大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)人乳牙牙周膜干細(xì)胞炎癥模型的建立

劉 飛,池 韻,李錦沂,王盼曦,楊克宇,郭青玉*

(1西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院,陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710004;2西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科;3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院口腔科;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn)

牙周膜是位于牙根周圍的一種特殊的纖維結(jié)締組織,它維系著牙齒在牙槽骨中的位置,支持其發(fā)揮咀嚼功能[1]。牙周膜中未分化的間充質(zhì)細(xì)胞可根據(jù)機(jī)體需要分化為特定的細(xì)胞類型,例如成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等,在牙周組織的修復(fù)中起到了重要作用[2]。關(guān)于牙周膜干細(xì)胞的研究已成為口腔基礎(chǔ)研究中最熱門的方向之一[3]。

乳牙和恒牙具有不同的發(fā)育進(jìn)程,兩者的形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、生命周期也各不相同。當(dāng)恒牙序列萌出時(shí),乳牙的牙根吸收最終發(fā)生脫落,乳牙牙根在外界的刺激下更容易發(fā)生吸收[4,5]。有研究發(fā)現(xiàn)乳牙牙周膜含有成熟的干細(xì)胞,這些細(xì)胞的增殖速率、成脂分化能力、成骨分化能力等比恒牙牙周膜組織中的干細(xì)胞更強(qiáng)[6]。

乳牙根尖周炎是兒童口腔科的常見疾病,常伴有根分叉、根尖周區(qū)域明顯的骨質(zhì)破壞。目前認(rèn)為,根尖周炎是宿主防御機(jī)制與根管腔內(nèi)細(xì)菌相互作用的結(jié)果。脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)廣泛分布于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中,可引起局部發(fā)熱及白細(xì)胞反應(yīng)[7]。因其致病作用常用于體外炎癥模型的建立,例如RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞、牙齦上皮成纖維細(xì)胞及乳腺上皮細(xì)胞等[7-9]。同時(shí),LPS也在牙髓感染、根尖周炎、牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用[10]。作為細(xì)菌內(nèi)毒素,其對牙槽骨的吸收、牙周膜的降解都有一定的影響,在誘導(dǎo)體外牙周膜細(xì)胞炎性狀態(tài)中也有大量應(yīng)用[11]。

本研究采用大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)LPS刺激體外培養(yǎng)人乳牙牙周膜干細(xì)胞(human deciduous periodontal ligament cells, hdPDLSCs),通過檢測細(xì)胞活性及炎癥因子表達(dá),選擇合適的E.coliLPS濃度,以建立符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要的人乳牙根尖周炎細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司,美國),胎牛血清(FBS)(Gibco,美國),CD146、STRO-1、CD105、CD90、CD29、CD45、CD34抗體鼠來源單克隆抗體(Abcam,美國),E.coliLPS(Sigma,美國),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA,日本),ELISA試劑盒(IL-1β、IL-6、TNF-α)(聯(lián)科生物,中國)。實(shí)驗(yàn)在西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.2 細(xì)胞原代培養(yǎng)及純化

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào):[2016]045),征得患兒家長的知情同意,采集于西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科因乳牙滯留、外傷或咬合誘導(dǎo)而拔除的乳牙?；颊吆Y選標(biāo)準(zhǔn):無心臟病等全身系統(tǒng)性疾病,無乙肝、結(jié)核等傳染性疾病;患牙無齲壞、牙髓炎、根尖周炎等牙體及牙周相關(guān)疾病。

拔牙前使用碘伏消毒牙冠及牙齦2-3次,患牙拔除后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái),取根中1/3的牙周膜,Ⅰ型膠原酶及中性酶37 ℃消化40 min,加入含20%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基終止消化。原代細(xì)胞長出后進(jìn)行首次換液,之后2-3 d換液一次。當(dāng)細(xì)胞增殖至培養(yǎng)瓶底壁約70%時(shí)進(jìn)行傳代。取第3代細(xì)胞采用連續(xù)梯度稀釋法進(jìn)行純化。

1.3 細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測

取第4代對數(shù)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液加入1.5 ml EP管(1×106個(gè)細(xì)胞/管),分別加入直接熒光標(biāo)記的小鼠抗人CD146、STRO-1、CD105、CD90、CD29、CD45、CD34抗體20 μl。避光4 ℃孵育30 min,加入300 μl無菌PBS重懸,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞表面分子表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞多向分化能力檢測

將第4代對數(shù)期細(xì)胞采用成骨誘導(dǎo)液(含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基、地塞米松10 mol/L、L-抗壞血酸50 μg/ml、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L)培養(yǎng)28 d后,進(jìn)行茜素紅染色;采用成脂誘導(dǎo)液(含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基、地塞米松0.25 μmol/L、吲哚美辛10 μmol/L、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5 mmol/L、L-抗壞血酸2-磷酸鹽100 μmol/L)培養(yǎng)28 d后,進(jìn)行油紅O染色。

1.5 CCK-8檢測E. coli LPS處理后hdPDLSCs增殖活性

取第4代hdPDLSCs以2 000/孔的濃度接種96孔板,24 h后替換含不同終濃度的E.coliLPS(0,0.1,0.075,0.05,0.025,0.01 μg/ml)培養(yǎng)基,其中0 μg/ml為對照組。分別培養(yǎng)24,48,72 h后以1 ∶10的CCK-8溶液替換原液。37 ℃孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度(optical density, OD值)?？瞻讓φ战M為不含LPS的同種培養(yǎng)基,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,繪制細(xì)胞生長曲線圖。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)檢測炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)

取第4代hdPDLSCs以2×105/ml的細(xì)胞濃度接種于6孔板24 h替換為含不同終濃度的E.coliLPS培養(yǎng)基各2 ml,其中對照組為0 μg/ml,實(shí)驗(yàn)組為0.1,0.05,0.01 μg/mlE.coliLPS組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,24 h后提取RNA,進(jìn)行RT-PCR檢測。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄體系包括:5×PrimerScript RT Master Mix 2 μl,mRNA(10 μl體系最多使用500 ng mRNA)以及RNase Free H2O(補(bǔ)足至10 μl體系)。RT-PCR上機(jī)反應(yīng)液體系包括:SYBR Premix Taq Ⅱ 10 μl,前引物10 μmol/L 0.8 μl,后引物10 μmol/L 0.8 μl,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl,cDNA溶液2 μl,無菌蒸餾水6 μl,總計(jì)20 μl。炎癥因子引物序列見表1。

表1 炎癥因子引物序列Table 1 Sequence of inflammatory factors

1.7 ELISA檢測炎性因子蛋白表達(dá)

取第4代hdPDLSCs以2×105/ml的細(xì)胞濃度接種于6孔板24 h替換終濃度含0.05 μg/mlE.coliLPS的培養(yǎng)基,對照組為0 μg/ml,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24 h后離心取上清進(jìn)行IL-1β、IL-6、TNF-α的ELISA檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)7 d后,倒置顯微鏡下可見組織塊周圍長梭形細(xì)胞爬出,10 d后呈放射狀貼壁生長。細(xì)胞形態(tài)多為長梭形,偶可見多角形。3周后組織塊周圍細(xì)胞密集排列,覆蓋瓶底約70%。此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng),傳代后細(xì)胞3-5 d可長至瓶底約70%,細(xì)胞形態(tài)呈長梭形(見圖1)。

A.離體乳牙 B.原代培養(yǎng)中hdPDLCs自組織塊游離圖1 hdPDLCs的分離培養(yǎng)Figure 1 Primary culture of hdPDLCs

2.2 連續(xù)梯度稀釋法純化細(xì)胞

連續(xù)梯度稀釋培養(yǎng)法純化細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下挑選96孔板內(nèi)單個(gè)細(xì)胞的孔,培養(yǎng)2周后細(xì)胞生長覆蓋孔底70%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),依次接種于24孔板、6孔板擴(kuò)大培養(yǎng),得到純化的hdPDLSCs(見圖2)。

A.稀釋得到單個(gè)細(xì)胞 B.篩選出的單細(xì)胞形成克隆圖2 連續(xù)梯度稀釋法培養(yǎng)hdPDLSCsFigure 2 Culture of hdPDLSCs by serial dilution culture method

2.3 hdPDLSCs的鑒定

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物,顯示hdPDLSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞早期標(biāo)志物CD146(67.05%)和STRO-1(99.85%),高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105(99.94%)、CD90(100%)和CD29(100%),低表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45(1.72%)和CD34(0.31%,見圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,培養(yǎng)的hdPDLSCs符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)。

圖3 hdPDLSCs表面標(biāo)志物檢測Figure 3 Identification of cell surface markers of hdPDLSCs

成骨誘導(dǎo)28 d,茜素紅染色后發(fā)現(xiàn),hdPDLSCs誘導(dǎo)后形成密度、大小不一的紅色礦化結(jié)節(jié),礦化結(jié)節(jié)呈同心圓狀(見圖4A,B)。成脂誘導(dǎo)28 d,油紅O染色后發(fā)現(xiàn),hdPDLSCs誘導(dǎo)后形成油紅O陽性的串珠狀脂肪小滴,脂滴聚集呈簇狀(見圖4C)。

A.成骨分化 B.礦化結(jié)節(jié) C.成脂分化圖4 hdPDLSCs多向分化能力檢測Figure 4 Multidirectional differentiation ability test of hdPDLSCs

2.4 不同濃度E. coli LPS處理后的細(xì)胞增殖活性的變化

0-72 h內(nèi)6組細(xì)胞的OD值隨時(shí)間的延長均顯著增高(P<0.05)。0.1,0.075 μg/ml LPS分別刺激24,48,72 h時(shí),OD值較對照組顯著降低(P<0.05);0.05,0.025,0.01 μg/ml LPS分別刺激24,48,72 h時(shí),OD值與對照組相比未見明顯差異。因此可認(rèn)為當(dāng)LPS濃度0.075-<0.1 μg/ml時(shí),對hdPDLSCs增殖活性有顯著的抑制作用;當(dāng)LPS濃度小于0.05 μg/ml時(shí),對細(xì)胞的增殖活性無明顯影響(見圖5)。E.coliLPS作用24 h即可引起OD值的顯著變化,且LPS刺激0-72 h可維持OD值相同的變化趨勢;當(dāng)LPS的濃度小于等于0.05 μg/ml時(shí),細(xì)胞的增殖不受影響(見圖5)。因此選擇0.05 μg/ml的LPS刺激hdPDLCs 24 h進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

同濃度與24 h組相比,*P<0.05;同時(shí)間與0 μg/ml相比,#P<0.05圖5 CCK-8檢測hdPDLSCs在不同濃度的E. coli LPS刺激下的增殖活性Figure 5 Proliferation of hdPDLSCs stimulated by different concentrations of E. coli LPS

2.5 不同濃度E. coli LPS處理后的細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的變化

2.5.1E.coliLPS刺激下炎性因子mRNA水平表達(dá)的改變 real-time PCR結(jié)果顯示,0.01,0.025,0.05 μg/ml組IL-1β的mRNA表達(dá)的水平均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05),且0.05 μg/ml組IL-1β的mRNA表達(dá)水平顯著高于0.01 μg/ml組和0.025 μg/ml組(P<0.05)。0.01,0.025,0.05 μg/ml組IL-6的mRNA表達(dá)的水平均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05),且0.05 μg/ml組IL-6的mRNA表達(dá)水平顯著高于0.01 μg/ml組(P<0.05)。0.01,0.025,0.05 μg/ml組TNF-α的mRNA表達(dá)的水平均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05),且0.05 μg/ml組及0.025 μg/ml組TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著高于0.01 μg/ml組(P<0.05,見圖6)。即隨著LPS濃度的升高,炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)逐漸升高。

與0 μg/ml組相比,*P<0.05;與0.01 μg/ml組相比,#P<0.05;與0.025 μg/ml組相比,&P<0.05圖6 hdPDLSCs在不同濃度E. coli LPS刺激下IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)的變化Figure 6 The mRNA levels of IL-1β, IL-6,TNF-α in hdPDLSCs stimulated by different concentrations of E. coli LPS

2.5.2E.coliLPS刺激下炎性因子蛋白水平表達(dá)的改變 ELISA結(jié)果顯示,對照組細(xì)胞上清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量較低。與對照組相比較,0.05 μg/ml的E.coliLPS刺激hdPDLSCs 24 h后,細(xì)胞上清中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05,見圖7)。

與對照組相比,*P<0.05圖7 hdPDLSCs在E. coli LPS刺激下炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白分泌變化Figure 7 Protein levels of IL-1β, IL-6,TNF-α in hdPDLSCs stimulated by E. coli LPS

3 討論

進(jìn)行牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)時(shí),牙周膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)一直是限制研究進(jìn)行的重要步驟之一。傳統(tǒng)的牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)方法分為酶解法和組織塊消化法兩種常規(guī)方法。有學(xué)者[12]結(jié)合兩種原代培養(yǎng)方式的優(yōu)點(diǎn),總結(jié)出酶解組織塊法,Ⅰ型膠原酶處理組織塊后,將組織塊固定于壁底,4 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)基浸潤組織塊,可以取得更好的原代培養(yǎng)成功率。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用酶解法結(jié)合組織塊法可提高h(yuǎn)dPDLCs原代培養(yǎng)的成功率。為了分離得到乳牙的牙周膜干細(xì)胞,需要對培養(yǎng)得到的原代細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選。此法在一塊96孔板中完成細(xì)胞的梯度稀釋,節(jié)約了細(xì)胞用量,可以得到分離的單細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。

牙周膜組織中含有多種細(xì)胞成分,需進(jìn)行干細(xì)胞的表型鑒定及多向分化能力進(jìn)行驗(yàn)證[13]。但目前尚無公認(rèn)的鑒定標(biāo)志物進(jìn)行牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)特征鑒定。在不同研究中,采用的鑒定指標(biāo)各不相同[13,14]。有的研究采用單一指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn),也有采用多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合鑒定。常用的陽性標(biāo)志物包括:CD146、CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、STRO-1等,常用的陰性指標(biāo)包括CD45、CD34等[14]。本實(shí)驗(yàn)綜合多位學(xué)者的研究,對間充質(zhì)干細(xì)胞早期標(biāo)志物CD146、STRO-1,間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105、CD90、CD29,血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45、CD34進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明培養(yǎng)的hdPDLSCs是間充質(zhì)細(xì)胞來源,經(jīng)誘導(dǎo)后具有多向分化的潛能,可用于后續(xù)的試驗(yàn)研究。

以往學(xué)者進(jìn)行牙周膜干細(xì)胞的炎癥誘導(dǎo)時(shí),使用的LPS濃度各不相同。Andrukhov等[15]在研究E.coliLPS對人恒牙牙周膜干細(xì)胞炎癥效應(yīng)的影響時(shí),選擇1 μg/ml的濃度來刺激細(xì)胞;J?nsson等[16]在研究LPS對牙周膜干細(xì)胞IL-8及MCP-1表達(dá)水平的影響時(shí),選擇0.5 μg/ml的濃度為工作濃度;Kukolj等[17]則選擇了E.coliLPS 0.1-10 μg/ml作為炎癥誘導(dǎo)工作濃度;Li等[18]使用0.1 μg/ml的E.coliLPS誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)進(jìn)行研究;楊芳等[19]在研究LPS對人牙周膜干細(xì)胞的炎癥及骨穩(wěn)態(tài)效應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)中,比較了不同濃度LPS對人牙周膜干細(xì)胞IL-1β表達(dá)的促進(jìn)作用,最終選擇了1 μg/ml作為其刺激濃度;還有學(xué)者使用10 μg/ml作為炎癥誘導(dǎo)的工作濃度?？梢妼τ贚PS誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞炎癥狀態(tài)時(shí),LPS的工作濃度仍存在爭議。結(jié)合前人的研究,LPS的濃度選擇需要考慮兩方面的內(nèi)容:LPS的刺激對細(xì)胞的活性沒有明顯的抑制作用,并且細(xì)胞能表現(xiàn)出炎癥的狀態(tài)。上述研究結(jié)果均以人恒牙牙周膜干細(xì)胞作為研究對象,尚無對炎癥hdPDLSCs的探索。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了0-0.1 μg/ml的LPS濃度梯度,發(fā)現(xiàn)在0.01-0.05 μg/ml的濃度范圍內(nèi),LPS對于細(xì)胞活性沒有明顯的影響,而超過0.075 μg/ml后,LPS對細(xì)胞增殖活性存在明顯的抑制作用(P<0.05)。

乳牙生理性牙根吸收的過程中,炎癥相關(guān)因子IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)增多。hdPDLSCs通過調(diào)節(jié)炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)以及調(diào)節(jié)成骨、破骨相關(guān)因子的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)了破骨細(xì)胞的活化成熟以致乳牙發(fā)生生理性根吸收。IL-1、IL-6和TNF-α還可以作用于破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞直接發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在0.05 μg/ml的濃度下,不僅IL-1β、TNF-α這兩種關(guān)鍵炎性因子的表達(dá)受到明顯促進(jìn),其他炎癥相關(guān)因子如IL-6的表達(dá)也有明顯地提高(P<0.05)。因此0.05 μg/ml的E.coliLPS可作為誘導(dǎo)hdPDLSCs炎癥模型的適宜濃度。