重金屬快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展

王玨　王元鳳　徐乃豐　朱照祥　李芊芊　伍曉斌

摘? 要： 由于重金屬在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛，致使環(huán)境重金屬污染日益嚴(yán)重.為應(yīng)對減輕環(huán)境重金屬污染和確保人體健康的需求，新型的重金屬快速檢測技術(shù)成為了研究熱點(diǎn).針對重金屬傳統(tǒng)檢測技術(shù)的儀器昂貴、需專業(yè)操作人員、不易攜帶、程序繁瑣和耗時較長等缺陷，多種具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、易攜帶、現(xiàn)場實時特點(diǎn)的重金屬快速檢測技術(shù)得到了快速發(fā)展.本綜述首先簡析了重金屬污染現(xiàn)狀以及重金屬傳統(tǒng)檢測技術(shù)的種類和特點(diǎn)，詳細(xì)總結(jié)了各種重金屬快速檢測技術(shù)的原理、研究進(jìn)展、實際應(yīng)用及其優(yōu)缺點(diǎn).結(jié)合對重金屬離子的長期研究，利用重金屬離子敏感菌株篩選螯合劑，對如何改進(jìn)重金屬快速檢測方法中存在的靈敏性和專一性的不足等問題提出了新穎的改進(jìn)方法.

關(guān)鍵詞： 重金屬; 快速檢測; 敏感菌株; 螯合劑

中圖分類號： X 502; TS 07? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號： 1000-5137（2021）02-0186-12

Research progress on rapid detection methods of heavy metals

WANG Jue^?， WANG Yuanfeng^?， XU Naifeng， ZHU Zhaoxiang， LI Qianqian， WU Xiaobin^*

（College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）

Abstract： Heavy metals are applied more and more extensively in industry and agriculture，resulting in increasing environmental pollution of heavy metals.In response to the necessity to reduce environmental heavy metal pollution and ensure human health，new rapid detection techniques for heavy metals have become research hotspot.In view of the limitations of traditional heavy metal detection techniques such as the necessity of expensive equipment，professional operators needed，not portable，complicated procedure and long time-consuming，a variety of fast，sensitive，accurate，portable and on-site rapid heavy metal detection techniques have been developed rapidly.This paper briefly analyzed the current situations of heavy metal pollution and the types and characteristics of traditional heavy metal detection techniques， then the principle，research progress，applications，merits and demerits of various heavy metal rapid detection techniques were summarized as well.Based on our long-term research on heavy metal metabolism，we developed novel methods to improve the sensitivity and specificity of rapid detection techniques for heavy metals using heavy metal sensitive bacterial strains to screen chelators.

Key words： heavy metal; rapid detection; sensitive bacterial strain; chelator

0? 引 言

重金屬是指密度大于5 g?cm^-3的一類金屬元素，在生物體中不可降解.按其生物功能而言，一般分為必需重金屬（銅、鐵等）和非必需重金屬（汞、鉛等）.在生物體內(nèi)，即使是必需重金屬的含量也必需控制在極低的安全水平.隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，重金屬在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛，而環(huán)境中的重金屬污染也越來越嚴(yán)重^[1]，尤其是土壤和水體中的重金屬污染，通過吸收富集作用會在食用農(nóng)產(chǎn)品中過量積累^[2]，其中鎘（Cd）、銅（Cu）、鉛（Pb）、砷（As）、鉻（Cr）、汞（Hg）的污染情況尤為嚴(yán)重，而這些重金屬即使只在痕量水平，也會對人體健康造成嚴(yán)重危害^[3].目前，中國50%的水源受到重金屬離子的污染，全國重金屬污染土地已經(jīng)超過3億畝，占總耕種土地面積的1/6以上^[4]，每年有1 200萬噸糧食被重金屬污染，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)百億元^[5].我國是農(nóng)業(yè)大國，糧食、蔬菜、水果等產(chǎn)量皆居世界首位^[6].其中，糧食和蔬菜栽培面積最廣、經(jīng)濟(jì)地位最重要，僅上海市的“菜籃子”工程，每天消費(fèi)的農(nóng)產(chǎn)品規(guī)模達(dá)7萬噸左右.快速檢測食用農(nóng)產(chǎn)品和食品中重金屬含量的方法對確保國民大眾健康非常重要.

最為常用的重金屬離子檢測方法包括：電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）^[7]、原子吸收光譜（AAS）^[8]、X-射線熒光光譜（XRF）^[9]、中子活化分析（NAA）以及電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES）^[10]等傳統(tǒng)方法，其中以ICP-MS使用最為廣泛^[4].這些方法的共同優(yōu)點(diǎn)是：多元素快速分析，線性動態(tài)范圍寬，檢測限低;在大氣壓下進(jìn)樣，便于與其他進(jìn)樣技術(shù)連用;可進(jìn)行同位素分析、單元素和多元素分析以及有機(jī)物中金屬元素的形態(tài)分析等.然而，這些方法存在儀器昂貴、運(yùn)行費(fèi)用高、不易攜帶、程序繁瑣和耗時較長等缺陷^[11].因此，發(fā)展快速、便捷、低成本、簡單可靠，便于現(xiàn)場檢測的方法，是當(dāng)前重金屬離子檢測領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)^[3，12].本文介紹了生物傳感器分析法、電化學(xué)、分析法、免疫分析法和紙基檢測法等4種重金屬快速檢測方法.

1? 重金屬快速檢測方法

1.1 生物傳感分析法

生物傳感分析法是用生物敏感材料作為識別元件，主要利用生物敏感元件中的活性物質(zhì)與待測物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生的化學(xué)信號經(jīng)過轉(zhuǎn)換放大成電信號，通過定量分析，將電信號換算為待測物濃度，最終實現(xiàn)特異性識別待測物的檢測手段.其中最重要的元件就是作為識別元件的生物敏感材料.

1.1.1 基于電紡納米纖維的生物傳感器

電紡納米纖維一般利用高壓靜電紡絲技術(shù)制得，即利用高壓電流，使注射器中的聚合物溶液噴射紡絲^[13].在強(qiáng)電場下，針頭處的液滴從半球形轉(zhuǎn)變成錐形，在尖端形成射流，從頂端噴射出來，固化形成超細(xì)纖維，如圖1所示.靜電紡絲具有良好的生物兼容性，可以實現(xiàn)與生物分子的自定義組合^[14].通過靜電紡絲技術(shù)獲得納米纖維，并進(jìn)一步利用光學(xué)活性發(fā)色團(tuán)，如染料、共軛聚合物、碳基納米材料和納米顆粒使其官能化，以產(chǎn)生熒光和比色，繼而在傳感器中使用具有光學(xué)活性的電紡納米纖維，利用比色法和熒光法對重金屬進(jìn)行單一或者多重檢測.

影響靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維的因素有許多，如表1所示，深入研究這些因素能幫助提高電紡納米纖維的穩(wěn)定性.

在最近的基于熒光法的靜電紡絲技術(shù)重金屬檢測研究中，MA等^[15]將二硫縮醛改性的二酰亞胺（DTPDI）引入到聚丙烯氰（PAN）納米纖維上，二硫縮醛在汞離子（Hg²⁺）作用下發(fā)生水解，從而使DTPDI與PAN脫離，形成游離的熒光染料，這種染料與Hg²⁺呈線性相關(guān)，能實現(xiàn)在2 h內(nèi)對水體中的Hg²⁺進(jìn)行檢測，檢出限可達(dá)1×10^-9 ng·mL^-1.LI等^[16]開發(fā)了一種基于碳量子點(diǎn)包覆介孔二氧化硅/聚丙烯腈（CDs/mesoSiO₂/PAN）電紡納米纖維膜的新型無標(biāo)記熒光傳感器，并用于三價鐵離子（Fe³⁺）的測定.除此以外，也有研究人員通過改變納米纖維與其薄膜相比的表面積，進(jìn)而提高靜電紡絲納米纖維的靈敏度^[17].而基于比色法的靜電紡絲技術(shù)重金屬檢測主要利用具有共軛芳香結(jié)構(gòu)的有機(jī)染料與有機(jī)分子絡(luò)合，沉淀重金屬離子.但對該檢測原理，結(jié)合納米纖維的檢測系統(tǒng)的研究目前尚不多見.

利用靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)的熒光和比色電紡納米纖維，因其加工簡單、容易實現(xiàn)化學(xué)官能化、成本低、易檢測等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于實際樣品中的重金屬檢測.

1.1.2 微生物傳感器

微生物傳感器指以活的微生物為敏感材料，利用其代謝產(chǎn)生的光、電、熱等變化，實現(xiàn)定量測定樣品中重金屬含量或評價重金屬對水的毒性的方法（圖2），其能直接反映各種有毒物質(zhì)對生物的綜合影響.

EOM等^[18]在2019年利用間歇補(bǔ)料式的硫氧化細(xì)菌（SOB）生物反應(yīng)器，實現(xiàn)快速檢測重金屬對水的毒性（圖3）.SOB在好氧條件下可將單質(zhì)硫（作為電子供體）氧化生成硫酸鹽，從而增加電導(dǎo)（EC）率，再通過比較電導(dǎo)率來檢測水中的毒性.他們利用該方法監(jiān)測了受重金屬污染2 h后的出水處的重金屬含量變化，并分析了SOB抑制率.結(jié)果表明：SOB反應(yīng)器非常靈敏，適于快速檢測水體中硒、汞、六價鉻和砷的含量，總體檢出時間縮短至2 h以內(nèi).

1.1.3 熒光生物傳感器

熒光生物傳感器是利用光譜和化學(xué)波導(dǎo)，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為熒光信號的傳感裝置（圖4）.當(dāng)待測重金屬離子的電子，受到特定激發(fā)光輻照時，會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的過程中會發(fā)射熒光，測得的熒光強(qiáng)度與待測物中的重金屬含量呈線性相關(guān).其主要部件包括識別結(jié)合基團(tuán)、發(fā)色團(tuán)和連接基團(tuán).識別結(jié)合基團(tuán)選擇性地和待測物通過配位鍵結(jié)合，導(dǎo)致化學(xué)環(huán)境改變，繼而發(fā)色團(tuán)將改變的化學(xué)環(huán)境轉(zhuǎn)化成可檢測的熒光或顏色信號輸出（圖5）.連接基團(tuán)連接起識別結(jié)合基團(tuán)和發(fā)色團(tuán)，選擇合適的連接基團(tuán)對輸出信號至關(guān)重要.

GUO等^[19]利用碳點(diǎn)（CDs）摻雜水凝膠波導(dǎo)實時熒光光譜現(xiàn)場選擇性檢測水體中的Hg²⁺，檢出限低于4 nmol?L^-1，線性范圍在0～5 μmol?L^-1.所測得的熒光強(qiáng)度會迅速減弱，5 min左右達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，即5 min是Hg²⁺的最佳檢測時間.史鴻燕等^[20]開發(fā)了一種新型甾體不對稱雙縮二氨基硫脲席夫堿熒光探針，其利用3-氧代-5β-24-膽烷酸甲酯4與單縮二氨基硫脲2為原料，靈敏度較高，30 s內(nèi)就能達(dá)到峰值，檢測限可達(dá)0.21 μmol?L^-1，可高選擇性地?zé)晒庾R別鋅離子（Zn²⁺）.BIAN等^[21]以金納米團(tuán)簇為熒光傳感器，建立了一種便攜、可回收的Hg²⁺/Pb²⁺現(xiàn)場實時檢測方法，肉眼檢出限分別可達(dá)5 μmol?L^-1和50 μmol?L^-1.PENG等^[22]研發(fā)了一種使用二氧化硅納米粒子（也稱為二氧化硅納米粒子增強(qiáng)熒光（SiEF））來提高探針靈敏度和檢測限的新方法.SiEF法能顯著提高熒光強(qiáng)度和熒光團(tuán)的檢測限，通過紫外燈照射傳感器輸出信號能夠直接觀察到低濃度的重金屬離子.HAO等^[23]開發(fā)了一種基于碲化鎘（CdTe）量子點(diǎn)和兩種染料之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移的新型熒光傳感器，實現(xiàn)了同時檢測水體中的Ag⁺和Hg²⁺.

1.1.4 比色生物傳感器

比色法是將重金屬離子與顯色劑混合，兩者發(fā)生反應(yīng)，生成有色分子團(tuán)，產(chǎn)生顏色變化，再借助光度計快速檢測有色分子團(tuán)的方法^[24]（圖6）.

LI等^[25]用一鍋法制備由半胱氨酸修飾的銀納米粒子（AgNPs），借助溶液中的Hg²⁺實現(xiàn)對組氨酸的檢測.在溶液中添加Hg²⁺有助于半胱氨酸修飾的銀納米粒子和氨基酸結(jié)合，從而使銀納米粒子聚集，顏色從原來的黃色變成粉紅色.LIN等^[26]利用吐溫-20修飾金納米粒子（AuNPs）實現(xiàn)快速檢測Hg²⁺和Ag⁺，檢測時間5 min.吐溫-20能使由檸檬酸根修飾的AuNPs在高離子強(qiáng)度下保持穩(wěn)定.但當(dāng)待測物中含有Hg²⁺和Ag⁺時，檸檬酸鹽會還原Hg²⁺和Ag⁺，并在AuNPs表面形成Hg-Au合金和Ag，吐溫-20從AuNPs表面去除，AuNPs不再穩(wěn)定，發(fā)生聚集，從而引起顏色變化.ZHANG等^[27]也利用AuNPs，在乙二胺的條件下用硫代硫酸鹽（S₂O₃^2-）作為穩(wěn)定劑，檢測了水體中的二價鈷（Co²⁺），檢出限為0.04 μmol?L^-1（2.36×10^-9ng·mL^-1），線性范圍為0.1～0.7 μmol?L^-1.MA等^[28]利用多巴胺作為穩(wěn)定劑修飾銀納米粒子，實現(xiàn)了在10 min內(nèi)對自來水中的二價銅（Cu²⁺）的檢測，檢出范圍在3.20×10^-9～5.12×10^-9ng·mL^-1.比色傳感器對各種分析物都有著較高的靈敏度和選擇性響應(yīng)，因而被廣泛應(yīng)用^[29].

1.2 電化學(xué)分析（EA）法

電化學(xué)分析法是以極譜法為基礎(chǔ)，依據(jù)待測物的電化學(xué)性質(zhì)檢測其成分及含量的一種分析方法.電化學(xué)檢測具有分析時間短、功耗低、靈敏度高、易于現(xiàn)場測量等特點(diǎn)，是目前發(fā)展最快的檢測方法之一^[30].但是相較于其他光學(xué)技術(shù)和光譜法，電化學(xué)分析法的靈敏度和檢測限較低^[31].常用的電化學(xué)分析法可分為離子選擇性電極法、溶出伏安法以及電化學(xué)發(fā)光技術(shù)等.

在實際應(yīng)用中，電化學(xué)分析法多與傳感器配套使用.電化學(xué)傳感器是基于電化學(xué)技術(shù)平臺，利用待測物的電化學(xué)性質(zhì)，將其化學(xué)變化轉(zhuǎn)化成電信號輸出，從而實現(xiàn)檢測待測物及其組分的生物傳感器^[32-33]（圖7）.紀(jì)人月^[34]采用DNAzyme和MoS₂-AuPt雙金屬納米復(fù)合材料，研發(fā)了高靈敏電化學(xué)傳感器，用于檢測水中重金屬Pb污染物，其檢測限可達(dá)到3.8×10^-15 g?mL^-1，但檢出時間需要5 h.GAO等^[35]基于GR-5 Pb依賴性DNAzyme，以三鄰菲羅啉合亞釕（1，10-phenanthroline）為探針，研制了一種電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，成功檢測了Pb.通過雙鏈DNA將電子轉(zhuǎn)移到電極，產(chǎn)生電位階躍激發(fā)電化學(xué)發(fā)光，檢出限達(dá)9×10^-12mol?L^-1.這兩種方法的原理均是在待測物中含有Pb的前提條件下，DNAzyme發(fā)生裂解，導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低，通過減少量來計算待測物中的鉛含量.

1.2.1 離子選擇性電極（ISEs）法

離子選擇性電極法利用特定的膜材料與待測液中的離子發(fā)生特異性響應(yīng)，改變原電池的電位差，改變量與待測液中離子活度的對數(shù)有關(guān)（圖8，9）.其原理是：將敏感膜電極和內(nèi)參比電極一起插到被測溶液中，膜與液體接觸時，陽離子（或陰離子）會從溶液向固液界面處遷移，而液相中存在相反電性的離子，從而形成電位差，溶液中離子濃度越大，電位差越大，通過測定電動勢，能反推得到溶液中待測離子的濃度或活度.HUANG等^[36]研發(fā)了一種離子選擇性電極，利用導(dǎo)電聚硫氨基醌（PSA）納米粒子作為敏感膜中的固體離子球來檢測Pb²⁺，檢測限為0.16 μmol?L^-1，并能持續(xù)穩(wěn)定21 d.這種分析方法因其成本低、準(zhǔn)確性較高、無損、反應(yīng)快的優(yōu)點(diǎn)，而成為一種有趣的研究方向^[37].GUPTA等^[38]利用一種鐵環(huán)胺螯合物的涂層離子選擇性電極測定了自來水和礦泉水中的鐵（Fe³⁺），檢測線性范圍在9.1×10^-6 ～1.0×10^-1mol?L^-1.

1.2.2 溶出伏安法

溶出伏安法對待測物施加一定電壓，待測物中的重金屬離子被還原析出，附著在電極表面，再施加反向電壓，讓還原后的重金屬離子重新氧化溶解，這個過程產(chǎn)生的氧化電流強(qiáng)度和溶液中所含重金屬離子濃度呈正比，以此達(dá)到定量檢測的目的^[39]（圖10）.

AGNIESZKA等^[40]利用吸附溶出伏安法（AdSV）和催化吸附溶出伏安法（CAdSV）測定Co（II）-丁二酮肟（Co-DMG）絡(luò)合物中的痕量Co，最低檢出限為0.07 μg?L^-1，檢測時間在5 min以內(nèi).JOTHIMUTHU等^[41]研發(fā)了一種基于陽極溶出伏安法電化學(xué)檢測錳（Mn）、鋅（Zn）等高電負(fù)性重金屬的傳感器.這種傳感器由鉍工作電極、銀/氯化銀參比電極和金輔助電極3個電極系統(tǒng)構(gòu)成.

1.2.3 電化學(xué)發(fā)光（ECL）技術(shù)

電化學(xué)發(fā)光是指化學(xué)溶液中的自由基離子在電極表面產(chǎn)生均相電子移動，繼而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的現(xiàn)象.ECL技術(shù)具有靈敏度高、操作便易等優(yōu)點(diǎn)，適用于對某些溶液中特定金屬離子的熒光檢測^[28].

ZOU等^[42]在2004年研制了基于半導(dǎo)體量子點(diǎn)的ECL，并且首次實際應(yīng)用.CHENG等^[43]以2，3-二巰基丁二酸（DMSA）為穩(wěn)定劑，制備表面未鈍化的CdTe量子點(diǎn)（QDs），并固定在電極上，構(gòu)建了一種新型ECL傳感系統(tǒng)，用于檢測低電位的金屬離子，成功檢測了Cu²⁺，檢出限為3.0 nmol?L^-1，線性范圍在5.0～7.0 nmol?L^-1.

1.3 免疫分析法

免疫分析法^[44]是以抗原和抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，采用已知抗體檢測未知抗原，或者已知抗原檢測未知抗體的方法.在重金屬檢測研究中，因為重金屬本身不具有免疫原性，必須先與雙功能螯合劑（如1-（4-異硫氰芐基）乙二胺四乙酸（ITCBE）、乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙、三胺五乙酸（DTPA）等）螯合形成半抗原，具備反應(yīng)原性，再與大分子蛋白偶聯(lián)產(chǎn)生免疫原性.現(xiàn)有的免疫方法主要包括酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法等.

1.3.1 酶聯(lián)免疫（ELISA）法

酶聯(lián)免疫法是將抗原抗體特異性反應(yīng)和酶催化反應(yīng)相結(jié)合，利用酶標(biāo)儀將酶促反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，從而實現(xiàn)定量檢測的方法.目前研究報道已有適用于Pb，Cd，Cr，Hg，Cu等重金屬檢測的酶聯(lián)免疫法.常用的酶聯(lián)免疫法主要是間接競爭酶聯(lián)免疫檢測法（ic-ELISA），其檢測過程是將待測溶液滴加到酶標(biāo)板中，若待測物中含有重金屬離子，則其會與事先包被在酶標(biāo)板上的包被原一同競爭單克隆抗體.與重金屬離子特異性結(jié)合的單抗會在后續(xù)的洗板中洗掉，只剩下與包被原結(jié)合的單抗，加入酶標(biāo)記抗體（辣根過氧化物酶HRP）和包被原-單抗（HRP-Ab）結(jié)合顯色.固相吸附的HRP-Ab含量和待測溶液的重金屬離子含量成反比（圖11）.該方法的檢測總時長一般在2 h左右.

鄒淑珍^[45]制備了Hg，Pb，Cd 3種有害重金屬的單克隆抗體，并建立了ic-ELISA法對抗體性能進(jìn)行評價.鄒軍輝^[46]研制了一種采用間接競爭ELISA法檢測樣品中六價鉻的試劑盒.利用納米二氧化鈦分離水樣中的Cr³⁺和Cr⁶⁺，選擇NaHSO₃和 Na₂S₂O₅作為六價鉻還原劑，除去水樣中原有的 Cr³⁺，最終制備的試劑盒檢測限為0.95 ng?mL^-1，靈敏度為6.2 ng?mL^-1.張燚^[47]制備了Hg-ITCBE抗體，鑒定后用于ic-ELISA法檢測，半數(shù)抑制率（IC₅₀）為2.95 ng?mL^-1.郝代玲等^[48]制備了Cu²⁺單克隆抗體，并確立了直接競爭ELISA方法，實現(xiàn)了對Cu²⁺的快速檢測，檢測靈敏度為12.89 ng?mL^-1，檢出限為0.88 ng?mL^-1.

1.3.2 膠體金免疫層析（CGICA）法

膠體金免疫層析法是繼放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記和酶聯(lián)免疫法之后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定法（圖12）^[49].膠體金是一種疏水性金溶膠，呈紅色或紫紅色，用肉眼就可觀察到^[50]，在弱堿條件下帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)上的正電荷形成靜電結(jié)合，不影響蛋白分子的性質(zhì)^[51].其檢測過程為：將待測樣品加到樣品墊上后，如果待測樣品中重金屬超標(biāo)，則其中的重金屬離子會與金標(biāo)墊中的金標(biāo)抗體特異性結(jié)合，再沿著層析方向向前移動，到達(dá)T線，若該膠體金免疫層析的T線處是嵌有包被原的，則偶聯(lián)的重金屬離子（抗原）不被T線截留，在T線處不顯色，而前往C線處顯色;若T線處是嵌有單克隆抗體的，則偶聯(lián)的重金屬離子被T線截留顯色，剩余的金標(biāo)抗體前往C線顯色.

朱旭東等^[52]研發(fā)了一種基于CGICA技術(shù)的定量檢測鎘離子濃度的方法，采用雙功能螯合劑iEDTA螯合鎘離子，以匙孔血藍(lán)蛋白（KLH）作為大分子蛋白偶聯(lián)半抗原制備完全抗原，免疫小鼠制得單克隆抗體，最終該方法的檢測靈敏度達(dá)50 μg?kg^-1.王亞楠等^[53]采用異硫氰酯法，將雙功能螯合劑iEDTA先螯合Cr³⁺再偶聯(lián)牛血清白蛋白（BSA）制備Cr-iEDTA-BSA完全抗原，利用細(xì)胞融合、體內(nèi)腹水誘生技術(shù)制備Cr³⁺-iEDTA單克隆細(xì)胞株，建立了Cr³⁺膠體金免疫層析檢測方法，檢測水體中的Cu²⁺，檢測限為5 ng?mL^-1，檢測時間為10 min. CGICA法因膠體金能與許多生物大分子非共價結(jié)合，且檢測時間基本可控制在5 min左右，受到了廣泛關(guān)注，并被應(yīng)用于實際免疫檢測中^[54].

1.4 紙基檢測法（PADs）

紙基檢測法利用重金屬離子和相關(guān)小分子的螯合反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，以紙墊作為反應(yīng)場所，反應(yīng)顏色深淺與重金屬離子含量成正相關(guān)，從而實現(xiàn)快速檢測重金屬（圖13）.近10年來，分析試紙條由于易攜帶、易于現(xiàn)場檢測、操作簡單、成本低廉和多功能分析等優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的關(guān)注^[55].很多研究表明：分析試紙條能夠成功檢測重金屬離子，并應(yīng)用于食品安全、健康和環(huán)境檢測中^[56].LOPEZ-MARZO等^[57]通過納米金與鎘離子結(jié)合產(chǎn)生顏色反應(yīng)的側(cè)向?qū)游觯↙FA）技術(shù)，檢測水及飲料中的鎘離子水平.RATTANARAT等^[58]利用比色法和電化學(xué)法建立了一種三維微分析試紙條，能有效檢測鎳（Ni），F(xiàn)e，Cu，Cr等重金屬離子.最近，MUHAMMAD-AREE等^[59]利用小分子與重金屬離子結(jié)合產(chǎn)生顏色反應(yīng)的特性制備比色試紙條，并結(jié)合智能手機(jī)拍照定量和定性分析，能夠同時檢測Zn，Cr，Cu，Pb，Mn等重金屬離子.此方法的最大特點(diǎn)是易于攜帶和現(xiàn)場實時檢測，但為了去除其他重金屬離子的干擾，在反應(yīng)的試紙條中加入了劇毒物質(zhì)氰化鈉，容易造成二次環(huán)境污染，且對檢測人員造成危害.目前由于與重金屬離子反應(yīng)的小分子存在專一性低、毒性強(qiáng)、結(jié)合能力弱等缺陷，分析試紙條在檢測敏感性、檢測極限以及安全性等方面還需要做進(jìn)一步改進(jìn).

為篩選出專一性高、無毒性或低毒性、結(jié)合能力強(qiáng)并能產(chǎn)生顏色反應(yīng)的重金屬離子螯合劑，必須找到一種靈敏直觀的篩選方法.本文作者發(fā)現(xiàn)一些酵母突變株對某些重金屬離子表現(xiàn)出極強(qiáng)的敏感性，即使在重金屬含量極低的條件下，這種酵母突變株的生長也會受到抑制^[60-62].螯合劑與重金屬離子間的高親和力結(jié)合則可以去除重金屬離子對酵母突變株的抑制作用.以鎘離子螯合劑篩選為例（圖14）：敲除Cd的分泌蛋白Pca1的酵母突變株失去了對細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鎘離子的排除能力^[63]，即使少量的鎘離子在細(xì)胞內(nèi)的積累都會對突變體造成傷害，從而表現(xiàn)出對pca1Δ細(xì)胞的抑制作用（圖14）.Cd敏感的酵母突變株不能在過量Cd培養(yǎng)基上生長，如果同時加入一種小分子，能消除Cd的抑制作用，那么這種小分子有3種可能的作用：1） 可能抑制了Cd相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，降低了細(xì)胞對鎘離子的吸收;2） 小分子結(jié)合了鎘離子，使得鎘離子處于非自由狀態(tài)，主要使處于自由狀態(tài)的重金屬離子對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用;3） 這種小分子可能對Cd造成的傷害有修復(fù)作用.所以，通過這種方法就有可能篩選出能和重金屬離子直接結(jié)合的小分子螯合劑.

基于此原理，利用對相應(yīng)重金屬離子敏感的酵母突變株和高豐度小分子庫，通過高通量方法篩選高效、低毒、專一的重金屬離子螯合劑.并對螯合劑和重金屬離子結(jié)合反應(yīng)特性進(jìn)行鑒定和優(yōu)化，選取能產(chǎn)生特定顏色反應(yīng)的螯合劑，制備快速檢測試紙條，就能為環(huán)境和食品中的重金屬檢測提供一種快速有效的檢測方法.

2? 總結(jié)與展望

傳統(tǒng)的重金屬檢測方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，仍舊是檢測重金屬最可靠的主流方法，但檢測儀器始終存在體積大、不易攜帶、價格高、程序繁瑣和耗時較長等限制.為確保環(huán)境、糧食、食品中重金屬可即時檢測，快速、便于攜帶、低成本、簡單可靠并且便于現(xiàn)場檢測的方法成為了重金屬檢測領(lǐng)域的重要發(fā)展方向.基于目前的技術(shù)手段，本文綜述的重金屬檢測方法的檢測極限時間都縮短到了10 min以內(nèi).這些方法借助相應(yīng)的便攜式傳感器及重金屬檢測分析儀器，可以實現(xiàn)定量檢測重金屬.其中膠體金免疫層析法不需借助傳感器，相對其他檢測方法更為便捷，檢測時間更短，但其只能用于定性分析樣品中的重金屬含量是否過量.所以在未來的重金屬快速檢測方向中，可以結(jié)合膠體金免疫層析法和紙基檢測法實現(xiàn)定性半定量快速便攜的現(xiàn)場重金屬檢測.其中，篩選出專一性高、無毒性或低毒性、結(jié)合能力強(qiáng)并能產(chǎn)生顏色反應(yīng)的重金屬離子螯合劑，是制備重金屬離子試紙條的關(guān)鍵所在.

參考文獻(xiàn)：

[1]? CALLENDER E.Heavy metals in environment：historical trends [J].Treatise on Geochemistry，2003，9：67-105.

[2]? GUO Z，SEOL M，GAO C，et al.Functionalized porous Si nanowires for selective and simultaneous electrochemical detection of Cd（II） and Pb（II） ions [J].Electrochimica Acta，2016，211：998-1005.

[3]? BANSOD B，KUMAR T，THAKUR R，et al.A review on various electrochemical techniques for heavy metal ions detection with different sensing platforms [J].Biosensors and Bioelectronics，2017，94：443-455.

[4]? 劉瑋寧，張煒哲.全國3億畝耕地遭重金屬污染威脅 [J].共產(chǎn)黨員，2011（12）：27.

LIU W N，ZHANG W Z.The threat of heavy metal of 20 trillion square meters of arable land in China [J].Communist，2011（12）：27.

[5]? 姜妮.重金屬污染危害凸顯 [J].環(huán)境經(jīng)濟(jì)，2011（10）：10-14.

JIANG N.The obvious harm of heavy metal pollution [J].Environmental Economy，2011（10）：10-14.

[6]? 孫海龍.冷藏車結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及技術(shù)應(yīng)用 [J].中國戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)（理論版），2019（7）：1.

[7]? GONG T，LIU J，LIU X，et al.A sensitive and selective platform based on CdTe QDs in the presence of L-cysteine for detection of silver，mercury and copper ions in water and various drinks [J].Food Chemistry，2016，213：306-312.

[8]? TRINDADE N，DANTAS F，LIMA C，et al.Multivariate optimization of ultrasound-assisted extraction for determination of Cu，F(xiàn)e，Ni and Zn in vegetable oils by high-resolution continuum source atomic absorption spectrometry [J].Food Chemistry，2015，185：145-150.

[9]? SITKO R，JANIK P，ZAWISZA B，et al.Green approach for ultratrace determination of divalent metal ions and arsenic species using total-reflection X-ray fluorescence spectrometry and mercapto-modified graphene oxide nanosheets as a novel adsorbent [J].Analytical Chemistry，2015，87：3535-3542.

[10]????? LOSEV N，BUYKO V，TROFIMCHUK K，et al.Silica sequentially modified with polyhexamethylene guanidine and Arsenazo I for preconcentration and ICP-OES determination of metals in natural waters [J].Microchemical Journal，2015，123：84-89.

[11]????? FELDMANN J，SALAUN P，LOMBI E.Critical review perspective：elemental speciation analysis methods in environmental chemistry-moving towards methodological integration [J].Environmental Chemistry，2009，6（4）：275-289.

[12]????? CUI L，WU J，JU H.Electrochemical sensing of heavy metal ions with inorganic，organic and bio-materials [J].Biosensors and Bioelectronics，2015，63：276-286.

[13]????? 帕克，劉呈坤.靜電紡絲裝置：設(shè)計靜電紡絲工藝制備納米纖維 [J].合成纖維，2008（2）：46-49.

PARK S，LIU C K.Electrospinning device：design electrospinning process to prepare nanofibers [J].Synthetic Fiber in China，2008（2）：46-49.

[14]????? TERRA A，MERCANTE A，ANDRE S，et al.Fluorescent and colorimetric electrospun nanofibers for heavy-metal sensing [J].Biosensors，2017，7（4）：61-74.

[15]????? MA L，LIU K，YIN M，et al.Fluorescent nanofibrous membrane （FNFM） for the detection of mercuric ion（Ⅱ） with high sensitivity and selectivity [J].Sensors and Actuators B：Chemical，2017，238：120-127.

[16]????? LI Z，ZHOU H，XU B，et al.Luminescent properties and sensing performance of a carbon quantum dot encapsulated mesoporous silica/polyacrylonitrile electrospun nanofibrous membrane [J].Journal of Materials Science，2016，51（14）：6801-6811.

[17]????? WU C，LAI J.Preparation of thermo-responsive electrospun nanofibers containing rhodamine-based fluorescent sensor for Cu²⁺detection [J].Journal of Polymer Research，2016，23（11）：223-233.

[18]????? EOM H，WANG H，SEDKY A，et al.Rapid detection of heavy metal-induced toxicity in water using a fed-batch sulfur-oxidizing bacteria（SOB） bioreactor [J].Journal of Microbiological Methods，2019，161：35-42.

[19]????? GUO J，ZHOU J，YANG X.Fluorescent hydrogel waveguide for on-site detection of heavy metal ions [J].Scientific Reports，2017，7（1）：7902-7909.

[20]????? 史鴻燕，石治川，趙志剛.甾體熒光探針的合成及對廢水重金屬離子的檢測 [J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2020，32（7）：1182-1187.

SHI H Y，SHI Z C，ZHAO Z G.Synthesis of steroidal fluorescent probe and evaluation of their metal ions recognition [J].Chemical Research and Application，2020，32（7）：1182-1187.

[21]????? BIAN X，WU D，CHAI F，et al.Facile preparation of fluorescent Au nanoclusters-based test papers for recyclable detection of Hg²⁺and Pb²⁺[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2017，241：592-600.

[22]????? PENG J，LI Y，XU W，et al.Silica nanoparticle-enhanced fluorescent sensor array for heavy metal ions detection in colloid solution [J].Analytical Chemistry，2018，90（3）：1628-1634.

[23]????? HAO L，XUA G，XING R，et al.Oligonucleotide-based fluorogenic sensor for simultaneous detection of heavy metal ions [J].Biosensors and Bioelectronics，2012，36（1）：174-178.

[24]????? 馬彪奇.食品重金屬污染來源危害及其檢測方法分析 [J].食品安全導(dǎo)刊，2020（24）：51.

MA B Q.Analysis of heavy metal pollution sources and its detection method in food [J].China Food Safety Magazine，2020（24）：51.

[25]????? LI H，BIAN H.Selective colorimetric sensing of histidine in aqueous solutions using cysteine modified silver nanoparticles in the presence of Hg²⁺[J].Nanotechnology，2009，20（14）：145502-145508.

[26]????? LIN Y，Y J，LIN H，et al.Colorimetric sensing of silver（Ⅰ） and mercury（Ⅱ） ions based on an assembly of Tween 20-stabilized gold nanoparticles [J].Analytical Chemistry，2010，82（16）：6830-6837.

[27]????? ZHANG Z Y，ZHANG J，LOU T T，et al.Label-free colorimetric sensing of cobalt（Ⅱ） based on inducing aggregation of thiosulfate stabilized gold nanoparticles in the presence of ethylenediamine [J].The Analyst，2012，137（2）：400-405.

[28]????? MA R，NIU Y，ZHANG L，et al.Colorimetric detection of copper ions in tap water during the synthesis of silver/dopamine nanoparticles [J].Chemical Communications，2011（47）：12643-12645.

[29]????? AJAY S，PRITO J，KIRUBA D S C G，et al.Colorimetric sensors for rapid detection of various analytes [J].Materials Science and Engineering：C，2017：1231-1245.

[30]????? LIN C，WU J，JU X.Electrochemical sensing of heavy metal ions with inorganic，organic and bio-materials [J].Biosensors and Bioelectronics，2015，63：276-286.

[31]????? BABAN B，TEJINDER K，RITULA T，et al.A review on various electrochemical techniques for heavy metal ions detection with different sensing platforms [J].Biosensors and Bioelectronics，2017，94：443-455.

[32]????? WANG Y，PENG L，F(xiàn)U J，et al.Recent advances in the development of electrochemical apt sensors for detection of heavy metals in food [J].Biosensors and Bioelectronics，2020，147：111777.

[33]????? 杜一平.現(xiàn)代儀器分析方法 [M].上海：華東理工大學(xué)出版社，2015：203-205.

DU Y P.Methods of Modern Instrumental Analysis [M].Shanghai：East China University of Science and Technology Press，2015：203-205.

[34]????? 紀(jì)人月.基于DNAzyme和MoS₂-AuPt雙金屬納米復(fù)合材料的高靈敏電化學(xué)傳感器用于檢測水中重金屬鉛污染物 [D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2020.

JI R Y.Ultrasensitive Electrochemical Sensor Based on DNAzyme and MoS₂-AuPt Nanocomposites for Detecting Heavy Metal Lead Pollutants in Water [D].Chongqing：Chongqing Medical University，2020.

[35]????? GAO A，TANG X，HE W，et al.Electrochemiluminescent lead biosensor based on GR-5 lead-dependent DNAzyme for Ru （phen）₃²⁺intercalation and lead recognition [J].The Analyst，2013，138（1）：263-268.

[36]????? HUANG R，DING B，LI G.Combinatorial screening of potentiometric Pb（Ⅱ） sensors from polysulfoaminoanthraquinone solid ionophore [J].ACS Combinatorial Science，2014，16（3）：128-138.

[37]????? ALEKSANDAR R，DERMOT D.Chapter 2 ion-selective electrodes in trace level analysis of heavy metals：potentiometry for the XXI century [J].Comprehensive Analytical Chemistry，2007，49：25-52.

[38]????? GUPTA K，SETHI B，UPADHYAY N，et al.Iron （Ⅲ） selective electrode based on S-methyl N-（methylcarbamoyloxy） thioacetimidate as a sensing material [J].International Journal of Electrochemical Science，2011，6（3）：650-663.

[39]????? 周秀英，羅歡，韓曉燕，等.水環(huán)境重金屬檢測技術(shù)研究進(jìn)展 [J].廣東化工，2020，47（15）：151-152.

ZHOU X Y，LUO H，HAN X Y，et al.Progress on detection methods of heavy metals in water environment [J].Guangdong Chemical Industry，2020，47（15）：151-152.

[40]????? AGNIESZKA K，ANDRZEJ B，KURT K，et al.Study on catalytic adsorptive stripping voltammetry of trace cobalt at bismuth film electrodes [J].Electroanalysis，2003，15（23/24）：1859-1863.

[41]????? JOTHIMUTHU P，WILSON R A，HERREN J.Lab-on-a-chip sensor for detection of highly electronegative heavy metals by anodic stripping voltammetry [J].Biomedical Microdevices，2011，13（4）：695-703.

[42]????? ZOU Z，JU X.Electrogenerated chemiluminescence from a CdSe nanocrystal film and its sensing application in aqueous solution [J].Analytical Chemistry，2004，76（23）：6871-6876.

[43]????? CHENG X，LIU X，LEI P，et al.Low-potential electrochemiluminescent sensing based on surface unpassivation of CdTe quantum dots and competition of analyte cation to stabilizer [J].Analytical Chemistry，2010，82（8）：3359-3364.

[44]????? 丁學(xué)亮，程建，劉強(qiáng).玉米中重金屬與真菌毒素的檢測和分析 [J].食品安全導(dǎo)刊，2020（21）：83.

DING X L，CHENG J，LIU Q.Detection and analysis of heavy metals and mycotoxins in Maize [J].China Food Safety Magazine，2020（21）：83.

[45]????? 鄒淑珍.汞、鉻、鉛三種重金屬免疫快速檢測方法的研究 [D].無錫：江南大學(xué)，2017.

ZOU S Z.Development of rapid immunoassay for Hg Cr and Pb [D].Wuxi：Jiangnan University，2017.

[46]????? 鄒軍輝.六價鉻間接競爭ELISA檢測試劑盒的研制及新型一步法競爭ELISA的建立 [D].廣州：暨南大學(xué)，2012.

ZOU J H.Development of indirect competitive ELISA kit and novel one step competitive ELISA for detection of hexavalent chromium [D].Guangzhou：Jinan University，2012.

[47]????? 張燚.Hg²⁺快速免疫檢測技術(shù)研究 [D].長春：吉林大學(xué)，2011.

ZHANG Y.Dvelopment of Immunoassay Technique for Hg²⁺[D].Changchun：Jilin University，2011.

[48]????? 郝代玲，黃建芳，楊浩，等.重金屬銅的單抗的制備及免疫學(xué)檢測方法的建立 [J].食品工業(yè)科技，2017，38（19）：245-248，255.

HAO D L，HUANG J F，YANG H，et al.Preparation of monoclonal antibody against copper and establishment of immunological detection methods [J].Science and Technology of Food Industry，2017，38（19）：245-248，255.

[49]????? 張書永.免疫膠體金快速診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用與質(zhì)量控制 [J].中國醫(yī)學(xué)裝備，2013，10（5）：37-39.

ZHANG S Y.Application of immune colloidal gold technique in disease diagnosis and its quality control [J].China Medical Equipment，2013，10（5）：37-39.

[50]????? SITHIGORNGUL P，RUKPRATANPOR S，PECHARABURANIN N，et al.A simple and rapid immuno-chromatographic test strip for detection of pathogenic isolates ofVibrio harveyi[J].Microbiol Methods，2007，71（3）：256-264.

[51]????? 李斌.呋喃西林代謝物SEM單克隆抗體的制備及其熒光定量檢測試紙條的研究 [D].廣州：華南理工大學(xué)，2018.

LI B.Preparation of monoclonal antibody for nitrofurazone metabolite SEM and study on quantitative test specimen of fluorescence [D].Guangzhou：South China University of Technology，2018.

[52]????? 朱旭東，趙小旭.糧食中重金屬鎘定量快速檢測方法的建立 [J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2017，42（3）：39-42，61.

ZHU X D，ZHAO X X.Preparation of a rapid method for quantitative determination of cadmium in grain [J].Grain Science and Technology and Economy，2017，42（3）：39-42，61.

[53]????? 王亞楠，王曉斐，丁菡，等.鉻離子單克隆抗體的制備及食品總鉻含量檢測膠體金免疫層析試紙條的研制 [J].食品工業(yè)科技，2016，37（18）：63-69.

WANG Y N，WANG X F，DING H，et al.Preparation of monoclonal antibody against trivalent chromic ion and development of colloidal gold immunochromatographic assay for detecting total chromium content in food [J].Science and Technology of Food Industry，2016，37（18）：63-69.

[54]????? 龔頻，王思遠(yuǎn)，陳雪峰，等.膠體金免疫層析試紙條技術(shù)及其在食品安全檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].食品工業(yè)科技，2019，40（13）：358-364.

GONG P，WANG S Y，CHEN X F，et al.Research progress of colloidal gold immunochromatographic test strip technology and its application in food safety testing [J].Science and Technology of Food Industry，2019，40（13）：358-364.

[55]????? LIN Y，GRITSENKO D，F(xiàn)ENG S，et al.Detection of heavy metal by paper-based microfluidics [J].Biosensors and Bioelectronics，2016，83：256-266.

[56]????? WANG A，MOLINA G，PRIMA V，et al.Anti-LPS test strip for the detection of food contaminated withSalmonellaandE.coli[J].Journal of Microbial and Biochemical Technology，2011，3（2）：26-29.

[57]????? LOPEZ-MARZO A M，PONS J，BLAKE D，et al.All-integrated and highly sensitive paper based device with sample treatment platform for Cd²⁺immunodetection in drinking/tap waters [J].Analytical Chemistry，2003，85（7）：3532-3538.

[58]????? RATTANARAT P，DUNGCHAI W，CATE D，et al.Multilayer paper-based device for colorimetric and electrochemical quantification of metals [J].Analytical Chemistry，2014，86（7）：3555-3562.

[59]????? MUHAMMAD-AREE S，TEEPOO S.On-site detection of heavy metals in wastewater using a single paper strip integrated with a smartphone [J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2020，412（6）：1395-1405.

[60]????? WU X，SINANI D，KIM H，et al.Copper transport activity of yeast Ctr1 is down-regulated via its C terminus in response to excess copper [J].Journal of Biological Chemistry，2009，284 （7）：4112-4122.

[61]????? WEI W，SMITH N，WU X，et al.YCF1-mediated cadmium resistance in yeast is dependent on copper metabolism and antioxidant enzymes [J].Antioxidants and Redox Signaling，2014，21（10）：1475-1489.

[62]????? CHEN X，ZHANG R，SUN J，et al.A novel assessment system of toxicity and stability of CuO nanoparticles via copper super sensitiveSaccharomyces cerevisiaemutants [J].Toxicology in Vitro，2020，69：104969.

[63]????? ADLE D J，SINANI D，KIM H，et al.A cadmium-transporting P1B-type ATPase in yeastSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Biological Chemistry，2007，282（2）：947-945.

（責(zé)任編輯：顧浩然，郁慧）