利用IL-1A-eGFP慢病毒載體構(gòu)建SASP細(xì)胞監(jiān)測(cè)模型的研究

彭健愉,孫明軒,姚 琳,袁 源,劉肖雨,趙 威,林紫均,嚴(yán)詠恩,陳維春,劉新光,6,孫雪榮*

(1廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所,東莞 523808;2廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院;4廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院;5廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院;6廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所;*通訊作者,E-mail:xuerongsun@126.com)

細(xì)胞衰老(senescence)是機(jī)體衰老的重要基礎(chǔ),與多種老年性疾病密切關(guān)聯(lián)。衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)指衰老細(xì)胞出現(xiàn)分泌功能亢進(jìn),可分泌許多生物活性分子,包括細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子及蛋白酶等,參與多種生理和病理過程,這些分泌因子統(tǒng)稱為SASP因子。體內(nèi)衰老細(xì)胞如未能及時(shí)清除,可導(dǎo)致SASP因子蓄積,從而引起慢性炎癥,導(dǎo)致或加劇許多慢性疾病的發(fā)生。因此,尋找能調(diào)節(jié)SASP表達(dá)的藥物,特別是SASP抑制劑,是目前衰老領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

建立熒光標(biāo)記的SASP監(jiān)測(cè)模型,將為篩選SASP抑制劑提供便利。Kang等[1]構(gòu)建了一種監(jiān)測(cè)細(xì)胞衰老的模型,該模型將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的編碼序列與細(xì)胞衰老相關(guān)基因miR-146a的啟動(dòng)子融合,并將其包裝成慢病毒,感染人胚肺成纖維細(xì)胞IMR-90,從而通過綠色熒光監(jiān)測(cè)細(xì)胞衰老,但此模型只能用于判斷IMR-90細(xì)胞是否衰老,不能反映SASP的情況,且該細(xì)胞不能無限增殖,不適合大規(guī)模使用。因此,建立可無限增殖的SASP細(xì)胞監(jiān)測(cè)模型,仍十分必要。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),黑色素瘤細(xì)胞受到順鉑處理后,可出現(xiàn)細(xì)胞衰老,并且表達(dá)多種典型的SASP因子[2]。與文獻(xiàn)報(bào)道的SASP機(jī)制相符的是,在衰老的黑色素瘤中,白細(xì)胞介素1A(Interleukin 1A,IL-1A)既是SASP因子之一,同時(shí)又是SASP發(fā)生的上游調(diào)節(jié)者,可促進(jìn)其他SASP因子的表達(dá)[2-4],因此,利用IL-1A建立SASP檢測(cè)模型,能更好地反映細(xì)胞整體SASP狀態(tài)。為此,本研究構(gòu)建了IL-1A-eGFP表達(dá)的慢病毒載體,并利用該病毒感染黑色素瘤M14細(xì)胞,建立了可有效監(jiān)測(cè)SASP強(qiáng)度的細(xì)胞模型,為后續(xù)篩選SASP抑制劑等研究提供便利。

1 材料與方法

1.1 試劑和細(xì)胞系

人黑色素瘤M14細(xì)胞購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。高糖DMEM、0.25% EDTA胰酶、Optimem、胎牛血清、嘌呤霉素(Puromycin)、熒光染料PowerUpTMSYBR Green Master Mix購自美國Gibco公司。Trizol購自美國Life Technologies公司。順鉑(Cisplain,CDDP)購自美國Sigma-Aldrich公司。慢病毒顆粒(CS-HPRM30539-LvPF02-01)依托廣州易錦生物技術(shù)公司(GeneCopoeia,Inc.)構(gòu)建,經(jīng)測(cè)序及酶切驗(yàn)證,慢病毒顆粒分裝為每管50 μl,-80 ℃保存。包裝質(zhì)粒、293Ta細(xì)胞、Lenti-PacTMHIV慢病毒包裝試劑盒、Lenti-PacTM慢病毒顆粒濃縮試劑由廣州易錦生物技術(shù)公司提供。細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 構(gòu)建慢病毒載體并制備DNA-EndoFectin轉(zhuǎn)染復(fù)合物

委托公司利用pEZX-LvPF02質(zhì)粒構(gòu)建慢病毒IL-1A-eGFP表達(dá)載體后,用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SalⅠ進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序鑒定。

為了感染包裝細(xì)胞,先制備DNA-EndoFectin轉(zhuǎn)染復(fù)合物,取一無菌Ep管(A管)加入慢病毒載體的表達(dá)質(zhì)粒50 μg、Lenti-PacTM混合包裝質(zhì)粒100 μl(0.5 μg/μl),再添加Optimem補(bǔ)齊至4 ml;取另一無菌Ep管(B管),加入轉(zhuǎn)染試劑300 μl,添加Optimem補(bǔ)齊至4 ml。一邊輕柔渦旋A管,一邊往A管滴加B管的溶液,直到B管溶液全部滴加完畢。溶液混合后,室溫放置15 min。

1.3 準(zhǔn)備和感染包裝細(xì)胞

用293Ta細(xì)胞作為慢病毒包裝細(xì)胞,在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前,將1.4×106個(gè)293Ta細(xì)胞接種到10 cm培養(yǎng)皿,加入10% FBS DMEM在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。將鋪板培養(yǎng)的293Ta細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出,將DNA-Endo-Fectin轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿,以8字形水平輕柔晃動(dòng)細(xì)胞板,使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分散,在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)12 h。轉(zhuǎn)染12 h后,棄去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的舊培養(yǎng)液,PBS洗一次,用10% FBS DMEM繼續(xù)培養(yǎng),準(zhǔn)備收獲慢病毒顆粒。

1.4 收獲慢病毒顆粒

轉(zhuǎn)染操作的48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,以2 000g離心10 min去除細(xì)胞碎片,獲得慢病毒的粗病毒液。粗病毒液經(jīng)快速濃縮操作(使用Lenti-PacTM慢病毒顆粒濃縮試劑)后獲得高濃度慢病毒液,按Lenti-PacTMHIV慢病毒包裝試劑盒說明書進(jìn)行慢病毒滴度檢驗(yàn)。

1.5 慢病毒感染黑色素瘤M14細(xì)胞

消化M14細(xì)胞,取1×104個(gè)細(xì)胞到12孔板中,待細(xì)胞貼壁后,按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=20的比例,每孔先加入484 μl 10% FBS DMEM,再加入16 μl慢病毒原液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h后,棄含病毒的舊培養(yǎng)液,PBS洗2次,用1 ml 10% FBS DMEM繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。棄舊培養(yǎng)液,用PBS洗2次,加入1 ml新培養(yǎng)液和1 μmol/L嘌呤霉素,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)72 h;棄舊培養(yǎng)液,用PBS洗2次,加入1 ml新培養(yǎng)液和6 μmol/L嘌呤霉素,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)72 h,獲得抗嘌呤霉素的M14細(xì)胞株。

1.6 單克隆挑取并用CDDP進(jìn)行功能篩選

為了獲得基因型均一的細(xì)胞株,將500個(gè)嘌呤霉素篩選后的M14細(xì)胞種于10 cm培養(yǎng)皿進(jìn)行單克隆培養(yǎng),待克隆形成后挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)。取0.5 μl胰酶作用于單克隆細(xì)胞,待細(xì)胞變圓后用1 μl含10% FBS DMEM終止消化,吸取并重懸細(xì)胞,進(jìn)行種板和初步擴(kuò)增。

為鑒定挑取的單克隆細(xì)胞衰老后能否表達(dá)綠色熒光,將擴(kuò)增后的單克隆細(xì)胞重新種板,并分成兩組,一組接種至24孔板,第2天用2 μmol/L CDDP處理24 h,用PBS洗2次,換成10% FBS DMEM液繼續(xù)培養(yǎng)至第5天,期間用EVOS FL Auto全自動(dòng)活細(xì)胞顯微成像系統(tǒng)(美國Life Technologies公司)連續(xù)觀察熒光產(chǎn)生情況;另一組常規(guī)培養(yǎng),用于進(jìn)一步擴(kuò)增和凍存。將能產(chǎn)生熒光的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、凍存,經(jīng)復(fù)蘇和傳代后,用CDDP重新檢測(cè),發(fā)現(xiàn)依然能產(chǎn)生熒光,將此穩(wěn)轉(zhuǎn)M14-IL-1A-eGFP細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(β-gal)活性染色

采用上述方法,用CDDP誘導(dǎo)M14-IL-1A-eGFP細(xì)胞衰老后(用溶劑為陰性對(duì)照),參照細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色。棄舊培養(yǎng)基,用PBS洗1次,加固定液室溫固定15 min,棄固定液,用PBS洗3次,每次3 min,加入配好的染色工作液,37 ℃孵育48 h后,在倒置顯微鏡(Nikon ECLIPSE TS100)下觀察及拍照。

1.8 熒光定量RT-PCR檢測(cè)IL-1A、IL-1B及IL-8表達(dá)水平

取CDDP或溶劑處理后的M14-IL-1A-eGFP細(xì)胞,使用Trizol法提RNA,按HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。熒光定量PCR采用10 μl反應(yīng)體系,其中cDNA模板為0.75 μl,上下游引物共1 μl,SYBR Green染料為5 μl,高壓滅菌超純水3.25 μl。反應(yīng)程序按SYBR Green Master Mix設(shè)置。以GAPDH為內(nèi)參基因,引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 慢病毒表達(dá)載體的鑒定

所構(gòu)建的IL-1A-eGFP慢病毒表達(dá)載體,經(jīng)NcoⅠ和SalⅠ分別進(jìn)行酶切鑒定,再經(jīng)測(cè)序鑒定,結(jié)果符合預(yù)期(見圖1)。濃縮后的慢病毒滴度約為1.69×108TU/ml(1 TU/ml=100 copies/ml)。

2.2 SASP細(xì)胞模型的建立及鑒定

用IL-1A-eGFP慢病毒感染黑色素瘤M14細(xì)胞后,經(jīng)過嘌呤霉素篩選,挑取單克隆培養(yǎng)后,獲得形態(tài)均勻,生長狀態(tài)良好的M14-IL-1A-eGFP細(xì)胞。將該細(xì)胞在10%FBS DMEM中培養(yǎng),細(xì)胞生長迅速,狀態(tài)良好,邊界清楚,形態(tài)與常規(guī)培養(yǎng)的M14細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。

常規(guī)培養(yǎng)條件下,在藍(lán)色激發(fā)光下,僅少數(shù)M14-IL-1A-eGFP細(xì)胞有較弱的綠色熒光,可能與M14細(xì)胞有一定的IL-1A基礎(chǔ)表達(dá)量有關(guān)。加入CDDP后,M14-IL-1A-eGFP細(xì)胞形態(tài)明顯變大,增殖明顯減慢,約24-48 h后可以觀察到明亮的綠色熒光,繼續(xù)培養(yǎng)到第5天,熒光進(jìn)一步增強(qiáng)(見圖2A)。衰老相關(guān)β-gal染色結(jié)果顯示,加入CDDP后第5天,細(xì)胞呈明顯藍(lán)染,而溶劑處理組無明顯染色(見圖2B)。RT-PCR進(jìn)一步證實(shí),CDDP處理后的第5天,SASP相關(guān)基因包括IL-1A、IL-1B和IL-8,表達(dá)明顯增強(qiáng)(見圖2C),這說明CDDP誘導(dǎo)M14-IL-1A-eGFP細(xì)胞出現(xiàn)了衰老和SASP,同時(shí)也證明綠色熒光可有效監(jiān)測(cè)SASP的發(fā)生。另外,M14-IL-1A-eGFP細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇及多次傳代后,表型穩(wěn)定,說明該細(xì)胞為穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

M1.DNA Ladder 6000;1.病毒載體;2.病毒載體經(jīng)NcoⅠ酶切后的產(chǎn)物;3.病毒載體經(jīng)SalⅠ酶切后的產(chǎn)物;M2.DNA Ladder 100;M3.DNA Ladder 15 000圖1 IL-1A-eGFP慢病毒表達(dá)載體驗(yàn)證Figure 1 Verification of IL-1A-eGFP Lentiviral Expression Vector

圖2 誘導(dǎo)M14-IL-1A-eGFP細(xì)胞衰老并鑒定熒光和SASP因子表達(dá)Figure 2 Induction of senescence and detection of fluorescence and SASP expression in M14-IL-1A-eGFP cells

3 討論

SASP因子分泌后進(jìn)入微環(huán)境或體循環(huán)中,可發(fā)揮多種生物學(xué)功能。SASP因子既可通過自分泌途徑加強(qiáng)衰老細(xì)胞的衰老狀態(tài),也可通過旁分泌途徑誘導(dǎo)相鄰細(xì)胞衰老[5-7]。SASP還參與胚胎發(fā)育和成型,可激活免疫系統(tǒng),促進(jìn)傷口愈合、修復(fù)或重塑組織等。但SASP因子過多或存在時(shí)間過長,會(huì)形成炎性微環(huán)境,從而促進(jìn)癌癥和衰老相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展[8-11]。SASP因子發(fā)揮的生物學(xué)作用取決于分泌因子的種類、數(shù)量和局部微環(huán)境等。

關(guān)于SASP的發(fā)生機(jī)制,已有較多研究。SASP的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)主要與DNA損傷[12-14]、NF-κB信號(hào)通路[15,16]、p38MAPK信號(hào)通路[17,18]、mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19,20]、NLRP3炎性小體[5,21]、微小RNA(microRNAs,miRNA)[22,23]等有關(guān),近年還發(fā)現(xiàn),cGAS-STING通路[24,25],及GATA4[1,26]、IFI16[27]基因也參與調(diào)節(jié)SASP。盡管如此,仍有很多未知的SASP調(diào)節(jié)機(jī)制有待闡明,本研究提供的SASP模型將有助于探究SASP發(fā)生及調(diào)節(jié)機(jī)制。

隨著年齡的增長,衰老細(xì)胞逐漸累積,衰老人群免疫力低下,導(dǎo)致衰老細(xì)胞不完全清除和SASP因子堆積。文獻(xiàn)報(bào)道,清除體內(nèi)衰老細(xì)胞,可以延緩機(jī)體衰老,改善多種老年相關(guān)性疾病的癥狀,機(jī)制與減少SASP因子產(chǎn)生有關(guān)[28]。因此,利用SASP抑制劑減少SASP因子產(chǎn)生,有望在衰老相關(guān)慢性病的防治中發(fā)揮重要作用。目前已報(bào)道的SASP抑制劑有地塞米松[29]、雷帕霉素[3,19]、二甲雙胍[30]、UBX0101[31]等,但這些藥物大多有其他生物效應(yīng),容易產(chǎn)生副作用。因此,尋找更特異的SASP抑制劑,尤為重要。建立熒光標(biāo)記的SASP細(xì)胞模型,將可為大規(guī)模篩查特異SASP抑制劑提供方便。

已有不少研究者通過構(gòu)建“啟動(dòng)子-熒光蛋白”來監(jiān)測(cè)某些分子的激活[1,32,33],但用于監(jiān)測(cè)SASP的相關(guān)質(zhì)?；蚣?xì)胞,鮮見報(bào)道。IL-1A既是SASP成分之一,也是SASP上游調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)下游SASP因子如IL-6、IL-8等表達(dá)[2-4,34]。故選擇IL-1A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白作為SASP發(fā)生的標(biāo)志,比其他SASP因子更具有代表性,有望更好地反映整體SASP狀態(tài)。

本課題組已報(bào)道[2],黑色素瘤細(xì)胞(如A375、M14等)受到DNA損傷時(shí),可出現(xiàn)典型的衰老形態(tài)和SASP表型,適用于進(jìn)行細(xì)胞衰老及SASP相關(guān)研究。本文以黑色素瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)建立的SASP細(xì)胞監(jiān)測(cè)模型,可無限擴(kuò)增,從而能保證數(shù)量充足。

綜上所述,本研究通過慢病毒將IL-1A-eGFP轉(zhuǎn)入黑色素瘤細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞衰老后,IL-1A表達(dá)上調(diào)而驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白表達(dá),可用熒光顯微鏡觀測(cè),從而了解SASP發(fā)生與否及程度。本SASP模型的優(yōu)點(diǎn)在于,可反映SASP整體狀態(tài),可無限擴(kuò)增,凍存方便,有望為SASP相關(guān)研究提供便利。