艾里光束調(diào)控與三維顯微成像應(yīng)用

王 健， 郭宗林

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 物理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150001)

1 引 言

艾里函數(shù)是亥姆霍茲方程的精確解析解，據(jù)此通過頻域調(diào)控方法制備的艾里光束具有無衍射、自修復(fù)和自加速的特殊性質(zhì)[1-2]，其無衍射特性可使其在傳播幾個瑞利長度內(nèi)保持波前穩(wěn)定。自修復(fù)特性可使光束在透過強散射介質(zhì)和波前畸變后快速恢復(fù)波前。自加速特性導(dǎo)致光束在傳播過程中表現(xiàn)出橫向自彎曲。這些特性使其在光操控[3]、微加工[4]、非線性光學(xué)[5]、光學(xué)顯微成像[6]、湍流大氣研究[7]等領(lǐng)域受到關(guān)注。

2007年，Siviloglou等人[8]首次提出了基于高斯光束的頻域調(diào)控方法，在實驗中產(chǎn)生了艾里光束，并研究了橫向自加速特性。2008年，艾里光束的自修復(fù)特性引起關(guān)注，Broky理論分析了其物理機制，并通過實驗進行了驗證[9]。此后，艾里光束的獨特傳播特性及其顯微成像的潛在應(yīng)用獲得深入研究。2014年，艾里光束被制作成光片，用于光片顯微鏡的激發(fā)光場，提高了傳統(tǒng)光片顯微鏡的成像分辨率[10]。同年，Jia等人[11]在隨機發(fā)射顯微鏡(STORM)中利用艾里光束調(diào)制點擴散函數(shù)，提高了三維定位精度，但其自加速特性導(dǎo)致的橫向自彎曲傳播性能及其應(yīng)用潛力并未被充分研究。

本文研究一種利用液晶空間光調(diào)制器調(diào)控艾里光束的自加速特性，并基于光束的橫向自彎曲傳播調(diào)控實現(xiàn)的艾里光束三維重建顯微鏡。該顯微鏡具有無掃描高分辨三維成像能力。介紹其工作原理、設(shè)計的方法以及實驗結(jié)果，為紅外、太赫茲等其他波段三維成像系統(tǒng)設(shè)計提供參考。

2 工作原理與實現(xiàn)方法

2.1 艾里光束的產(chǎn)生與傳播特性調(diào)控

圖1 艾里光束的產(chǎn)生光路(a)與不同調(diào)制參數(shù)的艾里光束(b)、(c)。Fig.1 Set-up for generation of Airy beam (a) and Airy beam with various modulation parameters (b)，(c).

調(diào)控艾里光束的點擴散函數(shù)(PSF)是實現(xiàn)高質(zhì)量成像的重要手段。為了提高成像的分辨率和對比度，除增大調(diào)制圖案的參數(shù)α，減小艾里光束主瓣尺寸，還需要削弱艾里光束點擴散函數(shù)(Poent Spread Functron,PSF)旁瓣(見圖1(b),(c)中圖尾部)對成像的影響。根據(jù)艾里光束PSF的分布特性，本文通過在空間光調(diào)制器(Spatial Light Modulator,SLM)平面施加帶通濾波器實現(xiàn)PSF旁瓣的壓縮。

圖2 壓縮艾里光束PSF旁瓣的調(diào)制圖案(a)和實驗結(jié)果(b)Fig.2 Modulation mask to generate side-lobe-suppressed PSF of Airy beam (a) and experiment results (b)

采取如圖2(a)所示的調(diào)制圖案實現(xiàn)艾里光束PSF旁瓣的壓縮。圖中，基于圖1(b)、(c)的調(diào)制圖案，在y方向進行了帶通截止，截止波矢滿足|ky|=kyc，由于|ky|>kyc的部分主要影響艾里光斑的旁瓣分布，合理選擇kyc即可調(diào)控艾里光束旁瓣的所占比例。此外，我們在調(diào)制圖案上疊加了閃耀光柵，從而實現(xiàn)+1級調(diào)制圖像的分離與測量。圖中的黃色圓環(huán)是高斯光場頻譜范圍，調(diào)制圖案中心與高斯光頻譜中心重合。圖2(b)是在優(yōu)化kyc后,實驗觀測的截止前后的艾里光束PSF圖像。

2.2 基于艾里光束自彎曲特性調(diào)控的三維重建成像設(shè)計

根據(jù)艾里光束的傳播理論，艾里光束在傳播過程中具有自彎曲特性，彎曲方向與調(diào)制圖案的設(shè)置有關(guān)，且艾里光主瓣的橫向平移距離Δl′與軸向傳播距離z滿足如下關(guān)系

(1)

式中，A是自彎曲系數(shù)，M是系統(tǒng)的放大倍數(shù)，R′代表艾里光斑主瓣直徑。因此，對于三維分布的物空間點陣，如圖3(a)中的B1、B2、B3，當(dāng)被調(diào)制為艾里光束傳播后將在探測面形成投影分布。其中，B1和B2點由于分布在不同的z平面上，其橫向平移距離由式(1)確定。B2和B3點處于同一z2平面，因此在探測面的位置關(guān)系與z2平面相同?；谏鲜鰝鞑ヌ攸c可知，經(jīng)過艾里光束的彎曲傳播投影，其等效于人眼以某個側(cè)向角度觀察物空間點陣，如圖3(b)所示。

圖3 基于艾里光束自彎曲傳播的三維重建成像原理(a)、(b)與光路圖(c)，其中OL是物鏡，DM是二向色鏡，TL是筒鏡，F(xiàn)L是傅里葉變換透鏡。Fig.3 3D reconstruction imaging principle (a), (b) and set-up (c) based on the self-bending propagation of Airy beam. OL is objective lens, DM is dichroic mirror, TL is tube lens, FL is Fourier lens.

根據(jù)以上分析，我們提出，通過改變調(diào)制圖案，使艾里光束的彎曲方向旋轉(zhuǎn)一周，可以獲得物空間點陣不同方向的投影圖像，利用Tomography方法對各投影圖像進行分析與融合，能夠重建物場的三維信息。據(jù)此，我們設(shè)計并實現(xiàn)了艾里光束三維重建顯微鏡，其光路如圖3(c)所示。該光路基于倒置熒光顯微鏡Nikon Eclipse Ti-U平臺搭建，采用熒光激發(fā)模式，激發(fā)光源為473，561，647 nm的多波長激光器。在熒光成像面放置偏振片以匹配SLM(反射式，PLUTO-2-VIS-016, Holoeye)進行光束調(diào)制。一個4f系統(tǒng)將具有空間結(jié)構(gòu)信息的樣品光場轉(zhuǎn)換為艾里自彎曲傳播光場，其空間三維分布被傾斜投影至電荷耦合器件(Charge Coupled Device,CCD)面接收。SLM和CCD (Zyla 4.2, Andor) 經(jīng)電腦連接，由自編程序控制在改變SLM調(diào)制圖案時實現(xiàn)CCD的同步接收。旋轉(zhuǎn)空間光調(diào)制器的圖案，可以在接收面得到不同投影角度的多幅二維圖像。而后利用自編重建算法，實現(xiàn)三維樣品的信息重構(gòu)。

2.3 基于成像性能提升的艾里光束PSF優(yōu)化

由于頻域調(diào)制產(chǎn)生的艾里光束橫截面的強度分布具有非對稱性，一方面我們采用如圖2所示的方法壓縮PSF旁瓣，另一方面，我們也采用了函數(shù)去卷積方法進一步壓縮PSF。如圖4所示，構(gòu)建了不同方向基于實驗測量的去卷積函數(shù)。經(jīng)過各投影方向的去卷積處理，提高成像分辨率。

圖4 不同方向的去卷積函數(shù)Fig.4 Deconvolution function for various direction

此外，采用在調(diào)制圖案中疊加菲涅爾衍射相位的手段，將成像焦面向軸向的一個方向平移，從而擴大另一方向的成像景深。該方法使成像深度相對于傳統(tǒng)高斯成像深度提高了5倍以上[12]。

2.4 三維重建算法設(shè)計

為了準(zhǔn)確再現(xiàn)目標(biāo)三維信息，根據(jù)艾里光束三維重建原理，本文基于Tomography基本原理設(shè)計了三維重建算法，如圖5所示。

圖5 艾里光束三維重建算法示意圖Fig.5 Schematic diagram of 3D reconstruction algorithm for Airy beam

重建過程大體分為3個步驟，第一個步驟根據(jù)拉東變換由CCD面的圖像坐標(biāo)(xc,yc,zc)(圖5(a)，其中zc=0)獲得等效直線斜入射的正向投影坐標(biāo)(x┴,y┴,z┴)(圖5(b))，滿足如下變換關(guān)系：

(2)

式中，φ是CCD面相鄰兩幅投影圖的旋轉(zhuǎn)角度，θ是等效傾斜角度，見圖3(b)。實驗中，若選擇等間隔的9幅投影圖進行重建，則φ=40°。針對于確定的φ和θ，其平面坐標(biāo)分布滿足如下積分：

(3)

第二個步驟根據(jù)光束逆向追跡方法，由最大似然估計算法重建物面三維坐標(biāo)(xT,yT,zT)。

第三個步驟根據(jù)艾里光束傳播理論進行坐標(biāo)矯正，見圖5(c)。假定與樣品坐標(biāo)(x,y,z)滿足物象關(guān)系的艾里光束空間坐標(biāo)為(x′,y′,z′)，則艾里光束橫向平移距離Δl′與傳播距離z′滿足式(1)，且(x,y)=(x′,y′)/M,z=z′/M2。因此得到準(zhǔn)確的樣品坐標(biāo)(x,y,z)與重建物面坐標(biāo)(xT,yT,zT)的關(guān)系為：

(4)

(5)

(6)

3 實驗與結(jié)果

3.1 三維重建的分辨率研究

利用艾里光束三維成像顯微鏡，我們開展了納米粒子的三維重建實驗，采用40×/0.75 NA的物鏡測量了顯微鏡的成像分辨率。實驗中使用了平均直徑為200 nm的熒光納米粒子，采用647 nm波段的光源激發(fā)，熒光發(fā)射中心波段為680 nm，圖6是單粒子經(jīng)過Tomography算法重建后的圖像。我們測量了粒子的三維強度分布，通過高斯函數(shù)擬合得到了X,Y,Z三個維度的半高全寬，經(jīng)分析，該顯微系統(tǒng)的X方向分辨率約為0.5 μm，Y方向分辨率約為0.6 μm，Z方向分辨率約為1.5 μm。根據(jù)實驗參數(shù)計算，X方向的分辨率接近衍射極限(～0.45 μm)。Y方向的分辨率高于X方向，是由于閃耀光柵在Y方向分光的光斑拉伸導(dǎo)致。Z方向的分辨率超越衍射極限(～2.5 μm)。

圖6 單粒子重建(a)與分辨率測量(b)Fig.6 Reconstruction for single bead (a) and resolution measurement (b)

3.2 投影幅數(shù)對成像分辨率的影響

我們研究了一周的不同投影數(shù)對三維重建成像分辨率的影響。以等角間隔的方式，分別對一周6幅投影圖(旋轉(zhuǎn)角間隔為60°)、9幅投影圖(旋轉(zhuǎn)角間隔為40°)、12幅投影圖(旋轉(zhuǎn)角間隔為30°)、18幅投影圖(旋轉(zhuǎn)角間隔為20°)、36幅投影圖(旋轉(zhuǎn)角間隔為10°)進行了單粒子重建，得到圖7的實驗結(jié)果。該結(jié)果表明：不同投影幅數(shù)對重建圖像分辨率的影響很小，可以忽略。根據(jù)再現(xiàn)圖像質(zhì)量分析，投影幅數(shù)越多，重建圖像的點密度越高，因此圖像的保真度將更好，但投影圖像增多將影響成像速度。綜合考慮上述因素，我們選擇9幅投影圖作為艾里光束三維重建顯微成像的最優(yōu)方案。

圖7 不同投影幅數(shù)對重建像分辨率的影響Fig.7 Reconstruction resolution vs. projection numbers

3.3 生物細(xì)胞成像實驗

我們利用艾里光束三維重建顯微鏡開展小鼠腎細(xì)胞10 μm切片的成像實驗，見圖8。相對于傳統(tǒng)的Z掃描成像機制，艾里光束三維重建顯微鏡具有無掃描、高對比度的成像特點，以1 μm的間隔對腎小管的z向分布進行斷層成像，能夠清晰分辨小鼠腎管的結(jié)構(gòu)變化，見圖8(a)。

圖8 小鼠腎細(xì)胞的單色成像(a)與雙色成像(b)Fig.8 Imaging of single color (a) and two-color (b) for mouse kidney cell

我們也研究了該顯微鏡的雙色重建特性，分別比較了激發(fā)光波長561 nm和473 nm在深度z=4 μm處的傳統(tǒng)高斯光場成像和艾里光場成像，如圖8(b)所示，能夠看到兩種成像模式符合得很好，但艾里光場成像具有更高的信噪比。此外，根據(jù)式(1)分析了波長對重建坐標(biāo)位置的影響，并進行了坐標(biāo)校正，圖8(b)對兩個波長的艾里光場成像進行了融合。由于細(xì)胞不同位置的熒光染料標(biāo)定不同，通過不同波長激發(fā)將獲得更為豐富的結(jié)構(gòu)信息，為深入理解細(xì)胞結(jié)構(gòu)提供了一種有效手段。

4 結(jié) 論

以空間光調(diào)制器為核心器件，采用頻域調(diào)制手段產(chǎn)生了艾里自彎曲光束。該光束的傳播距離、彎曲方向和彎曲角度可通過頻域調(diào)制圖案調(diào)控，具有無衍射、自修復(fù)等適用于高分辨顯微成像的獨特性質(zhì)。以調(diào)控艾里光束產(chǎn)生不同角度的自彎曲投影圖像為核心思想，我們設(shè)計并實現(xiàn)了艾里光束三維重建顯微鏡，通過對點擴散函數(shù)的優(yōu)化，實現(xiàn)了高分辨率的三維顯微成像，在40×/0.75 NA物鏡下實現(xiàn)了橫向分辨率約為0.5 μm，軸向分辨率約為1.5 μm。小鼠腎細(xì)胞的實驗研究證明了艾里光束三維重建顯微鏡相對于傳統(tǒng)Z掃描三維成像具有無需機械掃描、成像深度可達(dá)10 μm以上、具有更高信噪比等優(yōu)勢，且適用于多色成像以更精準(zhǔn)地解析細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

據(jù)此分析，以9幅投影圖像作為最佳重建方案，使用動態(tài)刷新率為60 Hz的空間光調(diào)制器預(yù)計可實現(xiàn)6幅/s的三維重建速率，滿足一般的細(xì)胞動態(tài)觀測需求。艾里光束三維重建顯微鏡的成功實現(xiàn)也證明，基于空間光調(diào)制器的光場調(diào)控技術(shù)應(yīng)用于光學(xué)成像領(lǐng)域，帶來了諸多新的研究問題，產(chǎn)生了新奇的研究結(jié)果，也將會為紅外、太赫茲等其他波段的成像研究帶來新的啟發(fā)。