補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)的有效成分及作用機(jī)制研究*

李東紅，胥芷靈，徐翠珊，賈永艷，3，張運(yùn)克，2

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州450046

中風(fēng)，又稱卒中，始見于張仲景《金匱要略》，是以半身不遂、肌膚不仁、口舌歪斜、言語(yǔ)不利，甚則突然昏仆、不省人事為主要表現(xiàn)的病癥，屬中醫(yī)四大疑難病癥之首［1］，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的急性腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康［2］。歷代醫(yī)家對(duì)于中風(fēng)有不同見解。明清時(shí)期，王清任認(rèn)為，其發(fā)病機(jī)制在于氣虛血瘀，治療需遵循養(yǎng)陰益氣，活血化瘀和疏通經(jīng)絡(luò)?！夺t(yī)林改錯(cuò)·論抽風(fēng)不是風(fēng)》言：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無(wú)氣，必停留而瘀。以一氣虛血瘀之癥?！辈⑹状问蛰d了補(bǔ)陽(yáng)還五湯一方［3-6］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁和紅花7味中藥組成，具有補(bǔ)氣通絡(luò)的功效，是中藥方劑中益氣活血的經(jīng)典方劑，在中風(fēng)的臨床治療中發(fā)揮了極大的作用［7-12］。但是對(duì)于補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)的有效成分及作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從補(bǔ)陽(yáng)還五湯所含成分入手，通過(guò)TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)，并與中風(fēng)疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比篩選，使用Cytoscape3.6.0數(shù)據(jù)可視化軟件制作中藥復(fù)方成分-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)STRING在線軟件，得到中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)蛋白作用網(wǎng)絡(luò)及中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)核心蛋白作用網(wǎng)絡(luò)。最后使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)與微生信在線作圖工具，制作GO富集分析與KEGG通路富集分析氣泡圖，以預(yù)測(cè)該方劑治療中風(fēng)的有效成分及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建通過(guò)TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索補(bǔ)陽(yáng)還五湯中7味中藥所含化學(xué)成分，以O(shè)B（口服生物利用度）值≥30%、DL（類藥性）值≥0.18為篩選條件獲得各個(gè)中藥所含化學(xué)成分，構(gòu)建補(bǔ)陽(yáng)還五湯所含化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)基于補(bǔ)陽(yáng)還五湯所含化學(xué)成分，通過(guò)TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)對(duì)該方劑所含化學(xué)成分進(jìn)行化合物-蛋白質(zhì)作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，利用Uniprot蛋白質(zhì)生物功能數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.Uniprot.org/），獲得相關(guān)基因靶點(diǎn)，矯正蛋白質(zhì)名稱。

1.3 中風(fēng)疾病靶點(diǎn)篩選以“Acute cerebrovascular disease”為關(guān)鍵詞在GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）及OMIM在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org/）中檢索，得到中風(fēng)疾病靶點(diǎn)。

1.4 中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)的獲取通過(guò)1.2項(xiàng)及1.3項(xiàng)獲得補(bǔ)陽(yáng)還五湯相關(guān)作用靶點(diǎn)及中風(fēng)疾病靶標(biāo)后，取兩者的靶點(diǎn)基因交集。

1.5 中藥復(fù)方成分-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將1.4項(xiàng)所得中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)與補(bǔ)陽(yáng)還五湯所含活性成分對(duì)應(yīng)，通過(guò)Cytoscape3.6.0數(shù)據(jù)可視化軟件（http：//cytoscape.org/）處理，得到中藥復(fù)方成分-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶標(biāo)的篩選將1.4項(xiàng)中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入STRING在線軟件（https：//string-db.org/），選擇人類基因庫(kù)，得到補(bǔ)陽(yáng)還五湯作用于中風(fēng)的PPI蛋白作用網(wǎng)絡(luò)。

1.7 GO富集分析與KEGG通路富集分析將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//metascape.org/gp/index.html），選擇物種為人類，得到基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of gene and genome，KEGG）通路富集分析信息。

2 結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方成分-疾病靶標(biāo)的獲取與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過(guò)TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)分別尋找補(bǔ)陽(yáng)還五湯全部活性成分（地龍未收錄，通過(guò)查閱文獻(xiàn)［13］，得到其活性成分名稱、結(jié)構(gòu)式、CAS號(hào)，通過(guò)CAS號(hào)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢），設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18，進(jìn)行初步篩選。并在該數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行活性成分-蛋白靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，保留具有蛋白靶點(diǎn)的活性成分。利用Uniprot蛋白質(zhì)生物功能數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.Uniprot.org/），獲得相關(guān)基因靶點(diǎn)，除去找不到基因靶點(diǎn)的成分，共得到補(bǔ)陽(yáng)還五湯活性成分63個(gè)，相關(guān)靶點(diǎn)242個(gè)。以“Acute cerebrovascular disease”為關(guān)鍵詞在GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)及OMIM在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索疾病相關(guān)靶點(diǎn)信息，整合二者所得數(shù)據(jù)，得到中風(fēng)相關(guān)疾病靶點(diǎn)1 732個(gè)。利用韋恩圖進(jìn)行分析，取補(bǔ)陽(yáng)還五湯中所含成分靶點(diǎn)及中風(fēng)疾病靶點(diǎn)交集，獲得中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)136個(gè)，藥物-疾病基因映射率為56.2%，見圖1。將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)與補(bǔ)陽(yáng)還五湯所含活性成分對(duì)應(yīng)，得到補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)的活性成分20個(gè)，見表1。通過(guò)Cytoscape3.6.0數(shù)據(jù)可視化軟件（http：//cytoscape.org/）處理，得到中藥復(fù)方成分-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖2，其中來(lái)自黃芪與紅花的共有成分槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol），黃芪與桃仁共有成分常春藤皂苷元（hederagenin），當(dāng)歸、赤芍、桃仁與紅花共有成分β-谷甾醇（beta-sitosterol）作用尤為明顯。

圖1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯成分靶點(diǎn)-中風(fēng)疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 中藥復(fù)方活性成分-疾病靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

表1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯作用于中風(fēng)疾病靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)活性成分

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶標(biāo)的篩選將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入STRING在線軟件，選擇人類基因庫(kù)，得到中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，并下載結(jié)果文件。將結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.0數(shù)據(jù)可視化軟件，進(jìn)行權(quán)重分析，計(jì)算degree值，將degree值＞59（二倍中位數(shù)）作為篩選依據(jù)，得到中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)核心蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，見圖3。其中核心靶標(biāo)按照degree值從大到小依次為AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、CASP3、MAPK8、JUN、EGF、IL-1B、MAPK1、NOS3、MMP9、EGFR、CAT、CCL2、FOS、IL-10、ESR1、MMP2、IL-4。

圖3 中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)蛋白作用網(wǎng)絡(luò)及核心蛋白作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO富集分析將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為人類，得到基因本體論（GO）富集分析信息，保存文件。以基因數(shù)作為篩選依據(jù)，GO富集分析選擇前10項(xiàng)，作GO Biological process（BP）、GO Cellular component（CC），GO Molecular function（MF）三合一柱形圖，見圖4。GO富集分析提示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯活性成分主要富集在無(wú)機(jī)物應(yīng)答、毒性物質(zhì)應(yīng)答、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、含氮化合物的纖維素反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、纖維素酯、細(xì)菌應(yīng)答、有機(jī)環(huán)化合物的細(xì)胞反應(yīng)、激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路等；在分子組成方面，主要與膜筏、膜微域、膜區(qū)、突觸后、突觸膜、軸突、受體復(fù)合體、液泡、突觸后膜、突觸前等相關(guān)；在分子功能方面，主要涉及蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)均二聚體活性、蛋白激酶結(jié)合、激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、協(xié)因子綁定、受體調(diào)節(jié)活性、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ等。

圖4 BP、CC、MF三合一柱形圖

2.4 KEGG通路富集分析將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入Metascape，選擇物種為人類，得到京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析信息，保存文件。以基因數(shù)作為篩選依據(jù)，選擇富集分析信息前20項(xiàng)，見表2。最后用微生信在線作圖工具作KEGG通路富集分析氣泡圖，見圖5。由KEGG通路富集分析信息可知，補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)疾病的KEGG通路主要有癌癥通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎病毒、IL-17信號(hào)通路、結(jié)核病、TNF信號(hào)通路、弓形體病、蛋白聚糖在癌癥的作用、恰加斯病（美洲錐蟲?。APK信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、非酒精性脂肪肝、甲型流感、細(xì)胞因子-受體相互作用、百日咳、HTLV-I感染、HIF-1信號(hào)通路及直腸癌等。

表2 KEGG通路富集分析信息表

圖5 KEGG通路富集信息氣泡圖

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論和方法，使用數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)工具尋找補(bǔ)陽(yáng)還五湯活性成分及靶點(diǎn)，篩選補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)的活性成分、靶標(biāo)及核心靶標(biāo)，構(gòu)建中藥復(fù)方活性成分-疾病靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、中藥復(fù)方疾病靶標(biāo)蛋白作用網(wǎng)絡(luò)、中藥復(fù)方疾病靶標(biāo)核心蛋白作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）及GO、KEGG通路富集分析研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)的有效成分及作用機(jī)制。結(jié)果表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)有效成分20個(gè)，其中君藥黃芪與紅花共有成分槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol），黃芪與桃仁共有成分常春藤皂苷元（hederagenin），當(dāng)歸、赤芍、桃仁與紅花共有成分β-谷甾醇（beta-sitosterol）作用最明顯。其中槲皮素（quercetin）具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗炎、抗菌等生理活性［14-15］，并且具有降血糖、降血壓、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓和防止冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等多種心血管保護(hù)作用［16］；山奈酚（kaempferol）具有抗癌、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、疾病預(yù)防、心肌保護(hù)、抗慢性腦缺血等藥理作用［17-18］；常春藤皂苷元（hederagenin）具有抗腫瘤、抗抑郁、抗菌抗炎、抗糖尿病、神經(jīng)保護(hù)以及改善高脂血癥血液流變學(xué)等藥理作用［19］；β-谷甾醇（beta-sitosterol）具有抗氧化、降低膽固醇、抗炎、抗焦慮及抗驚厥等藥理作用［20］。但是，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以O(shè)B≥30%，DL≥0.18篩選補(bǔ)陽(yáng)還五湯中活性成分時(shí)，君藥黃芪的主要成分黃芪皂苷中大多化合物未通過(guò)篩選，所以通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以O(shè)B≥30%，DL≥0.18篩選補(bǔ)陽(yáng)還五湯中活性成分可能會(huì)存在某些主要成分的丟失。

中藥復(fù)方補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)的核心靶點(diǎn)主要有：AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、CASP3、MAPK8、JUN、EGF、IL-1B、MAPK1、NOS3、MMP9、EGFR、CAT、CCL2、FOS、IL-10、ESR1、MMP2、IL-4。其中AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究表明AKT1在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，并且可以調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展過(guò)程中的血管重塑［21］，與腫瘤、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病發(fā)生相關(guān)［22-23］；IL-6、TNF、IL-1B、IL-10、IL-4均為重要的炎癥因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種炎癥反應(yīng)［24］，其中IL-6是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要炎癥標(biāo)志物，TNF的亞型TNF-α能夠增加損傷血管中炎性細(xì)胞數(shù)量，并通過(guò)協(xié)助血管平滑肌重塑參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程；ALB、VEGFA、CXCL8會(huì)影響人體血液流變學(xué)［25-28］，血清中ALB水平的異常變化可能會(huì)引起腦梗死的復(fù)發(fā)［29］，VEGFA通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，可以調(diào)節(jié)血管和淋巴管的生成；TP53可以調(diào)控細(xì)胞分裂與增殖；PTGS2基因的表達(dá)產(chǎn)生環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2），環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）參與花生四烯酸合成血栓素A2的過(guò)程，促進(jìn)血小板聚集；MMP9和MMP2是細(xì)胞外基質(zhì)重塑的關(guān)鍵效應(yīng)物，MMP2參與神經(jīng)纖維間質(zhì)的浸潤(rùn)和分解過(guò)程，與腦組織損傷狀況關(guān)系密切［30］。

中藥復(fù)方補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)的主要通路有癌癥的途徑、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎病毒、IL-17信號(hào)通路、結(jié)核病、TNF信號(hào)通路、弓形體病、蛋白聚糖在癌癥的作用、恰加斯?。乐掊F蟲?。?、MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、非酒精性脂肪肝、甲型流感、細(xì)胞因子-受體相互作用、百日咳、HTLV-I感染、HIF-1信號(hào)通路、直腸癌等。研究表明高膽固醇血癥誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化可能是通過(guò)AGE-RAGE介導(dǎo)的，可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體通過(guò)與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體競(jìng)爭(zhēng)能抑制動(dòng)脈粥樣硬化［31］；流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路在血脂異常向動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用；流體剪切應(yīng)力是血液與內(nèi)皮之間的摩擦力，是決定內(nèi)皮功能和基因表達(dá)的主要因素，可以調(diào)整血管通透性［32］；激活PI3K-AktmTOR通路能保護(hù)大腦缺血再灌注損傷，具有神經(jīng)保護(hù)功能，可抑制氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)元自噬［33］；IL-17通路被激活后可以加速血管的動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程［34］；HIF-1信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)血脂的代謝。由此可以看出，補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)主要通過(guò)影響細(xì)胞凋亡與再生、改善血液流變學(xué)、影響人體代謝水平等方面多通路達(dá)到治療效果。

綜上所述，該研究通過(guò)對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究進(jìn)一步明確了補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)的有效成分、靶點(diǎn)及作用機(jī)制，這也進(jìn)一步證明了中藥治療疾病的整體性原則，在發(fā)揮治療疾病作用時(shí)，將人體作為一個(gè)整體，通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多通路達(dá)到治療疾病的目的。