究院,甲醇(批號20151218,天津市科密歐化學試劑有限公司),香草醛(批號20140304,天津市科密歐化學試劑有限公司),冰醋酸(批號20160304,天津市科密歐化學試劑有限公司),乙醚(批號20140316,天津市風船化學試劑有限公司),正丁醇(批號20190108,天津市東麗區(qū)新中村),高氯酸(批號20131105,天津政成化學制品有限公司),以上試劑均為分析純;水為超純水。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 總皂苷的含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 取墓頭回粉末(過五號篩)約0.5 g,精密稱定,置150 ml具塞錐形瓶中,加入甲醇20 ml,置超聲波清洗器中超聲提取40 min,水浴80 ℃揮干甲醇,加熱水20 ml使溶解,用乙醚脫脂2次,每次20 ml。取水層用水飽和的正丁醇萃取4次,每次50 ml,收集正丁醇液,加2倍5%氨水試液洗滌2次[7-10]。揮干正丁醇并用甲醇定容至5 ml容量瓶中,濾過,取續(xù)濾液1 ml,置10 ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品適量,加甲醇溶解并定容,制成濃度為0.524 mg/ml的溶液作為對照品溶液。

2.1.3 檢測波長的確定 精密吸取對照品溶液0.2 ml于10 ml具塞刻度試管中,80 ℃水浴揮干甲醇,冷卻后準確加入1%香草醛乙酸-高氯酸溶液0.5 ml,立即搖勻,60 ℃恒溫水浴上充分加熱15 min,取出,冷卻5 min,準確加入冰醋酸3 ml,搖勻,靜置5 min,以空白溶液為對照,在波長400-700 nm范圍內(nèi)掃描,結(jié)果顯示齊墩果酸在545 nm處有最大吸收,因此選擇545 nm為檢測波長。

2.1.4 顯色條件的研究

2.1.4.1 單因素試驗 試驗分別考察了反應溫度、顯色時間、顯色劑用量(1%香草醛乙酸-高氯酸溶液)及冰醋酸用量對試驗結(jié)果的影響,結(jié)果顯示反應溫度為80 ℃,顯色時間為25 min,顯色劑用量為0.5 ml,冰醋酸用量為3 ml時,為最佳條件。但因冰醋酸用量對顯色結(jié)果無顯著影響,故選擇反應溫度、顯色時間、顯色劑用量進行正交試驗。

2.1.4.2 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以吸光度為考察指標,反應溫度(℃)、顯色時間(min)、顯色劑用量(ml)為考察因素,每因素設(shè)定3個水平。采用L9(34)正交試驗表進行試驗。因素與水平見表1,試驗結(jié)果見表2,3。

表2 總皂苷正交試驗結(jié)果Table 2 The orthogonal test results of total saponins

表3 總皂苷方差分析表Table 3 Variance analysis of total saponins

由試驗結(jié)果可知,3個因素對顯色效果的影響為A>B>D。反應溫度對墓頭回總皂苷的測定有顯著性影響(P<0.05),顯色時間和顯色劑用量沒有顯著性影響(P>0.05)。實際試驗最佳組合為A2B1D3,統(tǒng)計學為A2B1D2,將結(jié)果重復3次,無統(tǒng)計學差異。為節(jié)約時間,最終選A2B1D2為最佳組合,即反應溫度為80 ℃,反應時間為20 min,顯色劑加入量為0.5 ml。

2.1.4.3 顯示條件的確定 根據(jù)單因素及正交試驗結(jié)果,確定墓頭回中總皂苷的含量測定方法為:精密吸取供試品溶液0.2 ml于10 ml具塞刻度試管中,80 ℃水浴揮干甲醇,冷卻后準確加入1%香草醛乙酸-高氯酸溶液0.5 ml,立即搖勻,80 ℃恒溫水浴上充分加熱20 min,取出,立即冷卻后準確加入冰醋酸3 ml,搖勻,靜置5 min,以相應試劑為空白溶液隨行對照,于545 nm測吸光度。

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取不同濃度對照品儲備液適量,按照“2.1.4.3”項下測定吸光度值,以對照品溶液的濃度C為橫坐標,以吸光度A為縱坐標作圖,得回歸方程:A=0.036 7C+0.027 1(r=0.997)。結(jié)果表明齊墩果酸在5.24-52.4 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5.2 精密度考察 精密吸取對照品溶液,按“2.1.4.3”項下方法連續(xù)測定6次吸光度,結(jié)果顯示RSD<3%,表明儀器精密度良好。

2.1.5.3 穩(wěn)定性考察 按“2.1.1”項下制備供試品溶液,每隔10 min按“2.1.4.3”項下方法測定一次吸光度,結(jié)果顯示RSD<3%,說明供試品溶液吸光度在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5.4 重復性考察 取墓頭回粉末6份,每份約0.5 g,精密稱定,按“2.1.1”項下的方法制備供試品溶液,按“2.1.4.3”項下方法測定,結(jié)果顯示RSD<3%,表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.5.5 加樣回收率考察 精密稱取已知總皂苷含量的墓頭回藥材干粉6份,每份約0.25 g,按樣品含有量與對照品1:1的比例加入齊墩果酸對照品,按“2.1.1”項下制備供試品溶液,按“2.1.4.3”項下方法顯色并測定總皂苷含量,計算回收率,結(jié)果見表4,平均加樣回收率為101.1%,RSD<3%,表明該方法準確性良好。

表4 總皂苷加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)Table 4 Results of recovery tests for total saponins (n=6)

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 取墓頭回藥材粉末(過五號篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加適量60%乙醇,超聲提取20 min,濾過,用同樣的方法處理濾渣,合并濾液,用60%乙醇定容于25 ml容量瓶中,即得[11]。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品適量,加60%乙醇溶解并定容,制成濃度為0.31 mg/ml的溶液作為對照品溶液。

2.2.3 檢測波長的選擇 精密吸取蘆丁對照品溶液2 ml,置于10 ml容量瓶中,加60%乙醇2 ml,加5%亞硝酸鈉溶液1 ml,放置6 min,加10%硝酸鋁溶液1 ml,放置6 min,加10%氫氧化鈉溶液2 ml,60%乙醇定容至刻度,搖勻,在20 ℃下,靜置15 min。以空白溶液為對照,分別用全波長掃描二者的吸收圖譜,結(jié)果顯示對照品溶液在507 nm處有最大吸光度,故選擇507 nm為檢測波長。

2.2.4 顯色條件的研究

2.2.4.1 單因素試驗 試驗分別考察了硝酸鋁溶液加入量、靜置時間、顯色溫度[12-14]對試驗結(jié)果的影響,結(jié)果顯示硝酸鋁溶液加入量為1.3 ml,靜置時間為25 min,顯色溫度為25 ℃時,為最佳條件。而且3個因素對顯色結(jié)果都有較大的影響,故對此3個因素進行正交試驗。

2.2.4.2 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以吸光度為考察指標,硝酸鋁溶液加入量(ml)、靜置時間(min)、顯色溫度(℃)為考察因素,每因素設(shè)定3個水平,采用L9(34)進行了正交試驗,因素與水平見表5,試驗結(jié)果見表6,7。

表5 總黃酮正交試驗因素與水平Table 5 Orthogonal analytical factors and levels of total flavonoids

表6 總黃酮正交試驗結(jié)果Table 6 The results of total flavonoids orthogonal test

表7 總黃酮方差分析表Table 7 Variance analysis of total flavonoids

由試驗結(jié)果可知,3個因素對顯色效果的影響為A>B>D。硝酸鋁溶液加入量(A)對總黃酮的測定有顯著性影響(P<0.05),靜置時間(B)和顯色溫度(D)沒有顯著性影響(P>0.05)。試驗最佳組合為A3B2D3,統(tǒng)計學最佳組合為A3B2D1,將結(jié)果重復3次,差異無統(tǒng)計學意義。為節(jié)約資源,最終選擇A3B2D1為最佳組合,即硝酸鋁溶液加入量為1.5 ml、靜置時間為25 min、顯色溫度為20 ℃。

2.2.4.3 顯色條件的確定 根據(jù)單因素及正交試驗結(jié)果,確定墓頭回中總黃酮的含量測定方法為:精密量取供試品溶液2 ml于10 ml容量瓶中,加60%乙醇2 ml,加5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml,放置6 min;加10%硝酸鋁溶液1.5 ml,放置6 min;加10%氫氧化鈉溶液2 ml,60%乙醇定容至刻度,搖勻,在20 ℃,靜置25 min。以相應試劑作空白對照,于507 nm處測定吸光度。

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取不同濃度對照品儲備液適量,按“2.2.4.3”項下同法測定吸光度,以對照品溶液的濃度C為橫坐標,以吸光度A為縱坐標作圖,得回歸方程:A=0.857 3C+0.158 3(r=0.995 4)。結(jié)果表明蘆丁在0.062-0.62 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5.2 精密度考察 精密吸取對照品溶液,按“2.2.4.3”項下方法連續(xù)測定6次吸光度,結(jié)果顯示RSD<3%,表明儀器精密度良好。

2.2.5.3 穩(wěn)定性考察 按“2.2.1”項下制備供試品溶液,每隔10 min按“2.2.4.3”項下方法測定一次吸光度,結(jié)果顯示RSD<3%,說明供試品溶液吸光度在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.4 重復性考察 取墓頭回粉末6份,每份約0.5 g,精密稱定,按“2.2.1”項下的方法配制備供試品溶液,按“2.2.4.3”項下方法測定,結(jié)果顯示RSD<3%,表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.5.5 加樣回收率考察 精密稱取已知總黃酮含量的墓頭回藥材干粉6份,每份約0.25 g,按樣品含量與對照品1:1的比例加入蘆丁對照品,按“2.2.1”項下制備供試品溶液,按“2.2.4.3”項下方法顯色并測定總黃酮含量,計算回收率,結(jié)果見表8,平均加樣回收率為100.91%,RSD<3%,表明該方法準確性良好。

表8 總黃酮加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)Table 8 Results of recovery test for total flavonoids (n=6)

3 討論

墓頭回首載于明代《救荒本草》之中,有“葉似野菊花葉而窄細;稍葉間開五瓣小黃花,其葉味微苦”的記載[15]。在《本草綱目》《植物名實圖考》等古代醫(yī)藥典籍[16,17]以及近現(xiàn)代藥學著作如《中藥材品種論述》《中國植物志》中多有記載[18,19]。但因歷史原因,各地對墓頭回來源的記載并不完全相同。如《甘肅省中藥材標準》記載墓頭回為“敗醬科植物糙葉敗醬或異葉敗醬的干燥根及根莖或鮮品”[20]?！吨腥A本草》記載為“敗醬科植物糙葉敗醬或異葉敗醬的干燥根”[2]。1987年版《山西省中藥材標準》記載為“敗醬科植物糙葉敗醬的干燥根”[1]。為了擴大試驗結(jié)果的應用范圍,本試驗選取了接受度較為廣泛的糙葉敗醬進行研究。

現(xiàn)代藥理研究表明,墓頭回中的黃酮類成分具有抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)靜的作用[21];皂苷類成分能夠提高機體免疫力,具有抗炎、抗菌的作用[22]。考慮到中藥有效成分對現(xiàn)代藥理學的作用,本試驗對墓頭回中總黃酮和總皂苷的測定方法進行研究。以吸光度為指標,對影響墓頭回中總黃酮測定的反應溫度、顯色時間、顯色劑用量進行考察;對影響總皂苷測定的硝酸鋁溶液加入量、靜置時間、顯色溫度進行考察,通過優(yōu)化顯色條件,確定了最佳顯色方式。同時采用方法學考察對此顯色方式進行評估,確定了方法簡便、結(jié)果可靠的測定方式,可以更加全面準確地評價墓頭回的質(zhì)量,也為墓頭回的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。但本試驗并未篩選出墓頭回質(zhì)量評價標志物,這為墓頭回的進一步研究提供了方向。