肺炎克雷伯菌的耐藥性及其與生物膜形成的關(guān)系

陸 穎，朱志軍，朱 梅

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院檢驗科，安徽 巢湖 238000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一種不運動、有莢膜、發(fā)酵乳糖、兼性厭氧的革蘭氏陰性菌[1]，屬于腸桿菌，具有很強(qiáng)的侵襲性。肺炎克雷伯菌可攜帶多種抗菌藥物耐藥基因，包括產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和碳青霉烯酶等，其具有獲得多重耐藥（MDR）的能力，可能會使感染變得難以治療[2]。肺炎克雷伯菌可引起醫(yī)院內(nèi)免疫功能低下的患者感染，包括使用留置醫(yī)療器械的患者[3]。細(xì)菌可在這些內(nèi)置導(dǎo)管及其他留置醫(yī)療器械上形成生物膜，引起留置設(shè)備相關(guān)感染，包括上呼吸道感染、腹膜炎和泌尿道感染[4]。有研究表明[5]，肺炎克雷伯菌形成生物膜與增強(qiáng)對抗菌藥物的耐藥性有關(guān)。因此生物膜是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的一個重要因素。另有研究顯示[6]，超過65%的醫(yī)院內(nèi)感染是由形成生物膜菌株引起的。目前關(guān)于肺炎克雷伯菌生物膜形成的相關(guān)資料較少。本研究通過對臨床患者中分離得到的肺炎克雷伯菌的耐藥性及其與生物膜形成能力之間的關(guān)系進(jìn)行檢測和分析，旨在為醫(yī)院感染的治療和控制提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集我院2018 年8 月～2019 年6 月臨床各科室送檢的標(biāo)本，分離得到的肺炎克雷伯菌共90 株，已剔除重復(fù)菌株。所有菌株均采用VitekⅡCompact 全自動微生物分析儀鑒定菌種。

1.2 儀器與試劑 VitekⅡCompaet 全自動微生物分析儀、比濁儀（法國生物梅里埃公司）；96 孔聚苯乙烯板（美國Costar 公司）；結(jié)晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司）；MH 瓊脂干粉、藥敏紙片（英國Oxoid公司）；PCR 反應(yīng)試劑、DNA Marker、瓊脂糖（上海生工生物有限公司）；電泳儀（北京六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（美國BioRad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株的藥敏試驗及表型確證試驗 藥敏試驗采用微量肉湯稀釋法對分離的肺炎克雷伯菌進(jìn)行分析，結(jié)果依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2019 年版推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。以大腸桿菌ATCC 25922作為藥敏試驗的質(zhì)控菌株。ESBLs 表型確證試驗：采用雙紙片協(xié)同擴(kuò)散法（DDST），以肺炎克雷伯菌ATCC 700603 為質(zhì)控菌株。碳青霉烯酶檢測：采用改良碳青霉烯滅活試驗（mCIM）檢測方法，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 為陽性質(zhì)控菌，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 為陰性質(zhì)控菌。具體操作方法及結(jié)果判斷均參照2019 年CLSI 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3.2 ESBLs 及碳青霉烯酶基因的分子檢測 通過煮沸法提取肺炎克雷伯菌的DNA 模板，PCR 法檢測常見的ESBLs 耐藥基因（blaTEM，bla SHV，blaCTX-M-1，blaCTX-M-9）以及碳青霉烯酶耐藥基因（blaKPC），具體引物見表1，參考文獻(xiàn)[7-9]由上海生工生物工程公司合成。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠中，120 V 電泳40 min 后，用凝膠成像儀觀察結(jié)果，檢測到目的條帶即為基因陽性。使用正向引物進(jìn)行DNA 測序。

表1 肺炎克雷伯菌耐藥基因及引物

1.3.3 生物膜形成能力的檢測 采用結(jié)晶紫染色法檢測生物膜形成能力[10，11]，將菌株接種于MH 平板上37 ℃下培養(yǎng)24 h，配制0.5 麥?zhǔn)系木鷳乙杭尤?6孔聚苯乙烯板中，每孔10 μl 菌懸液和190 μl 無菌LB 肉湯，設(shè)3 個復(fù)孔，以200 μl 無菌LB 肉湯作為陰性對照。將96 孔板靜置于37 ℃培養(yǎng)24 h 后取出，用200 μl 無菌蒸餾水清洗3 次去除浮游菌，加入99%甲醇200 μl 固定15 min，吸棄甲醇，晾干后加入200 μl 1%結(jié)晶紫染料染色20 min，無菌蒸餾水清洗3 次，室溫干燥后加入200 μl 95%乙醇脫色10 min，充分溶解結(jié)晶紫。使用酶標(biāo)儀在波長570 nm處讀取各孔的吸光度（OD）值，以O(shè)Dc 值（陰性對照的平均OD 值+3×標(biāo)準(zhǔn)差值）為臨界值。大于該ODc值則判定為可形成生物膜。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0 對收集的資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，生物膜陽性與陰性菌株的組間差異采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株的臨床特征 所有菌株均采用Vitek ⅡCompact 鑒定菌種。90 例患者的平均年齡為（65.28±14.84）歲。74.44%（67/90）的患者在住院期間進(jìn)行過侵入性操作和（或）置留醫(yī)療設(shè)備。分離的菌株主要來源于痰液，其他來源包括尿液、血液、分泌物、膿液、膽汁、胸腹水，見表2。

表2 肺炎克雷伯菌的臨床特征[n（%）]

2.2 生物膜形成能力結(jié)果 通過結(jié)晶紫染色法檢測生物膜形成能力，90 株肺炎克雷伯菌中共有66 株可形成生物膜，陽性率達(dá)73.33%。僅24 株未形成生物膜

2.3 藥敏結(jié)果與生物膜 所有肺炎克雷伯菌中MDR菌株共52 株，檢出率占57.78%。MDR 菌株中有43（65.15%）株形成生物膜，未形成生物膜的菌株有9（37.50%）株，MDR 菌株中生物膜陽性的檢出率高于生物膜陰性菌株（χ2=5.516，P＜0.02）。生物膜陽性菌株對青霉素/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢菌素類、氨基糖苷類、復(fù)方新諾明和呋喃妥因類藥物的耐藥率較高（P＜0.05）。生物膜與藥物耐藥率關(guān)系見表3。

表3 耐藥性與生物膜形成（n，%）

2.4 耐藥菌株與生物膜形成的相關(guān)性 對90 株肺炎克雷伯菌進(jìn)行DDST 試驗，檢出產(chǎn)ESBLs 菌株共37株，陽性率為41.11%。產(chǎn)ESBLs 菌株中有32 株形成生物膜，陽性率占48.48%（32/66），生物膜陰性的菌株僅5 株，占20.83%（5/24），二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.559，P＜0.05）；mCIM 試驗檢出13 株產(chǎn)碳青霉烯酶，陽性率為14.44%，生物膜陽性菌株的產(chǎn)酶率為16.67%（11/66），陰性菌株的產(chǎn)酶率為8.33%（2/24），二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 耐藥基因檢測結(jié)果 表型試驗檢測到43 株肺炎克雷伯菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，除1 株產(chǎn)ESBLs 的菌株外均為MDR，其中37 株產(chǎn)ESBLs 的肺炎克雷伯菌中均檢測到ESBLs 耐藥基因，36 株（97.30%）攜帶SHV 型。此外，還攜帶TEM 型23 株（62.16%），CTX-M-1 組20 株（54.05%）和CTX-M-9 組17 株（45.95%）。13 株產(chǎn)碳青霉稀酶的肺炎克雷伯菌株均攜帶KPC 基因，其中7 株肺炎克雷伯菌同時攜帶ESBLs 耐藥基因和KPC 基因見圖1。肺炎克雷伯菌攜帶的耐藥基因具體情況見表4。

圖1 耐藥基因PCR 擴(kuò)增陽性產(chǎn)物電泳結(jié)果

表4 43 株肺炎克雷伯菌耐藥基因分布特征（n，%）

3 討論

細(xì)菌生物膜，即嵌入胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）自生基質(zhì)中的細(xì)胞相互粘附和（或）附著在接觸表面的聚集體，EPS 是由多糖、蛋白質(zhì)和DNA 等組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[5]。肺炎克雷伯菌比較容易形成生物膜[12]，使細(xì)菌的感染持續(xù)存在。肺炎克雷伯菌通過形成生物膜可使細(xì)菌免受宿主體內(nèi)的不利條件（如缺氧和營養(yǎng)缺乏）以及抗菌藥物的影響[13]，增加其在機(jī)體各組織表面和醫(yī)療器械上的持久性。本研究中，多數(shù)感染肺炎克雷伯菌的患者在住院期間使用過置留的醫(yī)療設(shè)備，最常見的為導(dǎo)尿管，Donlan RM[14]在他的研究中報告了產(chǎn)生生物膜的細(xì)菌與導(dǎo)尿管的關(guān)系。細(xì)菌生物膜可能對需要留置醫(yī)療設(shè)備的患者造成公共衛(wèi)生問題，因此需要考慮更有效的生物膜控制及清除策略。

肺炎克雷伯菌在生物膜狀態(tài)下對抗菌藥物的耐藥性是浮游狀態(tài)的10～1000 倍[15]。決定肺炎克雷伯菌耐藥性最重要的因素是細(xì)菌的生長狀況；在生物膜內(nèi)，細(xì)菌為了適應(yīng)饑餓和低氧而停滯生長，降低抗菌藥物的作用效率（抗菌藥物對快速生長的細(xì)菌有效）[5，6]。因此，細(xì)菌形成生物膜引起的相關(guān)感染變得很難根除。

肺炎克雷伯菌本身具有獲得耐藥性的傾向[16]，目前抗菌藥物耐藥菌株已經(jīng)呈現(xiàn)全球性的廣泛傳播，這些菌株可同時形成生物膜。細(xì)菌生物膜可形成屏障，減少抗菌藥物的滲透作用，導(dǎo)致治療失??；同時妨礙免疫系統(tǒng)對細(xì)菌的識別[17]，可能使患者病情更加復(fù)雜。本研究中，肺炎克雷伯菌生物膜形成陽性的菌株對青霉素/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢菌素類、氨基糖苷類以及呋喃妥因類藥物的耐藥率均高于50%，而且生物膜形成陽性菌株與陰性菌株相比，對這些藥物更容易產(chǎn)生耐藥性。雖然生物膜形成陽性與陰性菌株對復(fù)方新諾明的耐藥率均低于50%，但陽性菌株的耐藥率仍高于陰性菌株（P＜0.05）。肺炎克雷伯菌對氨曲南和喹諾酮類藥物的耐藥率在陽性菌株與陰性菌株之間沒有顯著的差異。

近年來，多重耐藥腸桿菌科引起感染的報道越來越多。MDR 菌株是指同時對3 類或3 類以上抗菌藥物中至少一種藥物不敏感的細(xì)菌[18]。MDR菌株與肺炎克雷伯菌形成生物膜有關(guān)[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)MDR 肺炎克雷伯菌比敏感菌株更易形成生物膜。正如先前的研究表明[20]，MDR 菌株形成生物膜的能力較高。本研究MDR 菌株中生物膜形成的陽性率高達(dá)65.15%，這可能使感染變得難以治療。

肺炎克雷伯菌MDR 菌株通常含有質(zhì)粒介導(dǎo)的具有廣譜水解活性的β-內(nèi)酰胺酶[21]，即能夠產(chǎn)生ESBLs。ESBLs 有數(shù)百種變體，主要包括TEM、SHV和CTX-M[22]。本研究中檢測到的ESBLs 耐藥基因SHV 型、TEM 型、CTX-M-1 組、CTX-M-9 組分別占97.30%，62.16%，54.05%，45.95%，其中SHV 為最主要基因型。目前這些ESBLs 耐藥基因在全球廣泛分布。細(xì)菌通過接合使攜帶ESBLs 基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和傳播，生物膜中細(xì)菌的鄰近為遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移特別是通過接合轉(zhuǎn)移提供了有利的環(huán)境[23]。肺炎克雷伯菌生物膜的形成與其產(chǎn)ESBLs 密切相關(guān)[24]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs 的菌株比不產(chǎn)ESBLs 的菌株更具有形成生物膜的能力。可能是因為①生物膜是一個多物種的微生物群落，這些微生物可以很高的比例共享它們的遺傳物質(zhì)；②由于生物膜的滲透性降低使抗菌藥物進(jìn)入量減少，而低濃度的抗菌藥物可誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生ESBLs[25]。碳青霉烯類是治療多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的首選藥物[26]。近年來對碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌的檢出率不斷增加，變得難以控制，需制定適當(dāng)和有效的策略。碳青霉烯酶中以KPC 流行最廣泛[22]。20 世紀(jì)90 年代，美國東北部首次報告了此類β-內(nèi)酰胺酶，目前在世界范圍內(nèi)的傳播引人注目。本研究中13 株MCIM 試驗結(jié)果陽性的菌株均攜帶KPC 基因，而且檢測到了7 株同時攜帶一個或多個ESBLs 耐藥基因和KPC 基因，應(yīng)當(dāng)引起臨床的重視。本研究并未發(fā)現(xiàn)碳青霉烯耐藥菌株與敏感菌株的生物膜形成能力有差異，可能是由于本研究中碳青霉烯耐藥菌株較少，在將來的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究兩者之間的相關(guān)性。

綜上所述，本研究收集的肺炎克雷伯菌生物膜形成的陽性菌株比率較高，且MDR 菌株具有較高的生物膜形成能力，以及發(fā)現(xiàn)了ESBLs 耐藥基因和KPC 基因共存的菌株，這使得臨床感染治療面臨更大的挑戰(zhàn)。因此，對于感染肺炎克雷伯菌同時置留醫(yī)療器械的患者，應(yīng)注意預(yù)防生物膜的形成。同時應(yīng)加強(qiáng)對形成生物膜的MDR 菌株及抗生素使用的監(jiān)控，以減少此類耐藥菌株的播散。