一株嗜水氣單胞菌噬菌體的分離鑒定與生物學(xué)特性

高緒娜， 李金敏， 桑瑞新，丁慶華， 徐海燕

（1.山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271000；2.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，山東濟(jì)南250000）

嗜水氣單胞菌是一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于淡水、污水、土壤及人體糞便中（潘吉脈等，2019），是我國(guó)流行最廣泛的典型“人-畜-水生動(dòng)物”共患病病原菌（Beaz-Hidalgo，2013）。魚(yú)感染該菌后，鰓部、體表出血潰爛，內(nèi)臟發(fā)白，可引起急性腸胃炎等癥狀，由嗜水氣單胞菌引發(fā)水生動(dòng)物的病例不斷增加，是水生動(dòng)物尤其是魚(yú)類最常見(jiàn)的致病菌（陸承平，2013）。該菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成嚴(yán)重威脅（姜艷麗等，2015）。目前，我國(guó)對(duì)于嗜水氣單胞菌病害的防治主要采用抗生素，長(zhǎng)期使用不僅破壞機(jī)體胃腸道微生態(tài)平衡、干擾免疫系統(tǒng)、降低疾病的抵抗力，而且造成藥物殘留及耐藥菌株的出現(xiàn)，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到消費(fèi)者健康，歐盟等國(guó)家已經(jīng)禁止使用抗生素預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物嗜水氣單胞菌，因而亟需尋找新的生態(tài)友好型抗菌劑。

近年來(lái)，噬菌體作為抗生素替代品在防治細(xì)菌性疾病方面的研究得到廣泛關(guān)注（Marion等，2014；Benjamin等，2013）。噬菌體又稱細(xì)菌病毒，能夠特異性的感染和殺死細(xì)菌，附著于宿主，并通過(guò)內(nèi)部復(fù)制和裂解細(xì)菌將自身釋放到環(huán)境，從而將細(xì)菌殺死（冀亞路等，2020；李躍，2014）。江艷華等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌裂解性噬菌體VpJYP2能顯著降低生三文魚(yú)片中副溶血性弧菌數(shù)，且噬菌體濃度越高，抑菌效果越顯著；仇笑笑（2020）研究發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)氏菌噬菌體CR5對(duì)沙門(mén)氏菌具有良好的抑菌效果；許東勤（2018）研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體SLMP1濃度為108PFU/g時(shí)對(duì)沙門(mén)氏菌抑制效果最顯著；Yang等（2019）發(fā)現(xiàn)一組具有廣譜抑菌作用的雞尾酒噬菌體，并將其應(yīng)用于冷凍斑點(diǎn)叉尾鮰，得出其具有較好的抑菌效果。

目前利用噬菌體治療嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病優(yōu)勢(shì)明顯，但成熟的應(yīng)用研究還相對(duì)較少。本試驗(yàn)以嗜水氣單胞菌為研究對(duì)象，從鯉魚(yú)內(nèi)臟樣品中分離噬菌體并進(jìn)行生物學(xué)特性及殺菌效果研究，以期為嗜水氣單胞菌噬菌體的研究和后續(xù)的治療防控提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 嗜水氣單胞菌CVCC-4002，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要試劑和儀器 TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科園海博生物科技有限公司；Tris-HCl緩沖液，購(gòu)自Solarbio公司；PEG8000，購(gòu)自長(zhǎng)春市天佳生物技術(shù)有限公司；0.22μm水系微孔濾膜，購(gòu)自Pall公司；巴氏吸管，購(gòu)自上海晶安生物科技有限公司；恒溫?fù)u床，購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；銅網(wǎng)，購(gòu)自中鏡科儀膜科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；高速離心機(jī)，購(gòu)自Eppendorf公司；透射電鏡，購(gòu)自日本日立公司；生物安全柜，購(gòu)自蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 噬菌體的分離 采自泰安五馬市場(chǎng)的鯉魚(yú)內(nèi)臟樣品中加入50 mmol/mL的Tris-HCl緩沖液。30℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜后，4℃、8000 r/min離心10 min，吸出上清液再次離心，重復(fù)離心3次。離心后的上清液用0.22μm濾器過(guò)濾，所有濾液備用。將30℃、180 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜水氣單胞菌取300μL與300μL的濾液混合，置于恒溫培養(yǎng)箱中30℃孵育15 min，將混合液一并加入3 mL 45℃左右的TSB半固體培養(yǎng)基中，混勻后倒入TSA平板中，室溫放置30 min后放入恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日觀察有無(wú)噬菌斑形成。

1.4 噬菌體的純化 將出現(xiàn)噬菌斑的TSA平板用巴氏吸管挑取單個(gè)噬菌斑，加入生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜水氣單胞菌，30℃混合培養(yǎng)3 h，離心取上清，連續(xù)梯度稀釋，雙層平板培養(yǎng)。待雙層平板培養(yǎng)長(zhǎng)出噬菌斑后，挑取單個(gè)噬菌斑，繼續(xù)梯度稀釋雙平板培養(yǎng)，如此重復(fù)5～6次，獲得純化的噬菌體。

1.5 噬菌體的電鏡觀察 將噬菌體液用PEG 8000沉降制備噬菌體顆粒濃縮液（許東勤，2018），取10μL濃縮液超速離心后的噬菌體樣品滴加到銅網(wǎng)上吸附10 min，小心地用濾紙吸除噬菌體溶液。滴加5μL的2%磷鎢酸溶液，染色10 min后吸除染液，室溫晾干后用透射電鏡觀察。

1.6 噬菌體的生物學(xué)特性分析

1.6.1 宿主譜測(cè)定 對(duì)除了嗜水氣單胞菌CVCC-4002之外的其他6株嗜水氣單胞菌、1株維氏氣單胞菌和1株溶藻弧菌進(jìn)行宿主譜測(cè)定。將8株細(xì)菌于30℃、180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，取100μL菌液與100μL噬菌體混勻后，30℃培養(yǎng)15 min后雙層平板法過(guò)夜培養(yǎng)，觀察有無(wú)噬菌斑的形成。

1.6.2 最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定 （MOI） 參照Li等（2019）的方法略有調(diào)整。將過(guò)夜復(fù)蘇好的宿主菌液重新接到10 mL液體TSB培養(yǎng)基中（1:100）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期（OD600值為0.2～0.4）。將不同稀釋濃度的噬菌體按照不同的感染復(fù)數(shù) （MOI=0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1）與等體積的對(duì)數(shù)前期的菌液進(jìn)行混合，30℃、180 r/min培養(yǎng)10 min后，8000 r/min離心5 min，將沉淀重懸后加入到10 mL TSB液體中，30℃、180 r/min培養(yǎng)3.5 h后8000 r/min離心10 min收集噬菌體上清液，0.22μm濾器過(guò)濾稀釋成不同的濃度與宿主菌混合后雙層平板法培養(yǎng)，次日計(jì)算噬菌體效價(jià)。重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.6.3 一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定 一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定參照Pajunen等（2000）方法，略有調(diào)整。將過(guò)夜復(fù)蘇好的宿主菌液重新接到100 mL TSB液體中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期（OD600值為0.2～0.4），按最佳感染復(fù)數(shù)加入噬菌體混勻后，30℃、180 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔20 min取樣進(jìn)行雙層平板測(cè)效價(jià)，連續(xù)取至120 min。平行重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.6.4 熱穩(wěn)定性測(cè)定 各取1 mL噬菌體（109PFU/mL）分別于30、40、50、60、70、80℃和90℃中孵育1 h后進(jìn)行雙層平板測(cè)效價(jià)，每組重復(fù)3次。1.6.5 不同pH對(duì)噬菌體活性影響的測(cè)定 將噬菌體（109PFU/mL）按體積比1:9分別添加到pH為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和11.0的Tris-HCl緩沖液中，30℃溫育1 h后進(jìn)行雙層平板測(cè)效價(jià)，每組重復(fù)3次。

1.6.6 噬菌體體外殺菌效果測(cè)定 將新鮮嗜水氣單胞菌CVCC4002菌液（用0.05 M的Tris-HCL緩沖液稀釋成1×106cfu/mL）與噬菌體分別以104、105、106、107PFU/mL濃度（用0.05 M的Tris-HCL緩沖液稀釋）按1:9比例均勻混合后，30℃水浴5、10、30、60、180 min。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（0.05 M的Tris-HCL緩沖液代替噬菌體溶液）和空白對(duì)照（0.05 M的Tris-HCL緩沖液代替菌液和噬菌體液），每個(gè)重復(fù)3次。采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算殺菌率及殺滅指數(shù)。

消毒t時(shí)的殺菌率（Pt）=[（n0-nt）/n0]×100%；

殺滅指數(shù)（KI）=n0/nt；

式中：n0為陰性對(duì)照組活菌數(shù)，nt為試驗(yàn)組活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離及純化 通過(guò)雙層平板法分離得到一株嗜水氣單胞菌噬菌體，命名為BLCC16-001。對(duì)BLCC16-001反復(fù)純化，得到純化后的噬菌體，噬菌斑直徑大小為0.5～1 mm，呈圓形空斑，無(wú)暈環(huán)。

2.2 噬菌體的電鏡觀察 通過(guò)PEG8000濃縮和超速離心后噬菌體BLCC16-001效價(jià)可達(dá)到2.0×1010PFU/mL。在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該噬菌體頭部呈正多面體結(jié)構(gòu)，有尾部，頭部直徑約60 nm，尾部長(zhǎng)約140 nm，應(yīng)屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae）。電鏡結(jié)果如圖1所示。

圖1 噬菌體BLCC16-001的電鏡照片（200000×）

2.3 噬菌體的生物學(xué)特性分析

2.3.1 宿主譜測(cè)定 對(duì)除了嗜水氣單胞菌CVCC-4002之外的其他6株嗜水氣單胞菌、1株維氏氣單胞菌和1株溶藻弧菌進(jìn)行宿主譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)，除了CVCC-4002，噬菌體BLCC16-001還能裂解C8-0084、C8-0085、C8-0086和C8-0087這四株嗜水氣單胞菌。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 噬菌體BLCC16-001噬菌譜

2.3.2 最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）測(cè)定 雙層平板培養(yǎng)計(jì)效價(jià)后發(fā)現(xiàn)，感染復(fù)數(shù)為1、0.1、0.01、0.001和0.00001時(shí)噬菌體效價(jià)為109PFU/mL，而且0.0001感染比例下噬菌體效價(jià)達(dá)到2.4×1010PFU/mL為最佳，因此0.0001為最佳感染復(fù)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 噬菌體BLCC16-001最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定

2.3.3 一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定 通過(guò)一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定發(fā)現(xiàn)，噬菌體BLCC16-001的潛伏期為20 min，之后噬菌體數(shù)量開(kāi)始快速增長(zhǎng)，120 min達(dá)到1010PFU/mL，進(jìn)入平臺(tái)期，爆發(fā)量約為1000 PFU/cell。其結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 噬菌體BLCC16-001一步生長(zhǎng)曲線

裂解量=爆發(fā)末期噬菌體效價(jià)（2.0×1010PFU/mL）/初期宿主菌濃度（2.0×107cfu/mL）。

2.3.4 熱穩(wěn)定性測(cè)定 對(duì)不同溫度的噬菌體進(jìn)行雙層平板效價(jià)測(cè)定，結(jié)果顯示，在低于60℃時(shí)噬菌體效價(jià)沒(méi)有變化，保持恒定；當(dāng)溫度高于70℃時(shí)效價(jià)開(kāi)始急劇下降（效價(jià)下降90%），80℃基本失活（效價(jià)下降99%），90℃時(shí)完全失活。表明該噬菌體對(duì)溫度有一定的耐受性（小于60℃），但是高溫也能使其迅速失活。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 噬菌體BLCC16-001熱穩(wěn)定性

2.3.5 不同pH對(duì)噬菌體活性影響的測(cè)定 由圖4可知，噬菌體BLCC16-001具有較寬的pH耐受范圍，在pH 4.0～10.0時(shí)噬菌體活性保持穩(wěn)定，超過(guò)這個(gè)范圍噬菌體效價(jià)開(kāi)始下降，在pH 1.0和11.0時(shí)噬菌體能夠徹底失活，而在1.0＜pH＜4.0的酸性環(huán)境中下降相對(duì)緩慢，有一定耐受性。

圖4 噬菌體BLCC16-001 pH穩(wěn)定性

2.3.6 噬菌體體外殺菌效果的測(cè)定 由表3可知，當(dāng)病原菌濃度為1×106cfu/mL時(shí)，噬菌體BLCC16-001在濃度為106PFU/mL和107PFU/mL，5 min內(nèi)對(duì)病源菌的殺滅指數(shù)達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上；噬菌體BLCC16-001在濃度為105PFU/mL時(shí)，3 h殺菌率達(dá)到99.2%，殺滅指數(shù)2個(gè)數(shù)量級(jí)；噬菌體BLCC16-001在濃度為104PFU/mL時(shí)，3 h殺菌率達(dá)到91.0%。

表3 噬菌體BLCC16-001殺菌率試驗(yàn)

3 討論

目前養(yǎng)殖過(guò)程中，抗生素治療面臨巨大挑戰(zhàn)，其效果越來(lái)越不明顯，尋找新的抗菌制劑已刻不容緩。噬菌體正逐步成為一種新型的治療方法，成為抵御細(xì)菌感染的利器（朱育瑋，2015；張娜等，2011）。噬菌體控制細(xì)菌感染具有諸多優(yōu)勢(shì)，如噬菌體裂解細(xì)菌有高度的專一性和特異性；與抗生素相比，不易產(chǎn)生耐藥性；安全性高，是人和動(dòng)物的共生體；個(gè)體微小，增殖能力強(qiáng)；分布廣泛，易篩選易獲得等（陶程琳等，2020）。

本研究從山東泰安五馬市場(chǎng)的鯉魚(yú)內(nèi)臟中分離到了一株嗜水氣單胞菌噬菌體BLCC16-001，經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其頭部呈正多面體結(jié)構(gòu)，有尾部，頭部直徑約60 nm，尾長(zhǎng)約140 nm。按國(guó)際病毒分類委員會(huì)分類標(biāo)準(zhǔn)，該噬菌體應(yīng)屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae）的烈性噬菌體。與沈嬋娟（2013）分離得到的嗜水氣單胞菌噬菌體結(jié)構(gòu)一致。

對(duì)噬菌體BLCC16-001進(jìn)行一系列生物學(xué)特性分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，該噬菌體能夠耐受60℃以下的溫度，超過(guò)70℃會(huì)急劇失活，相比于曹永生等（2019）分離的噬菌體pAhMJG其耐熱性較強(qiáng)。該噬菌體對(duì)酸堿均具有一定的抵抗力，在pH為4.0～10.0時(shí)穩(wěn)定，其酸耐受性要強(qiáng)于噬菌體CC2和噬菌體9-1（沈嬋娟，2013）；堿耐受性要強(qiáng)于噬菌體G65和噬菌體Y71（高珊珊，2016）。表明噬菌體BLCC16-001具有良好熱穩(wěn)定性及酸堿耐受性，有助于在生產(chǎn)、加工及應(yīng)用過(guò)程中保持良好的活性。

一般情況下，將潛伏期短、裂解量高的噬菌體，視為毒力較高，且這類噬菌體更易獲得，是實(shí)踐應(yīng)用中的理想噬菌體（王志麗，2012）。噬菌體BLCC16-001潛伏期20 min，爆發(fā)量1000 PFU/cell，發(fā)酵平臺(tái)期滴度約達(dá)到1010PFU/mL，遠(yuǎn)高于噬菌體CC2和噬菌體9-1（沈嬋娟，2013）及王志麗（2012）等研究報(bào)道的中華鱉源嗜水氣單胞菌噬菌體。感染復(fù)數(shù)是研究病毒感染和產(chǎn)出之間量效關(guān)系的一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)（Stenholm等，2008）。最佳感染復(fù)數(shù)較低的噬菌體對(duì)宿主細(xì)胞具有更高的感染率，噬菌體BLCC16-001最佳感染復(fù)數(shù)為0.0001，低于噬菌體株N21、W3、G65、Y71和Y81的最適感染比，分別為0.01、1、0.001、0.1和0.001（高珊珊，2016）。也有文獻(xiàn)報(bào)道感染復(fù)數(shù)在一定程度上決定了噬菌體療法的最終效果。噬菌體BLCC16-001在感染復(fù)數(shù)為0.1時(shí)，3 h對(duì)宿主菌殺菌率超過(guò)90%，感染復(fù)數(shù)為1時(shí)，3 h對(duì)宿主菌殺菌率超99%。使用濃度低于噬菌體AhyVDH1，感染復(fù)數(shù)為10時(shí)，宿主菌的數(shù)量控制到較低值（肖煒，2020）。

總之，目前都在積極尋找抗生素的替代品，如益生菌、植物提取物和噬菌體等，其中噬菌體裂解細(xì)菌有高度的專一性和特異性，是一種很有潛力的抗生素替代品（葛志毅等，2020）。目前關(guān)于嗜水氣單胞菌噬菌體的研究有限，相信在不久的將來(lái)，噬菌體憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，會(huì)成為治療嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病的另一條有效途徑。為了克服單個(gè)噬菌體治療有可能導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)的局限性，有必要分離更多的噬菌體，構(gòu)建噬菌體庫(kù)，采用混合噬菌體療法。

4 結(jié)論

本研究從鯉魚(yú)內(nèi)臟分離到一株嗜水氣單胞菌噬菌體BLCC16-001，通過(guò)電鏡形態(tài)觀察，該噬菌體屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae）的烈性噬菌體。噬菌體BLCC16-001熱穩(wěn)定性及酸堿耐受性表現(xiàn)良好，最佳感染復(fù)數(shù)低、裂解量高，且在濃度為106PFU/mL和107PFU/mL，5 min內(nèi)對(duì)病源菌的殺滅指數(shù)達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。