anti-IL-33 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖與凋亡的影響

姜 玥，劉宵達(dá)，吳素琴

（遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫研究室，遼寧 沈陽 110101）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性和全身性炎癥性疾病，以成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）的病理性增生、滑膜炎癥和血管痙攣、軟骨和骨破壞以及全身性表現(xiàn)為主要特征[1]。促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-6 和IL-17，通過激活巨噬細(xì)胞、FLS、輔助性T（Th）細(xì)胞和破骨細(xì)胞，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)及骨和軟骨的破壞[2，3]。在RA中TNF-α 參與多種致病機(jī)制，如內(nèi)皮細(xì)胞的激活、白細(xì)胞的聚集、PGE2的產(chǎn)生、促炎細(xì)胞因子和趨化因子的釋放、破骨細(xì)胞的活化等，進(jìn)而導(dǎo)致滑膜組織的增生、炎癥、骨和軟骨的破壞、自身免疫反應(yīng)以及RA 并發(fā)癥等病理過程[4]。IL-33 屬于IL-1 細(xì)胞因子家族成員[5]，其最初被描述為一種由壞死的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞被動釋放的細(xì)胞因子，后發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞中均有IL-33 表達(dá)。IL-33 能激活肥大細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移、產(chǎn)生趨化因子和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，參與了RA 的炎性環(huán)境[6]。本研究主要探討anti-IL-33 對RA 滑膜細(xì)胞的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Heracellvios160i，美國Thermo 公司），倒置顯微鏡（AxioVert.Al，德國ZEISS 公司），低溫高速離心機(jī)（X-30R，美國Beckman Coulter 公司），高壓蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械有限公司），酶標(biāo)儀（318C，上海三科儀器有限公司），流式細(xì)胞儀（CytoFlex，美國Beckman Coulter 公司）。

1.1.2 細(xì)胞、試劑 兔抗人IL-33 抗體（PeproTech 公司，美國），TNF-α（PeproTech 公司，美國），甲氨蝶呤片（上海信誼制藥總廠，中國），胎牛血清（天杭生物科技股份有限公司，中國），人FLS（上海弘順公司，中國），青霉素鏈霉素雙抗（聯(lián)邦生物試劑有限公司，中國），高糖DMEM 培養(yǎng)基（HyClone 公司，美國），胰蛋白酶（HyClone 公司，美國），PBS（HyClone 公司，美國），CCK-8 試劑盒（索萊寶試劑有限公司，中國），凋亡試劑盒（Biolegend 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) FLS 置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中，含10%胎牛血清H-DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)（含1%青鏈霉素），取3～7 代對數(shù)生長期細(xì)胞正式實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8 法檢測 將FLS 細(xì)胞制備適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液（5×103/ml），以每孔100 μl 接種至96 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。除正常對照組外，其余各組均加入TNFα（20 ng/ml）誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)具體分組如下：正常對照組、TNF-α（+）對照組、TNF-α（+）+anti-IL-33（50 ng/ml）組、TNF-α（+）+甲氨蝶呤（1 μg/ml）組。每組4 個(gè)復(fù)孔，24 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃5%的CO2條件下孵育4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度。計(jì)算各組的細(xì)胞存活率，公式如下：細(xì)胞活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0 加藥）-A（空白）]×100。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 將1×106/ml FLS 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，誘導(dǎo)及分組方法同上1.2.2，每組4 個(gè)復(fù)孔。24 h 后，收集各孔細(xì)胞，包括培養(yǎng)上清中的細(xì)胞，PBS 洗滌，調(diào)節(jié)濃度為1×106/ml，將100 μl 細(xì)胞懸液加入流式管，加入5 μl FITC-Annexin V 以及10 μl PI 室溫避光孵育15 min，加400 μl Cell Staining Buffer，上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用GraphPad Prism8.0 軟件進(jìn)行作圖。計(jì)量資料以（）表示，符合正態(tài)分布的多組之間參數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 anti-IL-33 對RA-FLS 形態(tài)的影響 與正常對照組比較，TNF-α（+）對照組細(xì)胞表現(xiàn)為長梭形，且細(xì)胞間隙顯著減小；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤（1 μg/ml）組細(xì)胞形態(tài)均由長梭形逐漸變圓，胞核色素沉著，細(xì)胞間隙增加，見圖1。

圖1 anti-IL-33 對RA-FLS 形態(tài)的影響（×200）

2.2 anti-IL-33 對RA-FLS 增殖的影響 與正常對照組比較，TNF-α（+）對照組細(xì)胞活力增加（P＜0.05）；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤組細(xì)胞活力降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 CCK-8 法檢測anti-IL-33 對RA-FLS 增殖的影響

2.3 anti-IL-33 對RA-FLS 凋亡的影響 與正常對照組比較，TNF-α（+）對照組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤組細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05），見圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測anti-IL-33 對RA-FLS 細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

RA 是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其特征是滑膜炎、骨組織破壞伴隨血管翳的形成和關(guān)節(jié)軟骨的降解。IL-33/ST2 信號傳導(dǎo)與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括哮喘、纖維增生性疾病和自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、進(jìn)行性全身性硬化癥等。研究表明[7]，IL-33/ST2 參與RA 的發(fā)病機(jī)制。

Matsuyama Y 等[8]研究表明，IL-33 與RA 發(fā)病密切相關(guān)，RA 患者血清和滑膜液中IL-33 的表達(dá)增加，IL-33mRNA 高表達(dá)于滑膜細(xì)胞，且IL-33 與RA疾病活動呈正相關(guān)（P＜0.05）。Li Y 等[9]研究表明，抗IL-33 抗體能夠抑制干擾素-γ（IFN-γ）、IL-6、IL-12、IL-33 和TNF-α 的表達(dá)，并減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠隨后出現(xiàn)的關(guān)節(jié)損壞，提示用IL-33中和抗體治療關(guān)節(jié)炎是一項(xiàng)具有發(fā)展前景的新方法，IL-33 中和抗體通過抑制炎性細(xì)胞的活化和抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有助于緩解關(guān)節(jié)損傷情況，對關(guān)節(jié)炎的發(fā)作具有治療作用。目前，諸如阿達(dá)木單抗等生物制劑抗風(fēng)濕藥物顯示出優(yōu)越的臨床效果。本研究主要探討anti-IL-33 對RA 滑膜細(xì)胞的影響，通過檢測各組細(xì)胞增殖、凋亡水平，結(jié)果顯示與對照組比較，TNF-α（+）對照組細(xì)胞活力增加（P＜0.05）；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤組細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。凋亡檢測顯示，與對照組比較，TNF-α（+）對照組細(xì)胞凋亡降低（P＜0.05）；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤組細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05），提示anti-IL-33 能改善在TNF-α 刺激下的RA-FLS 大量增殖，并能促進(jìn)RA-FLS 凋亡，推測anti-IL-33 在RA 患者體內(nèi)能抑制滑膜的增厚，并抑制形成大量的血管翳，這些對于緩解RA 病情，降低RA 中軟骨及骨的降解都有明顯優(yōu)勢。因此，阻斷IL-33 的生物制劑有希望成為治療RA 的新途徑，anti-IL-33 是否通過OPG/RANKL 影響RA 值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，anti-IL-33 可抑制RA-FLS 增殖并誘導(dǎo)其凋亡，可為RA 的治療提供方向。