長鏈非編碼RNA PEG10在結(jié)直腸癌中表達(dá)的臨床意義和生物學(xué)功能

徐博文,王 巖,譚志軍

(1天津市第四醫(yī)院外科,天津 300222;2天津市第一中心醫(yī)院普外科;*通訊作者,E-mail:1578312514@qq.com)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第3位和第2位[1]。在中國每年新診斷的CRC病例超過34萬,其中半數(shù)以上的患者就診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移,失去手術(shù)機會使得CRC的治療手段變得非常有限。近年來眾多臨床和基礎(chǔ)研究取得了巨大的進展,然而當(dāng)前CRC治療的最大挑戰(zhàn)仍是準(zhǔn)確評估每位患者術(shù)后的復(fù)發(fā)和預(yù)后[2]。目前,腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分類系統(tǒng)仍作為評估CRC患者預(yù)后和復(fù)發(fā)的主要參考標(biāo)準(zhǔn)。然而,這一分級系統(tǒng)卻難以區(qū)分由腫瘤異質(zhì)性所導(dǎo)致的生存預(yù)后差異。因此,越來越多的研究致力于獨立于現(xiàn)有的TNM分類標(biāo)準(zhǔn),期待能夠找出準(zhǔn)確評估CRC預(yù)后或轉(zhuǎn)移的腫瘤特異性分子,以作為早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移和治療干預(yù)措施的標(biāo)志物,為這一惡性疾病的臨床治療帶來巨大的益處[3]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA)是一組轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸,缺乏蛋白質(zhì)編碼功能的RNA[4]。研究證實,lncRNA能夠作為癌基因或抑癌基因參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性行為,其異常表達(dá)與多種的腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[5]。例如,lncRNA CCAT1在腸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著增高,在腸癌標(biāo)本中也具有顯著的組織特異性,說明該基因具有作為腫瘤標(biāo)志物的潛力;機制上,CCAT1轉(zhuǎn)錄自經(jīng)典的癌基因Myc的超增強子區(qū)域,通過上調(diào)Myc的轉(zhuǎn)錄作用而發(fā)揮癌基因作用;功能上,CCAT1與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、以及Ⅱ/Ⅲ期腫瘤患者的預(yù)后不良都顯著相關(guān)[6]。這些研究說明lncRNA在腫瘤中的組織特異性表達(dá)或許能夠成為CRC新的預(yù)后標(biāo)志物,lncRNA也由此成為腫瘤個體化治療研究領(lǐng)域一個新的研究熱點。然而,lncRNA調(diào)控CRC惡性進展的分子機制研究仍不夠全面,有關(guān)CRC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的臨床分子標(biāo)志物的研究也同樣處于起步階段。因此,本研究應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法在CRC臨床標(biāo)本中檢測并分析父系表達(dá)遺傳印記基因10(paternally expressed 10,PEG10)的表達(dá)水平和預(yù)后意義,并進一步通過基因干擾的方式明確該基因?qū)δ[瘤細(xì)胞惡性表型的影響,試圖為CRC的預(yù)后評估及個體化治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床病理標(biāo)本

選取2012年1月至2013年6月天津市第一中心醫(yī)院普外科收治的66例CRC患者為研究對象。其中,男性41例,女性25例;年齡34-72歲,平均(53.4±11.3)歲;根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟指定的TNM分期,Ⅰ期18例,Ⅱ期25例,Ⅲ期10例,Ⅳ期13例。納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診為CRC;②術(shù)前未進行放化療等治療;③臨床病理資料完整,且隨訪資料完整;④患者及家屬均簽署知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn):①嚴(yán)重心臟、肝、腎功能障礙,或并發(fā)其他嚴(yán)重疾病的患者;②存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或合并其他部位惡性腫瘤者;③術(shù)前合并感染性疾病者;④不配合隨訪的患者;⑤中途轉(zhuǎn)院或放棄治療的患者。無進展生存時間(progression-free survival time,PFS)為術(shù)后第1天至首次發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、患者死亡或至隨訪截止日期?？偵鏁r間(overall survival,OS)為術(shù)后第1天至患者死亡或隨訪截止日期。本研究隨訪時間截至2018年6月,共66例患者均獲得完整術(shù)后隨訪數(shù)據(jù),中位OS為(32.0±16.79)個月,中位PFS為(28.0±17.37)個月。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),且所有患者均簽署知情同意。全部患者均接受結(jié)腸癌根治性切除術(shù)。組織標(biāo)本包括腫瘤組織及癌旁正常對照組織(與腫瘤組織距離大于2 cm),在首次手術(shù)切除后快速取材放置于5倍組織體積的RNA later(Thermo Fisher,維爾紐斯,立陶宛)中,液氮中短暫保存后-80 ℃冰箱中凍存待檢。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)

RNA提取試劑盒購自Transgene公司,反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自Promega公司,SYBR Master Mix聚合酶及RNA酶抑制劑均購自日本TaKaRa公司,ABI7100實時定量PCR儀器購于美國ABI公司,lncRNA PEG10及內(nèi)參GAPDH引物由均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成,lncRNA PEG10上游序列:5′-CATCCTTCCTGTCTT CGC-3′,下游:5′-CCCTCTTCCACTCCTTCTTT-3′;GAPDH上游:5′-TGGTATCGTGGA AGGACTCA-3′,下游:5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′。Trizol法提取組織總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,體系如下:總RNA 1 μg、正反鏈引物各1 μl、無RNA酶水8 μl;反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 5 min。根據(jù)SYBR Master Mix PCR試劑盒說明書制備反應(yīng)體系進行PCR擴增,體系如下:ddH2O 13.8 μl、SYBR Master Mix 10 μl、cDNA模板1 μl、上下游引物各0.1 μl;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸1 min,共40個循環(huán)。lncRNA PEG10的表達(dá)水平以2-ΔΔCt的方法進行評估,實驗重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人腸癌細(xì)胞株HCT-116和DLD-1購自上海生科院細(xì)胞資源中心,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。lncRNA PEG10短發(fā)夾RNA(sh-PEG10)及對照質(zhì)粒(sh-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司,根據(jù)Invitrogen公司Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染腸癌細(xì)胞株。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染后24,48,72,96 h以CCK-8法測定細(xì)胞活力,按北京安必奇生物科技公司CCK-8檢測試劑盒使用說明書進行操作。

1.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染20 h后,24孔板的Transwell小室(8 μm孔徑,美國Costar公司)中,Transwell上室中加入300 μl含(2-3)×104個細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基;在下室中加入550 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液。48 h后,0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)穿過小室的細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織和癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA PEG10的表達(dá)差異

qRT-PCR結(jié)果表明,lncRNA PEG10在CRC組織和配對癌旁正常對照組織中的相對表達(dá)量分別為1.130±0.123和10.501±0.527。lncRNA PEG10在CRC組織中表達(dá)水平顯著高于配對癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1,見圖1)。

2.2 CRC患者不同臨床病理特征中l(wèi)ncRNA PEG10的表達(dá)差異

以lncRNA PEG10 mRNA相對表達(dá)量中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),將CRC患者分為lncRNA PEG10高表達(dá)組(>10.501)和低表達(dá)組(<10.501)。lncRNA PEG10的表達(dá)水平與CRC患者年齡、性別、吸煙史、分化程度未見明顯統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。然而,lncRNA PEG10的表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度(T分期,P=0.017)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P=0.009)和TNM分期(P<0.000 1)等臨床病理資料之間表現(xiàn)出明顯的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(見表1)。

與癌旁正常組織比較,***P<0.000 1圖1 lncRNA PEG10在CRC腫瘤組織和癌旁正常對照組織中的表達(dá)水平Figure 1 Expression of lncRNA PEG10 in CRC tissues and matched adjacent normal tissues

表1 lncRNA PEG10表達(dá)水平與CRC患者臨床病理資料之間的相關(guān)性 (例)Table 1 Correlations of lncRNA PEG10 expression with clinical variables in CRC patients (cases)

2.3 lncRNA PEG10的表達(dá)水平與CRC患者預(yù)后的關(guān)系

與lncRNA PEG10低表達(dá)的CRC患者相比,lncRNA PEG10高表達(dá)者PFS和OS顯著減少(PFS:38.27±16.95個月vs17.03±9.66個月,P=0.003 7;OS:41.82±13.97個月vs19.12±10.58個月,P=0.001 9,見圖2)。此外,單因素分析表明,腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期和PEG10的表達(dá)水平與CRC患者OS及PFS均有顯著的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(見表2,3)。然而,患者性別、年齡、吸煙史與預(yù)后無關(guān)(見表2,3)。COX多因素回歸模型表明,lncRNA PEG10表達(dá)水平為CRC患者的獨立預(yù)后因素(見表3)。

圖2 CRC患者總生存期和無進展生存期與lncRNA PEG10表達(dá)水平之間的相關(guān)性Figure 2 Correlations of overall and progression-free survival time with lncRNA PEG10 expression in CRC patients

表2 CRC患者單因素和多因素的總生存期分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of overall survival in CRC patients

表3 CRC患者單因素和多因素的無進展生存期分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of progression-free survival in CRC patients

2.4 lncRNA PEG10對CRC細(xì)胞增殖的作用

為進一步明確lncRNA PEG10在CRC細(xì)胞惡性表型中的作用,我們在人CRC細(xì)胞株HCT-116和DLD-1中對lncRNA PEG10基因進行干擾。CCK-8細(xì)胞活力檢測結(jié)果表明,lncRNA PEG10干擾后,腫瘤細(xì)胞的增殖活力明顯減弱(見圖3)。

A.qRT-PCR方法檢測CRC細(xì)胞PEG10干擾效率 B.CCK-8法評估相應(yīng)CRC細(xì)胞不同時間點的細(xì)胞活性與sh-Ctrl比較，**P<0.01,***P<0.001圖3 LncRNA PEG10在體外促進CRC細(xì)胞的增殖Figure 3 LncRNA PEG10 promotes CRC cell proliferation in vitro

2.5 lncRNA PEG10對CRC細(xì)胞侵襲和遷移的作用

Transwell侵襲實驗結(jié)果表明,sh-PEG10組CRC細(xì)胞的侵襲能力較sh-Ctrl組腫瘤細(xì)胞顯著減弱(HCT-116:50.67±8.41vs96.33±6.49,P=0.012 7;DLD-1:45.33±4.49vs101.02±7.51,P=0.003 1,見圖4)。與之相似,sh-PEG10組CRC細(xì)胞的遷移能力較sh-Ctrl同樣明顯降低(HCT-116:49.33±8.11vs128.7±23.15,P=0.031 9;DLD-1:43.33±7.22vs107.01±7.55,P=0.003 7,見圖5)。

圖4 Transwell實驗檢測lncRNA PEG10基因干擾對CRC細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of lncRNA PEG10 inhibition on the invasion abilities of the CRC cells by Transwell assay

圖5 Transwell實驗檢測lncRNA PEG10基因干擾對CRC細(xì)胞遷移能力的影響Figure 5 Effect of lncRNA PEG10 inhibition on the migration abilities of the CRC cells by Transwell assay

3 討論

CRC患者治療的最大挑戰(zhàn)之一即為準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)與預(yù)后,這能在眾多CRC患者中明確誰將受益于個體化的輔助治療[7]。臨床分期系統(tǒng)往往不能準(zhǔn)確地區(qū)分大部分腫瘤患者的復(fù)發(fā)與預(yù)后,目前人們?nèi)匀粐?yán)重地依賴傳統(tǒng)的病理變量?，F(xiàn)今,腫瘤的TNM和Dukes分期系統(tǒng)依然是評估CRC患者預(yù)后的金標(biāo)準(zhǔn)。然而,臨床上相同TNM分期的患者在同一CRC階段的存活率常常表現(xiàn)出巨大的差異[8]。因此,作為評估CRC復(fù)發(fā)和預(yù)后的腫瘤相關(guān)分子,可為CRC的早期診斷、轉(zhuǎn)移的評估和治療干預(yù)措施的選擇提供重要依據(jù)。

隨著全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展,與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的lncRNA受到越來越多的關(guān)注。它們與DNA、RNA或蛋白質(zhì)分子之間的組合相互作用,在染色質(zhì)構(gòu)型、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起著十分重要的調(diào)控作用,通過影響腫瘤細(xì)胞的惡性表型,從而作為CRC患者預(yù)后的特異性分子標(biāo)志物出現(xiàn)在人們的視野[9]。例如,lncRNA MALAT1通過癌基因AKAP9促進結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,后者主要調(diào)控細(xì)胞紡錘體極化,因此過表達(dá)的MALAT1直接促進腸上皮細(xì)胞的分裂和分化,與腸癌的發(fā)生發(fā)展、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、以及腫瘤分化程度等密切相關(guān)[10]。另外,lncRNA HOTAIR促進CRC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,在CRC肝轉(zhuǎn)移時表達(dá)尤其顯著,其表達(dá)同樣與CRC的浸潤深度、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正比[11]。與此相似,研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)lncRNA PEG10在多種人類腫瘤中高表達(dá),沉默該基因能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和浸潤的能力,提示lncRNA PEG10具有癌基因的功能[12-20]。

PEG10的表達(dá)水平受多種因素調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子如E2F、c-MYC和雄激素受體(AR)已被報道參與PEG10的表達(dá)調(diào)控。據(jù)報道E2F-1和E2F-4都能直接與PEG10啟動子結(jié)合,并上調(diào)其在肝癌中的轉(zhuǎn)錄[17]。E2F-1通過結(jié)合PEG10啟動子直接上調(diào)PEG10表達(dá)在前列腺癌和胰腺癌中也得到證實[15]。此外,在肺癌細(xì)胞中,GSK3β/USP11/E2F-1/PEG10通路在PEG10過度表達(dá)中起著重要作用[21]。另有報道Panc1細(xì)胞中的c-MYC敲除導(dǎo)致隨后的PEG10下調(diào),芯片分析證實PEG10是c-MYC的直接下游靶點[22]。在前列腺癌中,AR被證實與PEG10啟動子區(qū)域結(jié)合,從而抑制PEG10的轉(zhuǎn)錄。用合成雄激素R1881治療前列腺癌細(xì)胞導(dǎo)致PEG10啟動子上AR占有率增加,而用AR拮抗劑恩扎魯胺治療時AR占有率降低[23]。雖然越來越多的研究逐漸揭示了lncRNA在腫瘤細(xì)胞中的癌性作用及分子機制,然而關(guān)于lncRNA在CRC轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的預(yù)示作用卻鮮有報道。

鑒于CRC易于轉(zhuǎn)移的特性,手術(shù)將CRC完全切除幾乎是不可能的[24]。因此,參與腫瘤惡性進展的關(guān)鍵調(diào)控分子的表達(dá)情況能夠極大地影響CRC患者的惡性進展以及臨床預(yù)后[25,26]。近期的一項meta分析研究了lncRNA PEG10在人類實體瘤中表達(dá)的臨床意義[27]。他們發(fā)現(xiàn)lncRNA PEG10在膠質(zhì)瘤、下咽癌、前列腺癌等人類多種實體瘤中均存在高表達(dá),并且其表達(dá)情況與腫瘤細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期呈正相關(guān)。與這些研究相一致,我們的實驗同樣提示lncRNA PEG10高表達(dá)的患者通常腫瘤浸潤深度更深,更易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,TNM分期更晚,表明lncRNA PEG10的表達(dá)與CRC惡性進展密切相關(guān)。

另一方面,無限制的增殖能力是惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特性,而多項研究均證實了lncRNA PEG10促進腫瘤細(xì)胞增殖的癌基因特性[16]。研究表明,lncRNA PEG10的表達(dá)方式具有細(xì)胞周期依賴性的特點,它能夠誘導(dǎo)細(xì)胞從G0/G1向S期進展,進而促進腫瘤細(xì)胞增殖[15]。例如,lncRNA PEG10在肝細(xì)胞肝癌中大量表達(dá),其基因干擾能夠顯著抑制肝癌腫瘤細(xì)胞的增殖[17]。此外,在MKN7細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PEG10干擾同樣表現(xiàn)出以錨定非依賴的方式抑制克隆形成能力[16]。

我們的研究表明,lncRNA PEG10高表達(dá)能夠作為CRC患者獨立的不良預(yù)后因素(見表2,3),其高表達(dá)者的預(yù)后更差、腫瘤更易于復(fù)發(fā)(見圖2)。目前,CRC最有效的治療策略為手術(shù)聯(lián)合術(shù)后放/化療的綜合治療。然而,鑒于腫瘤細(xì)胞無限增殖、易于浸潤和轉(zhuǎn)移、以及凋亡抵抗的特性,一方面手術(shù)難以完全切除腫瘤,另一方面腫瘤細(xì)胞常常獲得放/化療耐受的能力,使得這些治療方式并不能達(dá)到完全治愈的效果。因此,腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡、浸潤和轉(zhuǎn)移等能力將會極大的影響CRC患者的臨床預(yù)后。lncRNA PEG10的凋亡抵抗作用在肝細(xì)胞肝癌、B淋巴細(xì)胞性白血病、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤中均被證實[12,17,18],其促進增殖的作用在前列腺癌、下咽癌、食管癌等多種惡性腫瘤中也同樣被多次報道[13,14,19]。多項研究證實過表達(dá)lncRNA PEG10的惡性腫瘤更易于浸潤和轉(zhuǎn)移[13,14,19,28]。例如,通過上調(diào)MMP-1/2/9以及下調(diào)TIMP-1/2的表達(dá),lncRNA PEG10能夠促進乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231細(xì)胞的浸潤和遷移[28]。另外,lncRNA PEG10在胰腺癌中能夠通過ERK/MMP-7信號通路促進腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤[15]。

綜上所述,本研究表明lncRNA PEG10在CRC惡性進展過程中發(fā)揮著重要作用,其高表達(dá)與CRC患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期程度、腫瘤的預(yù)后不良與復(fù)發(fā)均密切相關(guān),并且能夠預(yù)示CRC患者的臨床預(yù)后與復(fù)發(fā)。在體外,lncRNA PEG10基因干擾能夠顯著抑制CRC腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。lncRNA PEG10或許能夠為CRC患者的早期診斷、預(yù)后和復(fù)發(fā)的評估提供新的理論依據(jù),為CRC的臨床治療提供新的分子靶點,但該分子在CRC發(fā)生發(fā)展中的具體分子機制仍需進一步研究。