顯微鏡輔助下精準(zhǔn)切除術(shù)在裸鼠非局部晚期結(jié)腸癌中的應(yīng)用

文 丹,楊宇慎,汪 準(zhǔn),趙雪峰

(1大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院普外科,大連 116021;2大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院肛腸三科;*通訊作者,E-mail:zoserbong@163.com)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種全球性的惡性疾病,每年約有140萬新發(fā)病例,其中早期CRC的發(fā)病率正在逐年上升[1]。早期CRC被定義為可完全切除,且無鄰近器官、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處部位受累的疾病[2]。但有相關(guān)研究指出,約16%的局限性黏膜下浸潤性CRC可能早已存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3],這與患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。Goodwin等[4]指出CRC患者術(shù)后3年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)80%,其中約5%-35%的Ⅰ-Ⅲ期患者死于術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,早期的篩查和診斷、明確的分期、精準(zhǔn)的治療均影響著患者的預(yù)后。由于精準(zhǔn)醫(yī)療理念的逐漸深化,針對早期惡性腫瘤的精準(zhǔn)切除取得了一定的進(jìn)展,如以前哨淋巴結(jié)活檢(SLNB)為指導(dǎo)的精準(zhǔn)切除在早期乳腺癌中的成功實(shí)施,這一理念也已被應(yīng)用于胃癌、直腸癌等消化道腫瘤的治療。為了進(jìn)一步評估精準(zhǔn)切除在早期結(jié)直腸癌(CRC)中的實(shí)用性,建立相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型或許是一個(gè)有效的方式。

近年來,越來越多的動(dòng)物模型被應(yīng)用于各種惡性腫瘤的機(jī)制闡述、藥物療效評估和新藥開發(fā)等方面的研究。但是，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)鼠科動(dòng)物的生理解剖局限，如腸管小、腸壁薄等，行腸切除手術(shù)難度較大,所以目前對CRC的手術(shù)模型仍停留在模型建立的初級階段,且罕有報(bào)道。同時(shí),隨著生物醫(yī)學(xué)研究的成像工具如MRI、Micro PET-CT和IVIS(invivoimage system)等的出現(xiàn),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的真實(shí)性和可信度也備受關(guān)注。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體狀態(tài)下通過非侵入性手段對體內(nèi)標(biāo)記的細(xì)胞或分子的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測和定量剖析,從而使腫瘤或疾病的發(fā)生發(fā)展過程直觀化和圖像化[5,6]。這不僅改變了過去以解剖為主要評價(jià)手段的形勢,減少了人力、物力上的消耗,還為動(dòng)物模型提供了更具說服力和可信度的直觀化證據(jù)。事實(shí)上,已經(jīng)有許多用熒光素酶標(biāo)記的轉(zhuǎn)移性腫瘤模型被報(bào)道[7-9]。因此本文中,我們嘗試建立一種裸鼠非局部晚期結(jié)腸癌(non-local advanced colon cancer, NLACC)精準(zhǔn)切除模型來模擬臨床早期CRC的外科治療情況,并通過組織病理學(xué)檢測和影像學(xué)分析初步評估顯微鏡輔助下區(qū)段切除術(shù)(microscopic assisted limited colectomy, MALC)對NLACC裸鼠的療效,從而驗(yàn)證MALC模型的技術(shù)可行性和腫瘤學(xué)安全性。

1 材料和方法

1.1 材料

CT-26-Fluc鼠源性結(jié)直腸癌細(xì)胞由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供;BALB/c品系裸鼠共20只,7周齡雌鼠,體質(zhì)量18-20 g,由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室代為購買。SMZ-B2/T2體視顯微鏡和異氟烷吸入麻醉藥及動(dòng)物麻醉系統(tǒng)均由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CT-26-Fluc鼠源性結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中,并在37 ℃、5%CO2、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)傳代培養(yǎng)。每2-3 d更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,用PBS潤洗2次,經(jīng)胰酶(0.25% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA)消化后,1 500 r/min離心5 min。然后用無血清的培養(yǎng)基洗滌3次后再使細(xì)胞重懸。顯微鏡下計(jì)數(shù),用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4×107/ml,均制備成1 ml細(xì)胞懸液。冰浴中保存,備用(30 min內(nèi)完成接種)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 參與模型的實(shí)驗(yàn)裸鼠共20只。所有實(shí)驗(yàn)裸鼠被安置在專用鼠類塑料籠上,不超過4只/籠;并在控制溫度(21±2)°C、濕度(50±10)%和照明(12-12 h光暗循環(huán))的條件下生長。試驗(yàn)開始前均保持1周的馴化期。所有小鼠的操作和治療都是按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》中規(guī)定的程序進(jìn)行的。該實(shí)驗(yàn)方案已獲得大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在研究結(jié)束時(shí),所有裸鼠在全身麻醉下處死。

1.2.3 動(dòng)物模型設(shè)計(jì) 制模前1周仔細(xì)了解BALB/c裸鼠生活習(xí)性,禁止一切刺激性操作。首先,建立穩(wěn)定的原發(fā)性結(jié)腸癌裸鼠模型(NALCC模型);通過1周的觀察期后,將這些模型隨機(jī)分成兩組,分別為MALC組和假手術(shù)組,每組10只;術(shù)后觀察期為3周。觀察期結(jié)束后所有實(shí)驗(yàn)裸鼠均被安樂死,并做組織病理學(xué)檢查。

1.2.3.1 非局部晚期結(jié)腸癌(NALCC)模型的建立 實(shí)驗(yàn)裸鼠用異氟烷吸入麻醉,取下腹部正中切口約5-10 mm進(jìn)入腹腔;用31G針將含2×106個(gè)CT-26-Fluc的細(xì)胞懸液約50 μl水平接種到20只BALB/c裸鼠的結(jié)腸壁黏膜下層和肌層之間。全程在SMZ-B2/T2體視顯微鏡下操作。注射部位位于距盲腸根部約30 mm的結(jié)腸(相當(dāng)于人升結(jié)腸段)。針插入深度約為0.5 mm。注射完成后,逐層縫合關(guān)閉腹腔。

1.2.3.2 分組及其處理 NALCC模型建立后隨機(jī)分為MALC組和假手術(shù)組,每組10只。1周后,MALC組施行顯微鏡輔助下以腫瘤為中心+周圍水腫腸管切除的區(qū)段切除手術(shù),切除范圍為距腫瘤兩側(cè)緣約1 cm的腸段。收集切除腸段行術(shù)后病理檢查,明確病變性質(zhì)。之后行結(jié)腸兩斷端端-端吻合。結(jié)腸吻合完成后,反復(fù)確認(rèn)吻合口血供、有無梗阻、出血、滲漏等。確認(rèn)完畢后,逐層關(guān)腹。操作全程在顯微鏡輔助下完成,所用機(jī)械均為微創(chuàng)手術(shù)機(jī)械,如眼科無損傷鑷、鼠類專用鈦夾、腸鉗或血管鉗以及10-0血管縫線等。而假手術(shù)組施行顯微鏡輔助下單純開關(guān)腹手術(shù)(MAOCS),不做腸切除。手術(shù)過程中注意維持裸鼠體溫。

1.2.4 解剖裸鼠和觀察指標(biāo) 常規(guī)記錄實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕媲闆r。手術(shù)3周后,在全麻狀態(tài)下處死所有模型。解剖過程中記錄血性腹水、腹膜、淋巴結(jié)及腹腔內(nèi)臟器轉(zhuǎn)移情況,注意結(jié)腸吻合口或原位瘤組織生長情況。同時(shí),還需注意胸腔及顱內(nèi)等腹腔外組織有無轉(zhuǎn)移,凡可疑病灶均需及時(shí)取材送檢。

1.2.5 生物發(fā)光圖像 全麻和腹部皮膚消毒同上,利用無菌注射器將D-熒光素鉀鹽注入裸鼠腹腔內(nèi),約3 mg/只。IVIS活體成像系統(tǒng)和圖像軟件在6 min內(nèi)即可對裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生物發(fā)光信號進(jìn)行收集和量化剖析,系統(tǒng)還可識別和測量感興趣區(qū)域(region of interest value, ROI值)內(nèi)的腫瘤大小和腫瘤細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 組織病理學(xué)檢測 對所有從手術(shù)和尸檢中獲得的標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢測。將標(biāo)本固定、脫水、透明和浸蠟后用石蠟包埋,按4 μm厚度切片;再用蘇木精-伊紅染色(HE染色)后顯微鏡下觀察檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組建模情況

BALB/c裸鼠NLACC模型成功率為100%(20/20),模型制作過程順利,無1例死亡。術(shù)后結(jié)腸原位腫瘤組織病理學(xué)檢測符合NLACC病理過程(見圖1)。兩組手術(shù)成功率和存活率均為100%。兩組在術(shù)中無1例死亡,且MALC組術(shù)后3周無1例出現(xiàn)腸梗阻、穿孔、出血、吻合口漏或死亡等情況,提示MALC在技術(shù)上是可行的。

2.2 影像學(xué)檢測分析

用IVIS系統(tǒng)定期檢測兩組模型術(shù)前和術(shù)后腫瘤的生物學(xué)信號(ROI值)。兩組術(shù)前影像學(xué)檢測提示NLACC模型的成瘤率為100%。影像學(xué)檢測結(jié)果提示,術(shù)后MALC組的ROI值較假手術(shù)組顯著下降,且較本組術(shù)前的ROI值明顯降低;而假手術(shù)組術(shù)后ROI值較術(shù)前顯著上升,且其敏感區(qū)域內(nèi)的熒光面積呈進(jìn)行性增大趨勢,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 319.537,P<0.01),提示MALC對裸鼠NLACC可達(dá)到近似根治性切除(R0)的療效,且術(shù)后3周內(nèi)無復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移(見圖2)。

2.3 組織形態(tài)學(xué)和病理學(xué)檢查分析

手術(shù)3周后,在全麻下處死所有實(shí)驗(yàn)裸鼠,并行組織病理學(xué)檢測。其中,MALC組裸鼠腹腔內(nèi)未見復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移病灶,且結(jié)腸吻合口愈合良好,無吻合口狹窄、近端腸管擴(kuò)張和腸壁淤血等腸梗阻表現(xiàn)。病檢顯示吻合口符合瘢痕性愈合過程,腸壁未見腫瘤細(xì)胞浸潤(見圖3A-D)。而假手術(shù)組裸鼠的結(jié)腸原位瘤明顯突出于結(jié)腸腸壁,腸壁水腫、淤血明顯,所有裸鼠均呈現(xiàn)腸梗阻表現(xiàn),病理學(xué)檢測提示腸壁結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,腫瘤細(xì)胞已浸及腸壁全層(見圖3E-H);此外,假手術(shù)組裸鼠的腹腔內(nèi)還可見散在的轉(zhuǎn)移性病灶,其中有4例出現(xiàn)血性腹水,1例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,但未見肝轉(zhuǎn)移和腹膜種植轉(zhuǎn)移(見表1);血性腹水和淋巴結(jié)病檢均可見腫瘤細(xì)胞。由此可見,MALC不僅可到達(dá)臨床R0切除,且無吻合口狹窄、腸梗阻等手術(shù)并發(fā)癥,術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率也十分低。

A-C.MALC組裸鼠的解剖,無腹水、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和腸梗阻;E-G.假手術(shù)組裸鼠的解剖,存在血性腹水、局部浸潤和腸梗阻等情況;D,H.分別為MALC組吻合口腸壁的HE染色(可見正常上皮細(xì)胞)和假手術(shù)組梗阻腸壁的HE染色(可見癌細(xì)胞浸潤)圖3 兩組裸鼠的組織標(biāo)本大體觀和鏡下觀差異Figure 3 Macroscopic and microscopic appearance of tumor tissues after microscope-assisted surgery

表1 兩組結(jié)腸癌手術(shù)模型的組織病理學(xué)檢測結(jié)果Table 1 Comparison of histopathological results between two groups

3 討論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理念的不斷深化,前哨淋巴結(jié)導(dǎo)航手術(shù)(SNNS)[10]已被成功應(yīng)用于早期乳腺癌[11,12]和早期胃癌[13]等疾病的精準(zhǔn)外科治療。事實(shí)上,精準(zhǔn)切除手術(shù)也已應(yīng)用于較早期CRC的治療,如內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)(EMR)、腫瘤的局部切除+前哨淋巴結(jié)清掃等。然而,目前這種精準(zhǔn)化和縮小化的手術(shù)在結(jié)直腸癌臨床應(yīng)用中仍存在一些爭議。因此,本研究通過構(gòu)建理想的動(dòng)物模型充分模擬結(jié)直腸癌病理學(xué)變化和其臨床治療情況,從而驗(yàn)證精準(zhǔn)切除在裸鼠NLACC治療中的可行性和安全性。

為制作精準(zhǔn)切除模型,首要步驟就是理想的NLACC模型的制作。換句話說,我們應(yīng)該選用與人結(jié)腸癌具有相似病理特征,并能充分模擬其臨床治療情形的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中,我們通過原位細(xì)胞微注射(OCMI)程序在BALB/c裸鼠結(jié)腸壁的黏膜下層注射結(jié)直腸癌細(xì)胞株形成了NLACC模型。通過無菌微吸管(31G)將高濃度的結(jié)腸癌細(xì)胞直接原位注射在黏膜下層沉積,黏膜下層靠近黏膜層,即人類結(jié)腸癌起始部位[14,15]。進(jìn)入到結(jié)腸局部微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞,一旦建立了正確的相互作用,就可以自由遷移,到達(dá)黏膜下豐富的淋巴管和血管,從而通過血流擴(kuò)散至鄰居器官或組織。這非常適合于需要在短時(shí)間內(nèi)形成腫瘤的研究[16],也有助于提高腫瘤攝取率和傳播率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),裸鼠NLACC模型1周內(nèi)的成瘤率為100%,且術(shù)后結(jié)腸原位腫瘤組織病理學(xué)檢測符合NLACC病理過程(見圖1)。因此,我們認(rèn)為本研究建立的NLACC模型是一種能近似模擬人NLACC的有效模型。

此外,這類模型對于研究轉(zhuǎn)移級聯(lián)的后續(xù)過程也特別有效,包括淋巴或血源性轉(zhuǎn)移和器官移植轉(zhuǎn)移[17]。與轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠相比,我們的NLACC模型不僅可在短期內(nèi)形成腫瘤,而且更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。根據(jù)影像學(xué)檢測,我們的NLACC模型制作后2 d即可檢測到腫瘤信號,5 d即可顯示出明顯的腫瘤輪廓,且腫瘤大小隨時(shí)間延長呈進(jìn)行性增長趨勢。而轉(zhuǎn)基因小鼠形成腫瘤前需較長的潛伏期(1.5-2年),而且是在小腸中而不是大腸,同時(shí)常顯示出與人類不同的繼發(fā)性基因突變[18]。而相比于腫瘤碎片結(jié)腸漿膜包埋方法(SOI),OCMI表現(xiàn)了不同的傳播能力的差異。雖然SOI能較早地發(fā)生轉(zhuǎn)移,但它只在肝臟或肝臟引流淋巴管中產(chǎn)生腫瘤灶[19,20],卻不能誘導(dǎo)向肺或結(jié)腸引流的淋巴管傳播。相反,OCMI程序允許腫瘤細(xì)胞浸潤腸壁的淋巴管,然后經(jīng)腸系膜淋巴結(jié)-血流擴(kuò)散-腹膜或遠(yuǎn)處器官內(nèi)形成轉(zhuǎn)移灶,如在人類結(jié)腸癌中觀察到的那樣[21]。并且,SOI模型因種植部位的限制,無法近似模擬早期結(jié)腸癌。本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和其他遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移,這考慮與細(xì)胞株本身的轉(zhuǎn)移能力和觀察期長短有關(guān)。已有研究表明,使用人結(jié)直腸癌細(xì)胞株的OCMI模型,可見較多的肝轉(zhuǎn)移和其他轉(zhuǎn)移[16]。因此,我們認(rèn)為本研究建立的NLACC模型可近似地模擬臨床早期結(jié)腸癌的病理學(xué)變化過程。不僅如此,在建模中,采用了全麻、全程顯微鏡下操作、成角注射和局部加壓等細(xì)節(jié)上的處理以及前期的大量預(yù)實(shí)驗(yàn),也大大提高了模型的可信度和準(zhǔn)確性。

近年來,雖然動(dòng)物模型種類越來越多,但目前還沒有關(guān)于結(jié)直腸癌動(dòng)物手術(shù)模型的報(bào)道。因此,我們在模擬臨床早期結(jié)腸癌病理過程的基礎(chǔ)上建立了一種裸鼠NLACC的精準(zhǔn)切除模型,即MALC模型。實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)理念來源于早期結(jié)腸癌的腫瘤局部切除+前哨淋巴結(jié)清掃和早期直腸癌的全系膜切除術(shù)的精準(zhǔn)切除概念的更新[22,23]。由于嚙齒動(dòng)物自身的局限性,難以用肉眼或放大鏡進(jìn)行精確的根治性手術(shù),我們選擇了以腫瘤為中心的局部切除和周圍水腫腸管切除的區(qū)段性切除手術(shù)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,MALC組模型施行MALC手術(shù),假手術(shù)組施行MAOCS手術(shù),雖然兩種手術(shù)刺激強(qiáng)度不同,但是兩組模型在術(shù)后3周內(nèi)均無1例死亡,考慮手術(shù)刺激強(qiáng)度對結(jié)果影響較小;不僅如此,MALC模型術(shù)后無腸穿孔或梗阻、出血、感染和吻合口漏等并發(fā)癥的出現(xiàn),且其術(shù)后無復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。病理學(xué)和影像學(xué)檢測均顯示相同結(jié)果。這提示MALC精準(zhǔn)切除手術(shù)不僅具有可操作性和有效性,其在腫瘤學(xué)行為上也具有安全性和可靠性。臨床研究數(shù)據(jù)表明,仍有部分局限性黏膜下浸潤性結(jié)腸癌可能存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而且一些新的無癥狀的腫瘤也存在持續(xù)的風(fēng)險(xiǎn),如晚期腺瘤和早期錯(cuò)時(shí)結(jié)腸癌[24],而這些往往因漏診而失去最佳治療時(shí)機(jī),本研究建立的模型或許可以為此提供研究基礎(chǔ)。此外,為了提高模型的可靠性,我們還做了很多其他的工作。首先,全麻的選擇有利于手術(shù)的順利實(shí)施。其次,顯微鏡放大倍數(shù)可達(dá)4-40倍,可保證手術(shù)視野的清晰度。接下來,針對小鼠的特殊手術(shù)器械和精細(xì)縫線也為實(shí)施精準(zhǔn)手術(shù)提供了有利條件。同時(shí),為了掌握顯微鏡下腸吻合技術(shù),我們從斷開橡膠手套的連續(xù)縫合到顯微鏡下實(shí)驗(yàn)小鼠腸管的熟練吻合進(jìn)行了大量的初步實(shí)驗(yàn)。因此,我們相信我們的MALC模型在技術(shù)層面上是可行的,在腫瘤學(xué)行為上也十分安全可靠的。

綜上所述,針對裸鼠非局部晚期結(jié)腸癌的精準(zhǔn)切除手術(shù)MALC不僅能達(dá)到根治性切除療效,其術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率和腫瘤復(fù)發(fā)率均較低。換句話說,本研究建立的MALC模型不僅在技術(shù)上具有可行性,而且其在腫瘤學(xué)行為上具有安全性和可靠性。同時(shí),我們認(rèn)為MALC模型可以被視為是一種可量化和可靠的非局部晚期結(jié)腸癌精準(zhǔn)手術(shù)模型,可用于評價(jià)新基因治療、化療和放療的相關(guān)研究。這是動(dòng)物模型研究的新嘗試和突破。我們歡迎其他研究人員復(fù)制我們的模型,并利用它們開發(fā)新的治療策略。